Bases conceptuelles de tests de mutagénèse ou 1- PROBLÉMATIQUE de génotoxicité 2- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES LÉSIONS 2-1. Microlésions 2-2. Macro-lésions (mutations) 2-2-1. Aberrations chromosomiques 2-2-2. Cassures (micronoyaux) 3- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES MUTATIONS 3-1. Bactéries 3-2. Cellules eucaryotes 3-3. Souris transgéniques 4- CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
De l animal aux gènes Organismes Organes Tissus Cellules Noyau Gènes 2
Genotoxique MORT TESTS Mutagène Cancérogène NON- Genotoxique
EVALUATION DE LA CANCEROGENÈSE / MUTAGENÈSE
TESTS À LONG TERME CHEZ LES RONGEURS (cancérogènes) Rat Fisher 344, souris hybrides B6C3 F1 niveau basal tumeur foie poumon faible Pureté et homogénéité du composé à tester Voie administration Non soluble: nourriture 60% Intubation orale 27% Eau de boisson: 20 ml/jour/rat ou 5ml/jour/souris 2% Inhalation 5% Badigeonnage sur peau 3% Calculer DL50 Ensuite essai à fraction DL50: 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 3 doses sur 50 animaux des 2 sexes rat 24-30 mois, souris 18-24 mois
AVANTAGES ET LIMITES DES ESSAIS DE CANCÉROGENÈSE CHEZ LES RONGEURS
2- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES LÉSIONS 2-1. Microlésions Adduits chimie, biochimie, immunologie, UDS Cassures biologie cellulaire (comètes), biochimie 2-2. Macro-lésions(mutations) 3-2-1. Aberrations chromosomiques 3-2-2. Cassures (micronoyaux)
Synthèse non programmée d ADN (UDS) 3 H thymidine Cellules en phase G0 Pas d incorporation de 3 H thymidine dans l ADN 3 H thymidine Cellules en phase G0 Incorporation de 3 H thymidine dans l ADN réparation GENOTOXIQUE
Obtenir des cellules en G0 Bloquer en G0 des cellules proliférantes (lignée: HeLa) Utiliser des cellules ne se divisant pas (ex vivo: hépatocytes) Isoler l ADN Mesurer l incorporation de thymidine Comptage de radioactivité Autoradiographie
Synthèse non programmée d ADN in vitro (UDS) hépatocytes 3 H thymidine ( 4 heures) rat Perfusion du foie Par la collagénase Produit à étudier Fixation lamelle sur lame Incubation 18-20h coloration Autoradiographie Film + 10-14j +4 C Puis révélation Examen microscopique Analyse d image négatif positif
Synthèse non programmée d ADN in vivo (UDS) hépatocytes 3 H thymidine ( 4 heures) traitement Perfusion du foie Par la collagénase Fixation lamelle sur lame Incubation 18-20h coloration Autoradiographie Film + 10-14j +4 C Puis révélation Examen microscopique Analyse d image négatif positif
Réponse négative Réponse positive Cellule en phase S
2- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES GENOTOXIQUES 2-1. Microlésions Adduits Chimie, Biochimie, Immunologie, UDS Cassures biochimie biologie cellulaire : essai des comètes 2-2. Macro-lésions(mutations) 3-2-1. Aberrations chromosomiques 3-2-2. Cassures (micronoyaux)
Couche cellulaire (agarose à BPF 0,5 %) Dernière couche (agarose à BPF 0,5 %) TEST DES COMETES Première couche (agarose à PFN 0,8 %) Pré-couche ( agarose à PFN 1,5 %) INTEGRATION DANS UN GEL D AGAROSE Cellules isolées Test de viabilité Lame TRAVAIL EN ABSENCE DE LUMIERE NATURELLE -LYSE ph 10 -DENATURATION DE L ADN - MIGRATION ELECTROPHORETIQUE ph >13 NEUTRALISATION en tampon TRIS ph 7,5 Addition iodure de propidium OBSERVATION DE LA FRAGMENTATION DE L ADN EN MICROSCOPIE A FLUORESCENCE QUANTIFICATION DE LA FRAGMENTATION PAR ANALYSE D IMAGES
tête queue Intensité de fluorescence Longueur de la queue Moment Caudal = % fluorescence dans la queue x longueur de la queue
Génotoxicité du B[a]P sur des cellules observées au microscope à fluorescence, précédemment soumises au test des comètes Cellules non traitées (X400) Cellules traitées par 50µM de B[a]P (X400) Cellules traitées par 100 µm de B[a]P (X400)
LA PHOSPORYLATION DE H 2 AX, MARQUEUR DE DÉTECTION DES CASSURES DOUBLE-BRIN Ionizing radiations Radiomimetics Apoptosis AA8 V3 DSBs UT γ H2AX 2 h/1 Gy Accumulation of signalling proteins 24 h/1 Gy from S. P. Jackson, 2003 Foci formation detected by immunofluorescence S. Bouquet et al. Cell Cycle 2006
2- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES GENOTOXIQUES 2-1. Microlésions Adduits biochimie, chimie, immunologie, UDS Cassures biologie cellulaire (comètes), biochimie 2-2. Macrolésions 2-2-1. Aberrations chromosomiques 2-2-2. Cassures (micronoyaux)
