T BTK AT de biotechnologies Contexte : Contrôles d hygiène dans l industrie laitière Le respect des règles d hygiène dans l industrie laitière est fondamental. On réalise donc des actions préventives et des contrôles pour maîtriser la qualité microbiologique : -nettoyage et désinfection des locaux et des surfaces de travail, -contrôle des matières premières : lait, eaux -contrôle de l hygiène du personnel. L objectif de la séance est de réaliser différents contrôles : -une numération de germes dans une eau destinée au lavage des installations de stockage du lait pour vérifier sa qualité hygiénique, -une vérification de l efficacité du surfanios, un nettoyant désinfectant couramment employé dans l industrie laitière, -un dosage des chlorures d un lait pour vérifier sa qualité. Liste des documents ressources : -Fiche fournisseur du nettoyant-désinfectant «Surfanios», -Fiche milieux TTC / Tergitol et Baird Parker, -Article de l institut de l élevage. Jour 1 I-Numération de germes dans une eau de lavage après filtration sur membrane 1-Principe Un volume d eau donné est filtré au travers d une membrane filtrante en cellulose dont les pores ne laissent pas passer les bactéries. Celles-ci, après filtration sont retenues sur la membrane. La membrane est déposée sur une gélose adaptée à la culture des germes que l on cherche à dénombrer. Chaque bactérie retenue sur la membrane donne naissance à une colonie après incubation. Les colonies sont ensuite dénombrées directement sur la membrane. Photographie d une membrane filtrante à usage microbiologique (surface quadrillée porosité 0,45 µm) 2-Mode opératoire Présentation de l appareil de filtration L appareil est un simple système de filtration sous pression réduite (trompe à eau). Il contient un support filtre qui reçoit, une partie en inox ou en plastique à large pores, sur laquel la membrane de filtration est déposée. Le godet permet de recevoir l eau à analyser. Les différentes parties du système doivent être autoclavables. Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 1
Consignes d utilisation -Placer l ensemble de l installation en zone stérile. -Manipuler stérilement le support filtre. -Placer la membrane au centre du support filtre. -Installer le godet sur le support filtre et fixer la pince de maintien. -Verser quelques ml d eau stérile pour humidifier la membrane. -Verser l eau à tester et faire le vide (progressivement) pour faire passer le liquide. -Rincer ensuite les bords du godet avec de l eau distillée stérile (environ 20-30 ml), filtrer. -Retirer la membrane (avec une pince stérile) et la poser sur le milieu gélosé (quadrillage vers le haut). On réalisera successivement 2 filtrations (une par élève) pour rechercher et dénombrer, d une part les coliformes, et d autre part les Staphylococcus aureus. Dans chaque cas, on filtrera 100 ml d eau. Pour la recherche des coliformes, la membrane sera déposée sur gélose lactosée au TTC + tergitol 7, pour S.aureus, sur milieu Baird Parker. Les différents milieux seront incubés 24 H à 37 C. Après incubation, compter les colonies directement sur le filtre. 3-Exploitation -Après lecture des fiches des milieux, identifier les colonies caractéristiques dans chaque cas. -Justifier le principe de la technique avec les caractéristiques des bactéries et les caractéristiques du matériel utilisé. -Indiquer le niveau de risque biologique du filtrat (élevé ou faible). Justifier. -Exprimer la concentration bactérienne des deux flores recherchées (en UFC / 100 ml). Conclure. -Si la numération avait été réalisée par dénombrement classique en masse après dilution à 10-1 de l eau de lavage, combien d UFC aurait-on pu compter sur chaque boite? Quel est donc l intérêt et le champ d application de la technique de numération après filtration sur membrane? II-Evaluation de l activité du surfanios sur une souche de S.aureus Staphylococcus aureus représente une source fréquente de contamination dans les industries alimentaires : on vérifiera que le surfanios est bien efficace sur elle. 1-Analyse de la fiche fournisseur du surfanios -Quelle est la concentration d usage du surfanios? -Quel est le temps de contact nécessaire pour obtenir une élimination des bactéries? Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 2
