PRODUCTION DE PROTÉINES RECOMBINANTES À USAGE THÉRAPEUTIQUE Exemples de système d expression : Production de protéines purifiées. Quantité (Q) de protéines en fonction des applications : L obtention de protéines peut être réalisée : o Par purification de la protéine à partir de la cellule ou du tissu d origine. Application o Par expression hétérologue dans une cellule (ou un organisme) hôte en utilisant un système d expression. o Par traduction in vitro dans un système acellulaire (lysat cellulaire, lysat de réticulocytes ou lysat bactérien). 1.Protéines recombinantes à usage thérapeutique. Différents types de protéines recombinantes. Q de protéine purifiée Analyse de la fonction µg Production d anticorps Analyse de la structure d une protéine Diagnostique ou thérapeutique Industrielle 1.1. Protéines recombinantes en remplacement de protéines de source animale ou humaine. 1.2.Protéines recombinantes issues directement de la biotechnologie. mg >100mg g Kg à tonnes Protéine Insuline Hormone de croissance Albumine Facteur VIII Origine Pancréas Hypophyse de cadavre Sang humain Sang humain Erythropoïétine (EPO) Activateur tissulaire du plasminogène (tpa) Interféron 1/9
1.3.Vaccins recombinants Enveloppe protéique de la capside de virus de l hépatite B. Protéine L1 du papillomavirus : Gardesi I (HPV 6, 11, 16, 18) Merck, Sanofi Pasteur, Cervarix GlaxoSmithKlein 1.4.Anticorps monoclonaux Premier : monoclonal anti-vegf Le Bevacizumab se lie au VEGF et prévient son action sur les récepteurs endothéliaux (VEGFR), d où une baisse de la vascularisation tumorale et un effet anticancéreux. Bevacizumab : AVASTIN approuvé par FDA, comme permettant une survie prolongée de 30% pour les cancers colorectaux. Autre exemple : Hercepline : traitement du cancer du sein Her+. Toutes les protéines ne peuvent être produites dans la même cellule hôte. Pour chaque protéine, nécessité de choisir le couple vecteur/cellule hôte permettant de produire la protéine recombinante active au meilleur prix. Choix de la cellule dépend de l objectif et des propriétés de la protéine. 2.Les différentes cellules hôtes. 2.1.Les cellules Le meilleur système est le plus simple, donnant l activité biologique recherchée au moindre coût. 1.2.Avantages et inconvénients Coût et facilité de mise en œuvre, mais aussi : Cf tableau dans poly. Difficultés supplémentaires 2/9
Temps de division : augmente avec la taille. Les cellules animales nécessitent des conditions d asepsie très strictes. Adhésion obligatoire : Certaines lignées de cellules de mammifères nécessitent un support pour être viables. Cela : pose un problème de mise à l échelle les rends particulièrement susceptibles au cisaillement. Exemple : tapis cellulaire de myoblastes Culture sur microporteurs. 3.Les étapes de production d une protéine recombinante. 4.Exemples 1. Création d une lignée de cellules qui vont effectivement produire la protéine désirée. 2. Optimisation du rendement Rendement : quantité de protéines fabriquée par litre de fermenteur et par cycle de fabrication (un bioréacteur de 20000L peut réaliser 20 cycles/an). Rendement de l ordre de 1,5 à 2 g/l/cycle ; les meilleurs espoirs s orientent vers 5 g/l. 3. Purification de la protéine, éliminant toute trace de cellules productrices, de virus, de produits de dégradation de la protéine, de milieu de culture. 4. Production d abord en lots pilotes, puis dans les conditions de BPF (bonnes pratiques de fabrication). La construction et la mise en état d un bioréacteur pour une protéine médicamenteuse commercialisée prennent plusieurs années. La décision de mise en construction est prise vers le milieu de la phase III. Entre cette décision et la production de lots validés, 30 à 42 mois s écoulent. 1.1.Utilisation de cellules simples : E. coli et levures. 1.1.1.Hormones de croissance : hgh = somatotropine. Produites par les cellules somatotropes de l hypophyse. Précurseurs produits dans la glande pituitaire antérieure Transcription du gène hgh-n Chr 17q Maturation et sécrétion dans la circulation générale Induit la production de somatomédines = facteurs de croissance «insulin-like» qui stimulent la prolifération de tissus mésodermiques : cartilage, os, muscles. Formes circulantes : 70% sous la forme d une protéine de 22 kda 191 aa, 2 ponts disulfures 10% : protéine de 20 kda splicing alternatif (exon 3) 20% sous forme de dimère. 3/9
Utilisation : Traitement du nanisme hypophysaire. 1.1.2.Production de la protéine recombinante 2 méthodes de production de la protéine recombinante Protéine maturée : 191 aa, 2 ponts disulfures. Production dans la cellule bactérienne : production cytoplasmique. Criblage d une banque d ADNc 4/9
Sécrétion de la protéine. Production de quantités illimitées, coût faible Spécialités : HUMATROPE Lilly SEROSTIM Soreno 1.1.3.Production de vaccins recombinants Principe de la vaccination classique Injection de microorganismes Stimulation du système immunitaire (lymphos B ou T) Destruction de l agent infectieux Vaccins recombinants Vaccins sous unitaires contenant la protéine de surface (Ag). Premier vaccin recombinant : virus de l hépatite B (HBV) utilisation de l4antigènes de surface HB-sAg. Production dans la levure (S. cerevisiae) 50-100mg/L de culture Spécialités : Engerix GSK Recombivax HB Hbvaxpro Sanofi Genhevax 4.1.4.Production de vaccins recombinants Premier médicament issu des biotechnologies approuvées par FDA. L insuline est synthétisée dans les îlots de Langerhans des cellules pancréatiques. Elle est constituée d une chaîne polypeptidique unique, la préproinsuline. La préproinsuline est transformée en proinsuline, puis en insuline par clivage. Dans la forme mature de l insuline, les chaînes A et B sont liées par des ponts disulfures. 5/9
