Du microscope le "saut de puce" aux microarrays de la cytogénétique ARL 13 mars 2008 Dr Danielle Martinet Spéc. FAMH en analyses de génétique médicale Laboratoire de cytogénétique constitutionnelle Service de génétique médicale - CHUV
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La cytogénétique au quotidien l analyse des chromosomes au microscope Cytogénétique conventionnelle Métaphase Cytogénétique moléculaire FISH interphasique Caryotype FISH métaphasique
La nouvelle cytogénétique l analyse des chromosomes «sur puce à ADN / array CGH» àl ordinateur
le "saut de puce" de la cytogénétique 1000x 1000x ŒIL MICROSCOPE Microarrays puces àadn Détection résolution Mégabases qq millions de pb Kilobases (1000 pb)/ qq dizaines de pb
Rôle essentiel des anomalies chromosomiques constitutionnelles - Prénatal -dépistages 1 er et 2 ème tiers positifs -signes échographiques -anamnèse familiale - Postnatal -handicaps mentaux -syndromes malformatifs -échec de la reproduction
Type d analyses Indications Demandes d analyse : Bilan Dépistages Diagnostic PréNatal Infertilité Caryotype (7j - 15 j) Analyse des 46 chromosomes Résolution en Mb Signes cliniques évocateurs Syndrome de Prader-Willi Syndrome de Williams Syndrome de Di-George... FISH (24h - 72h) Analyse ciblée d une région particulière Sans signe clinique évocateur Retard du développement, Retard mental. Puces à ADN array-cgh (3j - 5 j) Analyse des variations du nombre de copies génomiques sur l entier du génome Résolution en kb
Particularités Matériel Villosités choriales Liquide Amniotique Fibroblastes Sang Lames paraffinées Spermatozoïdes microscope Culture cellulaire Extraction d ADN puces àadn Détection Aneuploïdies Délétions Duplications Inversions Translocations Détection Variations du nombre de copies génomiques Aneuploïdies Délétions Duplications Amplifications Détection résolution Mégabases millions de pb Kilobases 1000 pb à qq dizaines de pb
La cytogénétique au quotidien l analyse des chromosomes au microscope Stade interphase Stade métaphase Culture cellulaire 2 2 Division cellulaire 7 7 Analyse des Chromosomes Caryotype FISH Interprétation Résultat anormal: 46,XY,del(5)(p13p15.1) délétion hétérozygote sur un des chromosomes 5 entre..
Culture cellulaire mise en culture Fibroblastes Liquide amniotique Mise en culture suivi de la culture Changement de milieu
Division cellulaire Division cellulaire (Etuve à CO2) Observations Suivi de la culture Formation d un clone Présence de clones observation Clones cellulaires Liquide amniotique
Préparation chromosomique Température, humidité, Vent - bise. Colorations Analyse des Chromosomes microscope dessin Système d analyse ordinateur Interprétation Résultat anormal: présence d une translocation entre les chromosomes..
La cytogénétique au quotidien métaphase Exemple de caryotype normal: 46,XY caryotype 46,XY caryotype masculin normal
La cytogénétique au quotidien Exemple de caryotype anormal: trisomie 21 «Le Huitième jour, Georges et Harry» Pascal Duquenne et Daniel Auteuil. Actuellement - 50 000 personnes trisomiques en France - 400 000 en Europe, - 8 millions dans le monde. Risque T21: - 1/2000 naissances vers 20 ans - 1/400 vers 38 ans - 1/100 vers 40 ans 47,XX,+21 caryotype anormal, présence d une trisomie 21
La cytogénétique au quotidien Exemple de caryotype anormal: translocation entre les chromosomes 5 et 16 5 der(5) 5 der(5) 16 der(16) 16 der(16) 46,XY,t(5;16)(q35.3;q12.2) Résultat anormal
La cytogénétique au quotidien Limite de la cytogénétique Résultat normal : 46,XX par cytogénétique Cardiopathie, chromosome 22? FISH
La cytogénétique au quotidien Limite de la cytogénétique analyse CIBLEE par FISH Indication clinique: cardiopathie, fente labiopalatine, chromosome 22? Demande d analyse par FISH : Recherche de la microdélétion 22q11.2 (CATCH22) sonde CATCH Sonde contôle Résultat anormal par FISH Microdélétion 22q11.2 «CATCH 22» Anomalie compatible avec un Syndrome de DiGeorge hybridation in situ sur métaphase microdélétion 22q11.2 CATCH22 Cardiac Abnormal face Thymus Cleft palate Hypocalcemia Incidence: 1/5000 naissances http://www.orpha.net/
La cytogénétique au quotidien diagnostic prénatal rapide (24h) FISH INTERPHASIQUE Dépistage aneuploïdies des chromosomes 13, 18, 21, X et Y Sondes X / Y / 18 Sondes 13 / 21 Double Y Trisomie 13 13 13 Y Y 13 Trisomie 21 21 21 21