2-Vérification de la concentration en S.aureus du bouillon La souche est fournie en bouillon dont l absorbance à 600 nm a été mesurée à 0,15. -Estimer la concentration bactérienne du bouillon à l aide de la relation de proportionnalité : 0,1 unités d absorbance <-> environ 5x10 7 S.aureus / ml -Prévoir les dilutions décimales à réaliser pour vérifier la concentration exacte lors d un dénombrement en surface sur gélose trypticase soja (prévoir 3 dilutions en simple essai). -Réaliser le dénombrement. Incuber les milieux à 37 C / 48 H. Exploitation : Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / ml. 3-Détermination de la CMI du surfanios vis à vis de S.aureus 3.1-Rappels de principe et de mise en œuvre La détermination de la CMI (concentration minimale inhibitrice) est le plus souvent réalisée en milieu liquide. Elle consiste à mettre en présence dans un tube ou une cupule : -une solution antimicrobienne à une concentration donnée, -un inoculum de la bactérie à tester, -un milieu de culture adapté au développement des germes. Dans ces conditions, les germes pourront se développer, sauf si la concentration en antimicrobien est suffisante pour les inhiber. En réalisant la manipulation à l aide de plusieurs dilutions de l antimicrobien, il est ainsi possible de déterminer la plus petite concentration de l antimicrobien permettant l inhibition des germes. La concentration minimale inhibitrice est donc la plus petite concentration en antimicrobien qui empêche toute croissance visible d un micro-organisme. Cf support théorique sur la détermination de la CMI 3.2-Mode opératoire 3.2.1-Préparation de dilutions du surfanios On dispose d une solution de surfanios à 8 % que l on va diluer en cascade en tube à hémolyse (dilution de raison ½, diluant = eau physiologique stérile, volume final = 1 ml). Proposer le protocole pour réaliser 8 dilutions consécutives en complétant le tableau cidessous, puis réaliser les dilutions : Tubes à hémolyse 1 2 3 4 5 6 7 8 V PE surfanios à 8% (ml) / / / / / / / V de reprise (ml) V diluant (ml) Dilution du surfanios (1/x) Conc.surfanios (%) Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 3
3.3.2-Mise en contact des dilutions du surfanios avec la souche de S.aureus Dans chaque tube, ajouter 900 µl de bouillon Mueller Hinton, puis 100 µl de la culture de S.aureus. Homogénéiser, puis incuber les tubes à 37 C pendant 24H. 3.3.3-Validation de la manipulation Pour valider le bon fonctionnement de la détermination de CMI, on préparera deux témoins : -un témoin n 1 permettant de vérifier qu en absence d antimicrobien, le bouillon Mueller Hinton, permet un bon développement de la souche de S.aureus, -un témoin n 2 permettant de vérifier que le bouillon Mueller Hinton utilisé est bien stérile. Proposer le protocole de réalisation de ces deux témoins. 3.3.4-Exploitation -Exploiter les témoins pour valider la manipulation et lire les résultats. -Avant ajout des 900 µl de Mueller Hinton et des 100 µl de bouillon de S.aureus, le volume de surfanios dilué était de 1 ml dans chaque tube. Quelle dilution supplémentaire ces deux ajouts ont-ils entraînés? -Expliquer le calcul de la concentration finale en surfanios dans le tube 1. -Compléter le tableau en annexe. -Déterminer la CMI du surfanios vis à vis de S.aureus. -Que penser de la concentration d usage du surfanios? 4-Etude du pouvoir bactéricide du surfanios en fonction du temps de contact Pour éliminer efficacement les bactéries, un temps de contact suffisant entre le surfanios et les bactéries est nécessaire. L objectif de cette partie est de déterminer un temps de contact suffisant. 