ANALYSE DE METAPHASES Utilise les méthodes cytogénétiques Cellules en division cellulaire Addition poison de fuseau Blocage des cellules en mitose Examen microscopique des chromosomes
Cassure break - deletion Break de chromatide Chromosome minute Chromosome double minute Délétion interstitielle Break de chromosome
Translocation Échanges triradial tétraradial dicentrique Inversions péri-centriques Échanges multiples Anneaux
28
Yet, the karyotypes of cancers are very abnormal Karyotype of a human colon cancer: Highly aneuploid, with 15 rearranged marker chromosomes Karyotype of a diploid human cell (male) 30
2- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES GENOTOXIQUES 2-1. Microlésions Adduits biochimie, chimie, immunologie, UDS Cassures biologie cellulaire (comètes), biochimie 2-2. Macrolésions 2-2-1. Aberrations chromosomiques 2-2-2. Cassures (micronoyaux)
TEST DU MICRONOYAU IN VITRO interphase Métaphase Anaphase Cytochinèse En présence de cytochalasine B interphase Métaphase Anaphase Cytochinèse Blocage en Cytochinèse
Cytotoxique Génotoxique Effet du traitement par un Cytotoxique Génotoxique G0 G1,S,G2 Apoptose Formation de micronoyaux Nécrose
CELLULES BINUCLÉÉES
CELLULES BINUCLÉÉES MICRONUCLÉÉES
Micronucleus induit par un clastogène Micronucleus - Petit - FISH négatif Micronucleus induit par un aneugène Micronucleus - Gros - FISH positif sondes pencentromériques
STRATÉGIES D ÉVALUATION DES CANCÉROGÈNES 3- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES MUTATIONS 3-1. Bactéries: test de AMES 3-2. Cellules eucaryotes 3-3. Souris transgéniques
RELATION MUTAGÉNÈSE-CANCÉROGENÈSE TEST d AMES
TEST D'AMES 1971 : Première description du modèle par Bruce Ames : "The detection of chemical mutagens with enteric bacteria" 1973 : Amélioration de la technique : utilisation du système d'activation métabolique décrit par Malling (1971) et Slater (1971). 1975 : Première corrélation mutagène / cancérogenèse : 158 cancérogènes 135 Ames positifs = 85 % 106 non cancérogènes < 10 % sont Ames positifs 1976 : Début de validation internationale Première description du modèle sur E. coli par Green et Muriel 1981 : Corrélation mutagénèse / cancérogénèse tombe à 83 % Années 90 : La corrélation est de ~ 60 %
TEST DE MUTATIONS REVERSES SUR BACTERIES : PRINCIPE Bactéries mutées (auxotrophes) Bactéries révertantes (prototrophes) Salmonella typhimurium Histidine - Histidine + Escherichia coli Tryptophane - Tryptophane + Méthode sensible simple rapide peu coûteuse
Les souches Salmonella typhimurium : 7 souches principales dérivant de la souche LT2 TA1535 TA1537 TA1538 TA97 TA98 TA100 TA102 Escherichia coli : 3 souches principales dérivant de la souche E. coli B WP2 uvra WP2 uvra pkm101 WP2 pkm101 Lors de leur construction, les souches devaient remplir le cahier des charges suivant : - avoir un taux spontané de réversion relativement bas - donner des réponses optimales avec des mutagènes particuliers
Test d Ames Autres mutations mutation rfa Perte des lipopolysaccharides de paroi > augmentation de perméabilité mutation uvr B - sauf TA 102 Perte de réparation par excision resynthèse > augmentation de sensibilité plasmide pkm 101 TA 97, TA 98, TA 100, TA 102 Présence des gènes muca,b = réplication TLS > augmentation de sensibilité
Souches d Ames souches Gènes Mutations additionnelles Type de affectés réparation LPS plasmide mutation TA 1535 His G46 uvrb- rfa - substitution TA 1537 His C3076 uvrb- rfa - frameshift TA 1538 His D3052 uvrb- rfa - frameshift TA 97 His O1242 uvrb- rfa pkm 101 frameshift His D6610 TA 98 His D3052 uvrb- rfa pkm 101 frameshift TA 100 His G46 uvrb- rfa pkm 101 substitution TA 102 His G428 + rfa pkm 101 (paq 1) substitution
Test d Ames Avantages 1. Met en évidence mutations par substitution de paires de bases et frameshift 2. Rapide et peu coûteux 3. Base de données importante 4. Bien standardisé (ligne directrice) 5. Largement disponible 6. Utilise peu de produit Limites 1. Utilise un système exogène d activation métabolique 3. Système procaryote extrapolation à l homme? 4. Mutations trop ciblées?
