ALLwell Elution Technologies Fish (Parvalbumin) Proteins

ALLwell Elution Technologies Fish (Parvalbumin) Proteins Elisa kit Cat. # ETE-75FSH Kit pour la détection du poisson (parvalbumine) dans les échantillons alimentaires Mode d emploi Lire attentivement les instructions avant de procéder à l utilisation du kit Via San Geminiano, 4 41030 San Prospero (MO)- Italy (: +39 059 8637161 : +39 059 7353024 *: laboratorio@generon.it : www.generon.fr [1] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017

1 Principe du test et son utilisation Le test se base sur la technique ELISA, utilisant la méthode du double anticorps conjugué avec un enzyme pour la détection immunoenzymatique de l analyte d intérêt. La technique est rapidement décrite ci-dessous. L anticorps qui reconnait spécifiquement les protéines du poisson est fixé aux puits de la plaque ELISA. L ajoute de l'échantillon dans les puits de la plaque permet à l anticorps monoclonale de se lier à la protéine d intérêt; après une phase de lavage on ajoute un deuxième anticorps spécifique pour la protéine d intérêt conjugué avec une peroxydase. Ce anticorps se lie à la protéine cible, et à travers l utilisation de la peroxydase et du substrat TMB (3,3',5,5'-tetrametylbenzidine) se développe la réaction colorimétrique. Le virement de la couleur après l ajoute du substrat TMB indique la concentration de la protéine. Le contenu de protéine des échantillons est déterminé à travers la comparaison avec la courbe standard construite avec l utilisation d étalons fournis avec le kit. Le test d analyse sandwich ELISA est hautement sensible pour la détection des protéines du poisson dans les aliments cuits et crus. Attention: les matrices alimentaires peuvent être extrêmement modifiées après le combinaison des additifs et après certains procédés industriels qui peuvent influencer l analyse des protéines. Pour l analyse sur d autres types de matrices non déclarés expressément dans le protocole consulter les techniciens Generon (www.generon.it email: laboratorio@generon.it). Le test est seulement à fin de recherche, pas à fin diagnostic, seulement pour utilisation in vitro. Des résultats fiables et reproductibles sont obtenus quand la procédure d analyse est effectuée après avoir compris toutes les informations contenues dans le manuel et en suivant les bonnes pratiques de laboratoire. Des facteurs qui peuvent influencer le résultat final du test sont l adéquation de l'instrument utilisé, la nettoyage de la verrerie, la qualité de l eau distillée ou déionisée, la précision dans les opérations de prélèvement des régents et des échantillons, les techniques de lavage, le temps d incubation ou la température. Ne pas mélanger entre eux des réactifs provenant de différents lots ou sources. Les résultats des tests ne sont pas applicables à des portions non testées de l échantillon. [2] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017