4.1-Mode opératoire (en binôme) Dans un tube à hémolyse, introduire : -1 ml d une solution de surfanios à 0,5 % -A t=0, introduire 1 ml du bouillon de S.aureus. Homogénéiser immédiatement. A t=10 s, 30 s, 1 min, 5 min et 7 min, prélever une anse du mélange et déposer celle-ci sur une gélose trypticase soja + neutralisant. Le dépôt sera réalisé immédiatement en pratiquant une strie en deux passes : Strie pour prélèvement t = 10 s Strie pour prélèvement t = 30 s Strie pour prélèvement t = 1 min Strie pour prélèvement t = 5 min Strie pour prélèvement t = 7 min Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 4
Incuber la gélose 48 H à 37 C. Après incubation, comparer la densité de la culture sur chaque strie par rapport aux témoins de culture ci-dessous : Pas de réduction décimale 1 réduction décimale 2 réductions décimales 3 réductions décimales 4 réductions décimales 5 réductions décimales Remarques pour la lecture de la boite des témoins de culture : la première strie en haut montre l intensité de culture obtenue lorsque la souche de S.aureus en bouillon se développe normalement sur le milieu gélosé. Les autres stries présentent une intensité de culture correspondant à un nombre de survivants de plus en plus faible lorsque le temps de contact avec l antimicrobien est de plus en plus long. 4.2-Exploitation -Sans neutralisant, les germes potentiellement survivants dans chaque prélèvement ne pourraient pas se développer sur la gélose. Quel peut être le rôle de ce neutralisant? -Fournir une photographie de la boite essai ou un schéma des résultats. -Pour chaque temps de contact, déterminer par comparaison aux témoins de culture, le nombre de réductions décimales subit par la population bactérienne. Rendre ces résultats dans un tableau. -Conclure sachant que pour considérer un temps de contact efficace, une population bactérienne doit être réduite d au moins 5 réductions décimales. Jour 2 Dosage des chlorures dans le lait Les chlorures sont un indicateur intéressant pour contrôler la qualité d un lait : -une baisse de la concentration en chlorures peut expliquer une tentative de fraude des producteurs par dilution du lait avec de l eau, -une augmentation de la concentration en chlorures peut traduire des maladies chez les vaches productrices. Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 5
Réactifs Pictogrammes de sécurité Solution défécante Acide nitrique concentré I-Défécation préalable du lait Les composés protéiques et les matières grasses du lait peuvent capter les ions Ag + qui seront utilisés ensuite pendant le dosage : on doit donc au préalable, éliminer ces composés par défécation. Dans une fiole jaugée de 100 ml, introduire : -10 ml de lait à doser, -2 ml de solution défécante, Ajuster à 100 ml avec de l eau distillée. Homogénéiser. Filtrer sur filtre sans cendres. Le filtrat obtenu doit être limpide. II-Dosage des chlorures dans le filtrat de lait Cf fiche technique Dosage volumétrique des chlorures par argentimétrie 1-Etalonnage de la solution de nitrate d argent par une solution de chlorure de sodium : méthode de Mohr Remarque : cette manipulation a déjà réalisée en première On dispose d une solution de chlorure de sodium à 0,015 mol/l que l on veut utiliser pour déterminer la concentration exacte du nitrate d argent (concentration environ 20 mmol/l). Introduire dans un Erlenmeyer de 250 ml : -10 ml de la solution de chlorure de sodium, -environ 30-40 ml d eau distillée. -quelques gouttes de solution indicatrice de chromate de potassium. Verser à la burette la solution de nitrate d argent jusqu au virage (2 essais). Exploitation -Ecrire les équations de réactions. -Déterminer la concentration molaire exacte de la solution d AgNO 3 (Sr = 0,4 mmol/l) Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 6
