Organisation du génome pendant l interphase 1
Euchr Hétérochr Nucléole Hétérochr Euchr Basic Histology, 9e édition
T Cremer, 1993
FISH interphasique Y Z X Y X
FISH interphasique Y Z X Y X
Microscopie confocale
FISH 3D Z-stack
FISH 3D : préparation des échantillons
WCP 1 CB2
WCP 1 CB2
Notion de Territoires chromosomiques Rabl Comings
Positions relatives des territoires Poulet H Tanabe, 2002 13
A Bolzer 2006 FISH 24 couleurs Marquage combinatoire
A Bolzer 2006 FISH 24 couleurs Marquage combinatoire Position stable d un chromosome au sein du noyau Voisins variables En fonction des types cellulaires Variable pour un même type cellulaire Association préférentielle avec hétérologues
A Bolzer 2006 FISH 24 couleurs Marquage combinatoire Position stable d un chromosome au sein du noyau Voisins variables En fonction des types cellulaires Variable pour un même type cellulaire Association préférentielle avec hétérologues Fréquence particulière de certaines associations -> implication en pathologie? Acrocentriques et Nucléole; Translocations robertsoniennes
Organisation des territoires en sous domaines S Dietzel, 1998 15 J Lemke, 2002
Organisation des territoires en sous domaines S Dietzel, 1998 15 J Lemke, 2002
Positions relatives des chromosomes Taille Richesse en gènes
Taille Petits au centre Grands en périphérie 17
J A Croft, 1999 Richesse en gènes Plus riches en gène au centre Plus pauvres en périphérie 18
Quel impact de l environnement nucléaire? 18 19 Fibroblaste Fibrosarcome Lignée lymphoblastoïde J Croft, 1999
20 Quel impact de l environnement nucléaire? KJ Meaburn et al., 2008 HSX dans hybride Homme/ souris MMUX dans fibro souris
20 Quel impact de l environnement nucléaire? KJ Meaburn et al., 2008 HSX dans hybride Homme/ souris MMUX dans fibro souris Plus forte homologie de séquence parmi les différents chromosomes Position HSX dans hybride et MMUX dans fibro souris -> pas de différence significative
Quel impact de l environnement nucléaire? KJ Meaburn et al., 2008 HSX dans hybride Homme/ souris HSX dans fibro humain MMUX dans fibro souris Plus forte homologie de séquence parmi les différents chromosomes Position HSX dans hybride et MMUX dans fibro souris -> pas de différence significative Position HSX dans fibro humain et MMUX dans fibro souris -> différence significative 20
Schéma des territoires dans le noyau Chaque territoire occupe un espace bien défini dans le noyau Délimité par un espace interchromatinien 21
Hypothèse alternative : MR Branco, 2006 Cryosections ultrafines (150nm) Meilleure Préservation de la structure de la chromatine Zone de recouvrement des territoires voisins 40% du territoire de chaque chromosome entrelacé avec un territoire voisin Proximité de la chromatine de deux chromosomes distincts (G) 22
Modèle CT-IC versus modèle ICN 23
Espaces interchromatiniens A Visser, 2000 24
Contenu des espaces interchromatiniens Chromatine : H2B - GFP
Contenu des espaces interchromatiniens Chromatine : H2B - GFP
Contenu des espaces interchromatiniens Chromatine : H2B - GFP Complexes ribo-nucléoprotéiques : anti SC-35
Contenu des espaces interchromatiniens Chromatine : H2B - GFP Chromatine : H2B - GFP Complexes ribo-nucléoprotéiques : anti SC-35 Complexes ribo-nucléoprotéiques : anti SC-35
Contenu des espaces interchromatiniens Chromatine : H2B - GFP Chromatine : H2B - GFP Complexes ribo-nucléoprotéiques : anti SC-35 Complexes ribo-nucléoprotéiques : anti SC-35 Les gènes actifs sont à proximité des domaines SC35 (sites de transcription) Shopland et al, 2003
HeLa: A-D -> BrUTP (sites de transcription), B - E -> H2B-GFP C - F -> superposition P J Verschure, 1999 Localisation des sites de transcription
HeLa: A-D -> BrUTP (sites de transcription), B - E -> H2B-GFP C - F -> superposition P J Verschure, 1999 Localisation des sites de transcription
Rôles de l espace interchromatinien 27 S A Gorski, 2006
Rôles de l espace interchromatinien Circulation des complexes enzymatiques et des protéines de liaison à l ADN Diffusion passive Fixation sur les cibles Turn over important 27 S A Gorski, 2006
Rôles de l espace interchromatinien Circulation des complexes enzymatiques et des protéines de liaison à l ADN Diffusion passive Fixation sur les cibles Turn over important Export des transcrits 27 S A Gorski, 2006
Rôles de l espace interchromatinien Circulation des complexes enzymatiques et des protéines de liaison à l ADN Diffusion passive Fixation sur les cibles Turn over important Export des transcrits Lieu de stockage des complexes ribo nucléoprotéiques Site de formation des sites de réplication et transcription 27 S A Gorski, 2006
