TD-ED DCEM 1 Bactériologie B. Berçot Propriété de la Faculté de Médecine Université Paris 7-Denis Diderot Méthodes d étude de la résistance des bactéries au laboratoire Bactéries résistance naturelle résistance acquise supports génétiques mécanismes de résistance Antibiothérapie : choix difficile 1/ choix probabiliste d après conférences de consensus 2/ choix secondaire à analyse bactériologique : prélèvement avant traitement antibiothérapie guidée par un antibiogramme
I. Définitions Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) : la plus faible concentration d antibiotique (en mg/l) inhibant toute culture visible après 18h de culture à 37 C. Mesure de la bactériostase Concentration Minimale Bactéricide (CMB) : la plus faible concentration d antibiotique (en mg/l) laissant moins de 0,01% de survivants de l inoculum initial après 18h de culture à 37 C. Mesure de la bactéricidie Rapport CMB/CMI : tolérance Une bactérie est dite tolérante quand CMB CMI > 32
Détermination de la CMI en milieu liquide pour un antibiotique donné CMI = 2 mg/l milieu de culture liquide + concentrations croissantes (0,5 à 16 mg/l) de l'antibiotique + inoculum bactérien incubation 18h à 37 C La CMI de l'antibiotique à tester est de 2 mg/l inconvénient : 10 tubes/atb
Détermination de la CMB en milieu liquide pour un antibiotique donné 1/ Détermination de la CMB repiquage (milieu solide) compte du nombre n de survivants La CMB sera la concentration pour laquelle on observe moins de 0.01% de survivants par comparaison à une gamme témoin 2/ Détermination de la cinétique de bactéricidie paramètre dynamique qui prend en compte le facteur temps
Détermination de la CMI en milieu solide par la méthode du E-test pour un antibiotique donné Bandelette contenant un gradient d antibiotique déposée sur un milieu gélosé standardisé imprégnée de la bactérie L antibiotique diffuse à partir de la bandelette graduée La CMI est lue directement au niveau de la bandelette. Excellente concordance avec la méthode de référence bandelette E-test 128 mg/ml gélose Mueller Hington 0.064 mg/ml lecture de la CMI
Détermination de la CMI en milieu solide par la méthode de l antibiogramme pour de nombreux antibiotiques Plus simple, compatible avec routine, pour de nombreux antibiotiques Méthode manuelle : méthode de diffusion en gélose inoculum 10 6 bactéries /ml gélose standardisée (Mueller Hinton) disque de papier (antibiotique) Méthode automatisée : antibiogramme automatisé en milieu liquide
Matériel nécessaire à la réalisation de l antibiogramme distributeur antibiotique gélose Mueller Hinton D après Pr A. PHILIPPON (Faculté de Médecine COCHIN, Université PARIS V)
Lecture manuelle ou automatisée de l antibiogramme D après Pr A. PHILIPPON (Faculté de Médecine COCHIN, Université PARIS V)
Détermination du diamètre d inhibition gélose MH diamètre d inhibition disques antibiotique Corrélation: entre le diamètre et la CMI (courbes de concordances )
Exemple : Courbes de concordances de la pénicilline G pour un antibiotique donné diamètre (en mm) 30 --- pénicilline G Diamètre observé 20 10 0 0.25 c CMI calculée 16 C CMI(en mg/l)
Exemple : Différences des courbes de concordances en fonction de l antibiotique testé D après Pr A. PHILIPPON (Faculté de Médecine COCHIN, Université PARIS V)
II. Interprétation de l antibiogramme - SENSIBLE : probabilité acceptable de succès thérapeutique si traitement par voie générale à dose habituelle CMI < concentration critique c - RESISTANT : forte probabilité d échec thérapeutique quel que soit le type de traitement CMI > concentration critique C - INTERMEDIAIRE : succès thérapeutique imprévisible CMI comprise entre les concentrations critiques C et c
La classification du Vidal : spectre clinique de l antibiogramme Les espèces habituellement sensibles appartiennent au spectre naturel de l'antibiotique Le pourcentage de souches résistantes ne dépasse pas 10%. Le médecin peut choisir cet antibiotique pour une infection peu sévère et l'antibiogramme n'est pas nécessaire.
Les espèces modérément sensibles sont naturellement peu sensibles à l'antibiotique mais ne possèdent pas de résistance acquise (CMI 50% comprises entre c et C). Le traitement impose de fortes doses ou il s'agit d'une infection de localisation particulière avec des concentrations très élevées de l'antibiotique.
Les espèces inconstamment sensibles sont dans le spectre naturel de l'antibiotique mais la fréquence de résistance acquise dépasse 10%.
Les espèces résistantes : fréquence de résistance > 90% catégorie hétéroclite - les espèces naturellement résistantes - ou espèces habituellement sensibles mais le pourcentage de résistance est supérieur à 90% - ou l'espèce est sensible in vitro mais résistante cliniquement
Résultat rendus aux cliniciens Enterobacter cloacae
Systématique : III. Principales indications de l antibiogramme - hémocultures, LCR, - souche pathogène isolée de foyers ORL, ostéoarticulaires, pulmonaires,, cathéters, coproculture, ECBU, liquide de ponctions. - toute infection nosocomiale prouvée Inutile : (mais exception) - bactéries pouvant évoquer un contaminant (bactérie commensale, notion de seuil) - infections cutanées dont le traitement est local En concertation si immuno-dépression ou infection plurimicrobienne
Exemple : antibiogramme de Streptococcus pneumoniae CMI pénicilline G = 0.023mg/l S aux pénicillines R acquise kanamycine et co-trimoxazole
CMI de la pénicilline G (PG) et du céfotaxime (CTX) mesurées par E-test chez une souche de S. pneumoniae BNR R acquise de S. pneumoniae sensibilité diminuée à la pénicilline G (I) par modification des PLP mais S au céfotaxime
Exemple : Haemophilus influenzae et β-lactamines Test de cefinase Résistance acquise par production de β-lactamase plasmidique : R pénicilline A S pénicilline A + acide clavulanique
Haemophilus influenzae et β-lactamines Résistance acquise par modification des PLP : Sensibilité diminuée à pénicilline A et C 3 G et pénicilline A + acide clavulanique
Exemple : Escherichia coli et β-lactamines Phénotype sauvage : sensible aux pénicillines A et céphalosporines Résistance acquise par production de β-lactamase plasmidique : R aux pénicillines A et récupération partielle par pénicilline A + acide clavulanique
Exemple : Klebsiella pneumoniae et β-lactamines Phénotype sauvage : R naturelle pénicilline A et carboxypénicillines S aux C 1 G, C 2 G, C 3 G carbapénems
Exemple : Pseudomonas aeruginosa et β-lactamines Phénotype sauvage : R naturelle pénicilline A C 1 G, C 2 G et certaines C 3 G S carboxypénicillines, uréidopénicillines, ceftazidime, carbapénem
synergie antagonisme
Conclusion L étude de la sensibilité de l antibiotique in vitro accompagnée d une lecture interprétative de l antibiogramme est indispensable pour le choix d une antibiothérapie adaptée. Le biologiste a l entière responsabilité de la bonne conduite de cet examen. La concertation entre le clinicien et le bactériologiste est indispensable pour la révision de toute antibiothérapie bien conduite. Références : http://www.microbes-edu.com http://lyon-sud.univ-lyon1.fr/bacterio/college/hc99/resistab/sld015.html