2-Dosage des chlorures dans le filtrat : méthode de Charpentier - Volhard Introduire dans un Erlenmeyer de 250 ml : -10 ml de filtrat, -environ 20-30 ml d eau distillée, -2 ml d acide nitrique concentré à 50%, -5 ml de la solution de nitrate d argent précédemment étalonnée, -environ 10 gouttes de solution indicatrice d alun de Fer III ammoniacal. Doser par la solution de thiocyanate d ammonium à 5 mmol/l jusqu à apparition d une coloration rose orangé persistante (2 essais). Exploitation -Pourquoi a-t-on placé de l eau distillée avant l ajout d acide nitrique? -Ecrire les équations de réactions. -Ecrire le schéma d équivalence du dosage. -Déterminer la concentration molaire en chlorures dans le filtrat (Sr filtrat = 0,03 mmol/l), déduire la concentration molaire, puis massique en chlorures dans le lait. -Comparer par rapport au résultat attendu. Donnée : M Cl = 35,5 g/mol Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 7
Extrait d article de l institut de l élevage «Intérêt de la mesure des chlorures du lait pour la détection des mammites chez la vache laitière». Institut de l élevage. Mars 2011. Les mammites constituent une pathologie majeure en élevage laitier. Une voie de diagnostic est la mesure du taux de chlorures. Les mammites provoquent un changement important des équilibres ioniques dans le lait se traduit par une diminution de sa concentration en lactose et en ions K + et par une augmentation de sa concentration en ions Na + et Cl -, ceci afin de maintenir l équilibre osmotique de la mamelle. Dans le lait frais de vache la teneur moyenne des ions chlorures se situe entre 0,8 et 1,2 g/l. Dans le cas de laits dits «mammiteux», la valeur moyenne avoisine 1,4 g/l. Dans l industrie laitière, les ions chlorures sont dosés soit à l aide d un chlorumètre soit par volumétrie (norme NF V04-212) : après défécation du lait, on réalise un dosage des ions chlorures dans le filtrat par une solution titrée de nitrate d argent en milieu acide fort Annexe : Mode opératoire et résultats de la détermination de la CMI Tubes à hémolyse 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 V PE de surfanios à 8% (ml) / / / / / / / / / V de reprise (ml) V diluant (ml) Dilution du surfanios à ce stade (1/x) Conc. surfanios à ce stade (%) V bouillon Mueller hinton (ml) V bouillon de S.aureus (ml) Dilution finale du surfanios (1/x) / / Conc.finale surfanios (%) / / Résultats (+/-) Légendes : + - Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 8
Annexe : Mode opératoire et résultats de la détermination de la CMI Tubes à hémolyse 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 V PE de surfanios à 8% (ml) / / / / / / / / / V de reprise (ml) V diluant (ml) Dilution du surfanios à ce stade (1/x) Conc. surfanios à ce stade (%) V bouillon Mueller hinton (ml) V bouillon de S.aureus (ml) Dilution finale du surfanios (1/x) / / Conc.finale surfanios (%) / / Résultats (+/-) Légendes : + - Annexe : Mode opératoire et résultats de la détermination de la CMI Tubes à hémolyse 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 V PE de surfanios à 8% (ml) / / / / / / / / / V de reprise (ml) V diluant (ml) Dilution du surfanios à ce stade (1/x) Conc. surfanios à ce stade (%) V bouillon Mueller hinton (ml) V bouillon de S.aureus (ml) Dilution finale du surfanios (1/x) / / Conc.finale surfanios (%) / / Résultats (+/-) Légendes : + Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 9
- Annexe : Mode opératoire et résultats de la détermination de la CMI Tubes à hémolyse 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 V PE de surfanios à 8% (ml) / / / / / / / / / V de reprise (ml) V diluant (ml) Dilution du surfanios à ce stade (1/x) Conc. surfanios à ce stade (%) V bouillon Mueller hinton (ml) V bouillon de S.aureus (ml) Dilution finale du surfanios (1/x) / / Conc.finale surfanios (%) / / Résultats (+/-) Légendes : + - Documents de travail Lycée Senghor Evreux - http://biotech.spip.ac-rouen.fr 10