2 stratégies pour la production de l insuline : 1) Production des 2 chaînes A et B séparément, puis mélange dans des conditions oxydatives. 2) Production de la proinsuline puis clivage du peptide C. a. Production de 2 chaînes séparément dans E. coli 63 paires de base pour la chaîne A, 90 pour la chaîne B. Trop petit tel quel, donc production sous la forme d une protéine de fusion : β-galactosidase-chaîne A et β-galactosidase-chaîne B β-galactosidase β-galactosidase β-galactosidase-chaîne B β-galactosidase-chaîne A Purification, puis clivage de la protéine liée à la β-galactosidase. Coupure au BrCN après la Met. Mix purified insulin chains A et B. Refold under oxidising condition to promote la formation de ponts disulfure. Première insuline humaine recombinante. Problèmes pour la production de Humulin : Procédé d association des 2 chaînes pas très efficace. Nombreux contrôles pour s assurer qu il n y a pas de résidus bactériens, ou d autres produits résiduels (début de la HPLC) Batterie de 40 tests physico-chimiques pour s assurer de la pureté et du repliement correct. Contraintes liées à la réglementation relative aux manipulations génétiques. 6/9
a. Production de la Proinsuline (prb : proinsulin recombinant bacteria) La proinsuline se replie spontanément avec établissement des ponts disulfures ad/hoc Protéase clivant le peptide C Insuline finale Peptide C : 35aa Synthèse des oligonucléotides codant les 86 aa de la proinsuline. Production dans E. coli Avantages : - une seule chaîne de fabrication - simplification des procédures, pas de protéine de fusion. Repliement de la protéine in vivo dans E. coli, mais toujours contraintes liées à la purification, d où production dans les levures (pry : proinsulin recombinant yest). Modification de la séquence de l insuline par mutagénèse dirigée : obtention d insulines avec des propriétés pharmaceutiques différentes. 5.Production de l'activateur tissulaire du plasminogène = tpa 1 er médicament produit commercialement à partir de cultures de cellules de mammifères tpa : protéase à sérine plasminogène plasmine (enzyme fibrinolytique) dissolution des caillots sanguins par action sur la fibrine Le tpa est un agent fibrinolytique puissant que l'on administre lors d'infarctus du myocarde Protéine de 427 aa, 35 résidus cystéine, 14 ponts disulfure et nombreux sites de glycosylation Criblage d'une banque de cadn Hind III sq signal CDS tpa Eco RI gène dhfr : dihydrofolate réductase 7/9
Sélection des cellules de mammifère sur milieu HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine) Addition de méthotrexate : sélection des cellules qui expriment beaucoup de dhfr par suite d'une amplification génique produisent aussi beaucoup de tpa peptide signal sécrétion dans milieu périplasmique Spécialité : Actilys coût : 2200 $ / 100 mg Production dans les CHO : Chinese Hamster Ovarian Cells coût de production : 10 000 $/g Production possible dans E coli, mais formation de corps d'inclusion, même si elle est sécrétée dans l'espace périplasmique. nécessité de dénaturer la protéine par de l'urée et du chlorure de guanidine renaturation par dilution dans un volume dans un volume 100 fois plus grand Coût de production 22 000 $/g, rendement faible, protéine non glycosylée mais active Actuellement : développement de culture de cellules de mammifères pour la fabrication d anticorps monoclonaux 6.Production de protéines à usage thérapeutique dans des animaux transgéniques (lait de vache, de mouton...) Le lait contient des taux élevés de protéines : caséine, β lactoglobuline : utilisation des promoteurs de ces gènes pour induire l'expression du transgène dans la glande mammaire. Etapes : Construction d'un vecteur portant la séquence codant la protéine d'intérêt sous contrôle d'un promoteur spécifique du tissu mammaire. Utilisation de la construction pour faire un animal transgénique. 1 er médicament en Europe : Atryn GTC biotherapeutics Production en octobre 2006 dans le lait de chèvre 8/9
Production d'animaux transgéniques, knockout (gène interrompu), knockin (gène remplacé par un gène muté) Manipulation génétique sur un embryon à 1 ou plusieurs cellules provenant de femelles fécondées après un traitement ovulatoire. récupération des oeufs fécondés par lavage des oviductes manipulation en vue : d'introduire un gène animaux transgéniques d'interrompre un gène animaux knockout (KO) de remplacer un gène animaux knockin (KI) Récupération de l'embryon manipulé dans une femelle pseudogestante Production d'insuline dans des plantes transgéniques (tabac, laitue) Production d'epo dans le lait d'animaux non transgéniques (transfert du gène à travers l'épithélium de la glande mammaire via des adénovirus). 9/9