La nouvelle cytogénétique ŒIL 1000x MICROSCOPE 1000 x MICROARRAY Détection résolution Mégabases qq millions de pb Kilobases qq milliers de pb
ARRAY CGH - RESOLUTION RESOLUTION Cytogénétique classique 5 Mb = 5 000 000 pb = X 1000 Métaphase au microscope Puce à ADN ArrayCGH 5 Kb = 5000pb Weier, H.-U. G. J. Histochem. Cytochem. 2001;49:939-948 Hybridation génomique comparative (CGH)
CHROMOSOME ADN Polymère de bases désoxyribonucléotides = NUCLEOTIDES Gpe P + sucre + base base base pb= paire de bases
? Une puce Puce à ADN 1 spot = 1 sonde (1 FISH) Réseau de séquences d ADN sondes array CGH (puce à ADN) = petit segment d ADN simple brin de qq dizaines de nucléotides(nt) = Oligo NT RESOLUTION : en fonction du nombre de sondes 3600 spots (s/ensemble du génome) 1 sonde tous les 1Mb = 1 000 000 pb 36 000 spots (tilling path array) 1 sonde tous les 0,1 Mb= 100 000 pb 244 000 spots env. 1 sonde tous les 6 kb=6 000pb
Chromosome Puce. Chromosome 20 Position de pter 0 27 000 000pb 63 000 000pb pter qter A T T C C C G G A. T T C G G A G T T C C T C G G A G T C G G A G T T C G T T C C T C G G A G T >63 000 000pb Puce d oligont 244K Sur UNE puce L ensemble du génome du chr 1 au Chr Y «en séquences d oligonucléotides» tous les 6 kb
Particularités Matériel Villosités choriales Liquide Amniotique Fibroblastes Sang Lames paraffinées spermatozoïdes Culture cellulaire Extraction d ADN Détection Aneuploïdies Délétions Duplication Inversion Translocation microscope puce à ADN Détection de variations du nombre de copies génomiques Aneuploïdies Délétions Duplication Amplification Détection résolution Mégabases = millions de pb Kilobases = 1000 pb
CGH ARRAY Détection de variations du nombre de copies génomiques Marquage ADN ADN référence ADN patient Hybridation sur puce à ADN (CGH) Puce à ADN Lecture des fluorescences (scanner) Extraction des Rapports de fluorescence programme Feature Extraction perte Canal Cy3 Canal Cy5 gain Analyse des profils progamme CGH Analytics Définition du nombre de copies génomiques Interprétation Résultat anormal: perte/gain d hétérozygotie de 120 kb recouvrant le gène.
Etapes pratiques (rigueur +++) : Extraction d ADN Digestion enzymatique Marquage puriifcation Marquage Hybridation (CGH) Chambre d hybridation Extraction des données programme Feature Extraction Analyses des profils programme CGH analytics Analyse Interprétation Résultat : L'analyse de l'entier du génome par puce d'oligonucléotides àhaute résolution a mis en évidence la présence d une.
Analyse des profils Informations CGH analytics software nbre de copies 2 2 nbre de copies 2 1 nbre de copies 2 3 Rapport de fluorescence réf patient log ratio 0-1 + 0.58 noir vert rouge -1 +0.58 Log ratio 0 Rapport de fluorescence
Réflexion ŒIL 1000x MICROSCOPE 1000 x MICROARRAY INFORMATIONS ++++ CNV = Copy Number Variation Variations du nombre de copies génomiques Délétion, insertion, duplication <1kb à >1Mb
Réflexion DNA entre 2 humains : 99,9 % similitude Global variation in copy number in the human genome. Redon R et al., Nature. 2006 Nov 23;444(7118):444-54. Segmental duplications and copy-number variation in the human genome.sharp et al., Am J Hum Genet. 2005 Jul;77(1):78-88. Genome assembly comparison identifies structural variants in the human genome. Khaja R. et al., Nat Genet. 2006 Dec;38(12):1413-8,2006 Nov 22. Variations en nombre de copies (CNV) : 18.8% du génome (Database of Genomic Variants fév2008) Pinto et al., Human Molecular Genetics 2007, vol16, review htpp://projects.tcag.ca/variation - env 10% des gènes (2 900) varient en nbre de copies de séquences d ADN - 285 sur les 2 900 sont déjà connus pour être associés à des maladies (OMIM) - conduirait à une susceptibilité àcertaines maladies complexes ex. HIV infection, schizophreny, age- related malcular degeneration, Crohns Disease ) Ces résultats pourraient changer la recherche sur les maladies génétiques «We are just seing the tip of the iceberg»
Réflexion - Conclusion Détection de variations du nombre de copies génomiques retrouvées dans la population générale Implications? Technique de pointe mise à disposition des cliniciens et des chercheurs Nouvelle analyse diagnostique: le caryotype moléculaire Détection d anomalies chromosomiques cryptiques - voir 1000x plus -
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