2 Contenu du Kit La date d expiration du kit et de ses composants est indiquée sur l étiquette de la confection. Tous les composants sont stables jusqu à la date d expiration si conservés et utilisés en suivant les instructions reportées dans le manuel. Matériel Description Préparation Conservation Stabilité Plaque de microtitration ELISA (ELISA Micro Plate, antibody coated) Plaque de 96 puits avec anticorps fixé. Prête à l emploi. 4-8 C, dans un sachet d aluminium scellé avec desséchant. Suivant les correctes procédures de conservation jusqu à la date Anticorps avec enzyme (Enzyme Conjugated Detection Antibody) 1 flacon de 1.5 ml 10X d anticorps conjugué avec peroxydase de raifort (HRP) en solution. Diluer 1/10 avant l'utilisation pour préparer une solution de travail. 4-8 C à l obscurité. La solution 10X est stable jusqu à la date Étalon 1 flacon contenant l étalon concentré. Faire référence au certificat d analyse (CoA). 4-8 C. Ne pas congeler. Stable jusqu à la date Diluant concentré (Diluent Concentrate) 1 bouteille de 50 ml de solution 5X. Diluer 1/5 avant l utilisation pour préparer une nouvelle solution de travail. 4-8 C pour la solution de travail 1X et la solution du diluant 5X. La solution de travail 1X est stable pendant une semaine de la date de préparation. La solution 5X concentrée est stable jusqu à la date Solution de lavage (Wash Solution Concentrate) Solution d extraction concentrée (Extraction Buffer Concentrate) Solution chromogène (Chromogen-Substrate Solution) Solution bloquante (STOP Solution) Attention: éviter le contact avec la peau 1 bouteille de 50 ml de solution de lavage 20X. 1 bouteille de 120 ml de solution d extraction 4X. 1 bouteille de 12 ml de 3,3',5,5'- tétraméthylbenzidine (TMB) et peroxyde d hydrogène en tampon d acide citrique ph 3.3. 1 bouteille de 12 ml de 0.3 M d acide sulfurique. Diluer 1/20 avant l utilisation pour préparer une solution de travail. Diluer 1/4 avant l utilisation pour préparer une solution de travail. La solution de travail doit être préchauffée avant l'utilisation à 50-60 C. Prête à l emploi. 4-8 C pour la solution de travail 1X et la solution diluant 5X. 4-8 C. 4-8 C à l obscurité. Prête à l emploi. 4-8 C. La solution de travail 1X est stable pendant une semaine de la date de préparation. La solution 20X est stable jusqu à la date La solution de travail et la solution concentrée jusqu à la date Stable jusqu à la date Protéger de la lumière. Stable jusqu à la date Matériel demandé pour effectuer l analyse mais pas présent dans le kit: Micropipette (de 2 μl à 100 μl), spécimens, laveur de microplaques automatique, eau distillée ou déionisée, lecteur de plaques ELISA, verrerie pour la préparation de réactifs et solutions, minuterie, mixeur ou vortexeur, agitateur bain-marie, agitateur orbital, balance, centrifuge. [3] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017

3 Préparation de l échantillon 1. Les échantillons alimentaires doivent être extrait en utilisant la solution d extraction 1X (Extraction Buffer) préchauffée (50-60 C). Pour une correcte extraction il est nécessaire d obtenir un mélange homogénéisé de l échantillon. Les échantillons alimentaires solides doivent être broyés/concassés afin d obtenir une meilleure consistance et de favoriser l efficience de l extraction. Pour les échantillons alimentaires solides: préparer une dilution 1/10 de la solution d extraction (Extraction Buffer) préchauffée. Peser 0.5 grammes (± 4%) d échantillon bien broyé/concassé et ajouter 4.5 ml (± 2%) de la solution d extraction (Extraction Buffer) diluée et précédemment préchauffée. Mélanger avec agitateur (Vortex). Le rapport échantillon/solution d extraction (Extraction Buffer) est 1/9 (1 partie d échantillon et 9 volumes de solution d extraction - Extraction Buffer). Pour les échantillons liquides: préparer une dilution 1/10 de la solution d extraction (Extraction Buffer) réchauffée. Ajouter 0.5 ml (± 2%) de l échantillon liquide homogène à 4,5 ml (± 2%) de la solution d extraction (Extraction Buffer) diluée et précédemment chauffée. Le rapport échantillon/solution d extraction (Extraction Buffer) est 1/9 (1 partie d'échantillon et 9 volumes de solution d'extraction - Extraction Buffer). Eaux de lavage industriel (CIP - Clean in Place Solution): préparer une dilution 1/5 de la solution de dilution 1X (Diluent Buffer). Ajouter 1 ml de solution CIP en 4 ml de tampon diluant 1X. 2. Transférer les échantillons dans l agitateur à bain-marie pour 25 minutes à 50-60 C en agitation. En alternative laisser les échantillons à bain-marie pendant 25 minutes en agitant pour 1 minute chaque les 5 minutes. 3. Apres l extraction, centrifuger les échantillons pour favoriser la sédimentation des particules ou en alternative laisser reposer l échantillon pendant cinq minutes dans un porte-tubes. 4. Prélever 100 μl à partir de la couche intermédiaire de la solution contenant l échantillon dans une nouvelle spécimen et ajouter 900 μl de la solution de dilution précédemment diluée. Vortexer ou bien mélanger. La dilution finale de l échantillon à analyser est maintenant de 1/100. Substances qui inhibent la réaction enzymatique: l'anion azoture et le Thiomersal à des concentrations supérieures au 0.1%. La stabilité des échantillons n a pas été évaluée. [4] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017