STRATÉGIES D ÉVALUATION DES CANCÉROGÈNES 3- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES MUTATIONS 3-1. Bactéries: test de AMES 3-2. Cellules eucaryotes: tests HPRT, TK 3-3. Souris transgéniques
Les principaux modèles étudiés Selon les lignées, les gènes mutés sont : Soit sur le chromosome X Soit sur un chromosome autosomal (gène hémi ou hétérozygote selon les lignées) codent pour les enzymes non essentielles ("salvage enzymes ), impliquées dans la synthèse des acides nucléiques sélection des mutants par analogue toxique de précurseur de bases nucléiques.
Les principaux modèles étudiés Détection des mutants au locus HPRT: Shéma simplifié HPRT Hypoxanthine IMP HPRT Guanine GMP 6-TGMP 6-thioguanine GDP dgdp dgtp ADN - Situé sur le bras long du chromosome X "hémizygote" CHO = XX, X inactivé à hémizygotie fonctionnelle V79 = XY à hémizygotie vraie Cellules de départ: HPRT + donc sensibles à la thioguanine Cellules mutées: HPRT - donc résistantes à la thioguanine (pas de 6-TGMP)
Les principaux gènes étudiés Détection des mutants au locus TK: Shéma simplifié voie endogène dutp dump thymidilate synthase Thymidine TK dtmp TFTMP TriFluoroThymidine dtdp - dttp ADN Cellules de départ: TK+ donc colonies TFT sensibles Cellules mutées: TK- donc colonies TFT résistantes (grandes ou petites)
STRATÉGIES D ÉVALUATION DES CANCÉROGÈNES 3- TESTS À COURT TERME : DÉTECTION DES MUTATIONS 3-1. Bactéries: test de AMES 3-2. Cellules eucaryotes 3-3. Souris transgéniques
lacz «Mutamouse» Souris transgéniques
Souris transgéniques laci «Big Blue»
4- CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Trier un petit nombre de molécules Tests devant être Largement disponibles Faciles à réaliser Réglementaires : guidelines validées
Tests théoriquement disponibles Mutation génique Mutation Chromosomique Lésions Primaires ADN Procaryotes Ames SOS chromotest Eucaryotes In vitro Mutations géniques sur cellules de mammifères Tests levures Drosophiles Aberrations Chromosomiques Micronucleus Tests levures UDS 32 P post marquage SCE Tests comètes Eucaryotes In vivo Specific locus test Souris transgéniques Aberrations Chromosomiques Micronucleus UDS 32 P post marquage SCE Tests comètes
Tests validés Mutation génique Mutation Chromosomique Lésions Primaires ADN Procaryotes Ames SOS chromotest Eucaryotes Mutation géniques Aberrations UDS In vitro sur cellules de mammifères Chromosomiques Micronucleus 32 P post marquage SCE Tests comètes Eucaryotes Aberrations UDS In vivo Souris transgeniques Chromosomiques Micronucleus 32 P post marquage SCE Tests comètes
Tests faciles à réaliser et disponibles Mutation Mutation Lésions génique Chromosomique Primaires ADN Procaryotes Ames Eucaryotes Mutations géniques Aberrations UDS In vitro sur cellules de mammifères Chromosomiques Micronucleus 32 P post marquage SCE Tests comètes Eucaryotes Aberrations UDS In vivo Souris transgéniques Chromosomiques Micronucleus 32 P post marquage SCE
Première étape : 2 options 2 tests in vitro 1 test in vitro 1 test in vivo - test d Ames - aberrations Chrom. in vitro ou MLA/tk - test d Ames - micronucleus in vivo Avantages - pas de test in vivo (éthique) - 2 sensitive tests - en accord avec ICH M3 Limites - pas de test in vivo - pas de test spécifique - négatif pour les aneugènes Avantages - 1 tests in vivo/ in vitro - 1 test sensible - 1 test spécifique - sensible aux aneugènes Limites - usage animaux précoce
Décision après la première étape Ames Micronucleus In vitro Décision - + + + STOP - - Confirmation + - et/ou explication
CONFÉRENCE D HARMONISATION SUR LA BATTERIE REQUISE POUR LE MÉDICAMENT (ANSM) UN TEST DE MUTATION GÉNIQUE SUR BACTÉRIE (Ames) UN TEST IN VITRO DE DOMMAGE CHROMOSOMIQUE SUR CELLULE DE MAMMIFÈRE OU UN TEST IN VITRO DU LYMPHOME DE SOURIS UN TEST IN VIVO DE DOMMAGE CHROMOSOMIQUE SUR CELLULES HÉMATOPOÏÉTIQUE DE RONGEURS
Place de la mutagenèse dans le développement des médicaments 1. Avant l autorisation de mise sur le marché Criblage primaire Évaluation du risque pour l homme Qualité : éliminer les impuretés mutagènes Sécurité : interprétation des études de cancérogenèse 2. Après la mise sur le marché Qualité : Nouveau procédé Nouvelle voie de synthèse
CONCLUSION 1. La mutagenèse a une place clef dans le développement du médicament 2. Mise en place précoce 3. Utilisation en qualité et en sécurité 4. Utilisation sur le plan mécanistique 5. Mutagenèse et seuil