Position des gènes dans les territoires Séquences transcrites Séquences inactives
Position des gènes dans les territoires Gènes actifs à la périphérie du territoire (Kurz et al. 1996) Séquences transcrites Séquences inactives
Analyse du locus WAGR (11p13) 11p13, RCN : actif 11p13, WT1 : inactif 11p15.4, D11S12 Lymphoblaste Fibroblaste 29 N L Mahy, 2002
Position des gènes dans les territoires Gènes actifs à la périphérie du territoire Gènes actifs au contact de l espace interchromatinien (Kurz et al. 1996) - Visser et al. 1998 - Mahy et al. 2002 Séquences transcrites Séquences inactives
Wcp 6 MHC II A B C E F : Fibroblaste D : Lymphoblaste Wcp 6 MHC II+III E V Volpi, 2000
Position des gènes dans les territoires Gènes actifs à la périphérie du territoire Gènes actifs au contact de l espace interchromatinien Gènes actifs à l extérieur du territoire (Kurz et al. 1996) - Visser et al. 1998 - Mahy et al. 2002 - Volpi et al. 2000 - Williams 2002 Séquences transcrites Séquences inactives
Position des gènes Position variable des gènes Au centre En périphérie En dehors Positions relatives Organisation des territoires Régions riches en gènes au centre des territoires Régions pauvres en périphérie, (membrane nucléaire, nucléole) Différence gène actif / Inactif Actif : à proximité des espaces interchromatiniens Inactifs à distance de ces espaces
Structure et Organisation des chromosomes pendant l interphase Structure de la fibre de chromatine Notion de territoires chromosomiques Organisation fonctionnelle du génome 34
La fibre de 30 nm Modèle en zig-zag 2 colonnes de nucléosomes Reliées par ADN linker droit Angle de 70 entre les deux colonnes PJJ Robinson, 2006 35 PJJ Robinson, 2006
Organisation de la Chromatine in vivo? Modèle Rosette 1 Mb Domaines 1 Mb Reliés entre eux par la fibre de chromatine Composés de rosettes 100 Kb Reliées entre elles par une zone d attachement aux protéines (MAR) T Cremer, 36 2001
Territoires formés de boucles d ADN Espace interchromatinien sépare les fibres de chromatine 37 La moitié du volume nucléaire est dépourvu de chromatine
Hétérochromatine en périphérie Basic Histology, 9e édition A Bolzer, 2005 Zones riches en Alu (riches en gènes) au centre du noyau. En périphérie, région pauvre en Alu (pauvre en gène) = hétérochromatine Rôle protecteur? 38
Zones d attachement des territoires Nucléoles Site de transcription des ARNr I Raška, 2006 F : Centre fibrillaire (gène ARNr inactifs, gènes actifs en périphérie) D : Composé fibrillaire dense (transcrits primaires, premières étapes de maturation) G : Composé granulaire (maturation des transcrits) Association des bras courts des acrocentriques 13, 14, 15, 21 et 22 Courtesy M Cremer 39
Liaison à la membrane nucléaire Kind et al, 2010 Myopathies EDMD (Emery-Dreifuss) Lipodystrophie FPLD (Dunningan partial familial lipodystrophy) Neuropathies CMT2 (Charcot Marie Tooth type 2) Progeria L Mounkes, 40
Modèles d organisation nucléaire 1- Compartiments pré-existants 2- Auto assemblage Lanctôt C et al, 2007
Modèles d organisation nucléaire T Misteli, 2007
Modèles d organisation nucléaire T Misteli, 2007
Zones d attachement des territoires Nucléoles Site de transcription des ARNr I Raška, 2006 F : Centre fibrillaire (gène ARNr inactifs, gènes actifs en périphérie) D : Composé fibrillaire dense (transcrits primaires, premières étapes de maturation) G : Composé granulaire (maturation des transcrits) Association des bras courts des acrocentriques 13, 14, 15, 21 et 22 Courtesy M Cremer 43
Roles de l espace interchromatinien Hbb-b1 Eraf Uros Igf2 Kcnq1ot1 Hba C S Osborne, 2004 T Cremer, 2006
Roles de l espace interchromatinien Hbb-b1 Eraf Uros Igf2 Kcnq1ot1 Hba C S Osborne, 2004 Mouvements des boucles pour associer les gènes à transcrire dans un même complexe de transcription - Gènes d une même région (élargie) - Gènes de territoires différents T Cremer, 2006
Mobilité de la chromatine dans le noyau 45
Extinction de fluorescence par laser Lignée cellulaire exprimant H2B CFP (Cyan Fluorescent Protein, fluorescence rouge) ET H2B YFP (Yellow Fluorescent Protein, vert) Extinction laser d un seul fluorochrome -> marquage différentiel D Gerlich, 2003
Existe-t-il une mobilité de la chromatine? D Gerlich, 2003
D Gerlich, 2003
D Gerlich, 2003 -> Stabilité globale de la chromatine pendant l interphase
Recherche de mouvements de faible amplitude (cellules transformées avec H2B-GFP) Walter et al (2003) J Cell Biol Figure géométrique créée en fin de phase S / Début G2 (Laser Argon) Observation pendant G2.