4 Préparation des réactifs Porter tous les réactifs à température ambiante (20-25 C) avant l'utilisation. Solution diluant (Diluent Concentrate): la solution diluant est concentrée 5X et doit être diluée 1/5 avec eau distillée ou déionisée (1 partie de solution 5X, 4 parties de H 2 O). Solution de lavage concentrée (Wash Solution Concentrate): la solution de lavage est concentrée 20X et doit être diluée 1/20 avec eau distillée ou déionisée (1 partie de solution 20X, 19 parties de H 2 O). La formation de cristals dans le concentré peut se vérifier quand les températures de conservation sont baisses, en ce cas réchauffer la solution à 30-35 C avant l utilisation. Solution d extraction (Extraction Buffer Concentrate): la solution d extraction est concentrée 4X et doit être diluée 1/4 avec eau distillée ou déionisée. (1 partie de solution 4X, 3 parties de H 2 O). La solution diluée 1X doit être réchauffée à 50-60 C avant l utilisation. Anticorps lié avec l enzyme (Enzyme-Antibody Conjugate): déterminer la quantité nécessaire de solution de travail 1X pour effectuer l analyse. La solution est concentrée 10X et doit être diluée 1/10 (1 partie de solution 10X, 9 parties de diluant 1X) immédiatement avant l'utilisation. Diluer seulement ce qui est nécessaire. Mélanger soigneusement et éviter la formation de mousse. Plaque ELISA (Pre-coated ELISA Micro Plate): prête à l emploi. Ouvrir le sachet d aluminium et prélever la plaque du sachet, prélever les strips à ne pas utiliser et les remettre dans le sachet d aluminium. Étalon: préparer en suivant le certificat d analyse. [5] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017

5 Procédure pour l exécution du test On conseille d analyser étalons et échantillons en double. 1. Prélever 100 μl de: Standard 0 1X diluant (0.0 ng/ml) Standard 1 (10 ng/ml) Standard 2 (30 ng/ml) Standard 3 (90 ng/ml) Standard 4 (270 ng/ml) 2. Déposer 100 μl de l échantillon (en double) à l intérieur des puits choisis. 3. Incuber la plaque ELISA en agitant dans l agitateur orbital à 400 rpm, à température ambiante, pendant 30 ± 2 minutes. Maintenir la plaque couverte à l obscurité pendant l incubation. 4. Après l'incubation éliminer le contenu des puits. 5. Remplir complètement chaque puits (300 μl) avec la solution de lavage correctement diluée et aspirer. Répéter trois fois, pour un total de quatre lavages. Si le lavage est effectué manuellement: remplir complètement les puits avec le tampon de lavage, retourner la plaque donc verser le contenu dans un récipient pour déchets. Répéter 3 fois pour un total de quatre lavages. Pour éliminer complètement le liquide en excès à la fin des trois lavages utiliser du papier adsorbant sur lequel retourner la plaque. 6. Pipeter 100 μl de la solution contenant l anticorps lié avec l enzyme (Enzyme-Antibody Conjugate) dans chaque puits. Incuber sur un agitateur orbital à 400 rpm, à température ambiante, pendant 10 ± 2 minutes. Maintenir la plaque couverte à l obscurité pendant l incubation. 7. Laver et sécher les puits comme au point 5. 8. Pipeter 100 μl de Solution chromogène TMB (Chromogen-Substrate Solution) dans chaque puits. 9. Incuber en agitant (loin de la lumière directe du soleil ou UV) sur un agitateur orbital à 400 rpm à température ambiante exactement pendant 10 minutes. N.B. ne pas vider la plaque. 10. Après 10 minutes, ajouter 100 μl de solution bloquante dans chaque puit. 11. Déterminer l absorbance (450 nm) du contenu de chaque puits dans 30 minutes. Calibrer le lecteur des plaques sur la base des indications du constructeur. [6] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017

6 Elaboration des résultats 1. Soustraire la valeur du bruit de fond (valeur moyenne d absorbance relevée avec le standard zéro) des valeurs obtenues de l analyse pour chaque échantillon. 2. Calculer la moyenne des éventuelles lectures exécutées en double pour chaque standard et les utiliser pour construire une courbe standard. Construire la courbe standard en utilisant un logiciel capable de générer une courbe standard avec au moins quatre points. 3. Calculer la concentration de l échantillon à travers l interpolation avec la courbe standard. Le résultat est exprimé en ng/ml (ppb). Multiplier pour le facteur de dilution de l échantillon pour obtenir la concentration des échantillons originaires. Par exemple, si la dilution totale de l échantillon est 1/100 et la concentration de l échantillon obtenue à travers l interpolation avec la courbe standard est de 200 ng/ml (ppb), la concentration finale est de 200 ng/ml x 100 = 20.000 ng/ml (ppb) qui est 20 µg/ml (ppm). 4. Dans la figure suivante est illustrée une courbe standard à titre d exemple, à ne pas utiliser pour l éxécution du test. Pour chaque analyse il est nécessaire de dessiner une nouvelle courbe standard. Standard Concentration (ng/ml) Valeur de Densité Optique (OD) Calcul concentration (ng/ml) % Récupération 0 0 0.045 (-) 1 10 0.099 9.974 99.74 2 30 0.326 29.979 99.93 3 90 1.06 90.100 100.11 4 270 2.497 271.203 100.45 [7] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017

7 Sensibilité La limite de détection plus bas est 4.095 ng/ml. La limite de détection est déterminée en sommant trois déviations standards de la valeur moyenne de la densité optique de quarante-huit répliqués du standard zéro et en calculant ensuite la concentration correspondante. 8 Précision Précision intra test Moyenne %CV=2.852 N=12 Précision inter test Moyenne %CV=8.936 N=12 9 Spécificité et réactivité croisée Noix de Cajou <1% Bêta-lactoglobuline BLG <1% Coquille Saint-Jacques <1% Caséine bovine <1% Pois chiches <1% Extrait de pois <1% Haricot de Lima <1% Farine de cacahuètes <1% Farine de sarrasin <1% Farine de mais <1% Farine d amande <1% Farine de noix de coco <1% Farine de pistache <1% Farine de soja <1% Farine de sorgho <1% Crevette <1% Lait bovin <1% Lait d amande <1% Lait de noix de coco <1% Lait de soja <1% Noisette <1% Noix <1% Noix du Brésil <1% Noix de Macadamia <1% Noix de Pecan <1% Ovomucoïde (+) Parvalbumine de poisson <1% Pignon de pin <1% Céleri <1% Graines de tournesol <1% Graines de moutarde <1% Graines de sésame <1% Graines de citrouille <1% [8] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017

10 Déclaration de non responsabilité Generon S.p.A. décline toute responsabilité, explicite ou implicite, sauf garantir la qualité standard des matériaux qui composent ses produites. En cas de matériel défectueux, Generon S.p.A. s'engage à fournir un produit de remplacement. Generon S.p.A. n est pas tenue de répondre pour tout dommage, y inclus dommages spéciaux ou consécutifs ou dépenses qui dérivent directement ou indirectement de l utilisation de ce produit. L acheteur peut doubler ce document, en totalité ou en partie, seulement pour des fins internes, à condition que le présent avis soit indiqué dans toutes les copies. Dans la duplication l acheteur s engage à prendre toute mesure raisonnable pour empêcher l utilisation non autorisée et la distribution des informations sur la propriété. Ce manuel constitue simplement la traduction en langue française du manuel en langue originale contenu dans le kit. [9] Mode d emploi ALLwell Fish Proteins ELISA Kit - Rev. 1 27/04/2017