Recherche de mouvements de faible amplitude (cellules transformées avec H2B-GFP) Walter et al (2003) J Cell Biol Figure géométrique créée en fin de phase S / Début G2 (Laser Argon) Observation pendant G2. Le marquage est maintenu et accompagne les mouvements cellulaires
Recherche de mouvements de faible amplitude (cellules transformées avec H2B-GFP) Walter et al (2003) J Cell Biol Figure géométrique créée en fin de phase S / Début G2 (Laser Argon) Observation pendant G2. Le marquage est maintenu et accompagne les mouvements cellulaires -> stabilité de la chromatine pendant l interphase (mouvements inférieurs à 1 µm en moyenne)
Evolution des positions des territoires pendant l interphase J Croft et al, 1999 Contraintes stériques empêchent les mouvements des territoires les uns par rapport aux autres?
Absence de mobilité globale, mais réorganisation possible Adaptation fonctionnelle Animaux nocturnes Sensibilité maximale des bâtonnets Réorganisation spécifique Architecture nucléaire inversée Hétérochromatine au centre Euchromatine en périphérie Cônes Cel ganglionnaires Fibroblastes I Solovei, 2009 51
Différents modèles d organisation Réorganisation des territoires chromosomiques dans les bâtonnets Gènes actifs (Pdc + Rp1h + Rom1 + Rho ) Gènes inactifs (Lyzs + Hba-a1 + Krt1-1) Lamin B Gènes exprimés Gènes inactifs Relocalisation en périphérie du noyau Nucléoles Enrichissement en ARNm en facteurs de transcription I Solovei, 2009
Réorganisation dynamique pendant la différenciation Euchromatine (Bandes R), L1, Hétérochromatine (Bandes G),, Chromocentres (Satellite péricentromérique) Fin de la prolifération des progéniteurs Ouverture des des bâtonnets yeux Maturité sexuelle
light intensities Diminution de la diffraction conventional architecture inverted architecture
light intensities Lapin Souris Diminution de la diffraction conventional architecture inverted architecture
Mobilité des boucles d ADN
Repositionnement en périphérie du territoire des gènes du MHC lors de l activation de fibroblastes par l Interféron γ Pcp 6p MHC III E V Volpi, 2000
Repositionnement de gènes lors de l activation au cours d une différentiation cellulaire EDC : Epidermal Differentiation Complex Activation coordonnée lors de la différentiation des kératinocytes
Repositionnement de gènes lors de l activation au cours d une différentiation cellulaire EDC : Epidermal Differentiation Complex Activation coordonnée lors de la différentiation des kératinocytes RR Williams,
Remodelage du territoire au cours du développement embryonnaire Externalisation des signaux Hoxb1 et Hoxb9 corrélée à l activation successive des deux gènes S Chambeyron
Inactivation des gènes Rag et Tdt par repositionnement centromérique lors de l activation de LT CD4+, CD8+ par fixation du Récepteur T Rag, TdT Centromères IKAROS K E Brown, 1999 M Cockell,
Inactivation d un transgène par relocalisation péricentromérique C Francastel, 2000
Conclusion Cartographie du génome 61 Territoires chromosomiques Positionnement probabiliste Mobilité de la chromatine Pas de mobilité des territoires les uns par rapport aux autres en dehors des divisions Réorganisation possible de la chromatine sur plusieurs cycles Mobilité des boucles d ADN Organisation fonctionnelle Espaces interchromatiniens contiennent les protéines de liaison et les transcrits Organisation dynamique en fonction des besoins - Notion d usines transcriptionnelles
Synthèse : modèle globule fractal Boucles fonctionnelles E Lieberman-Aiden, 2009 62