Biologie Cellulaire Chapitre 4 : La communication inter-cellulaire via les récepteurs membranaires Partie 2 Docteur Laurent PELLETIER MED@TICE PCEM1 - Année 2006/2007 Faculté de Médecine de Grenoble - Tous droits réservés.
Récepteurs membranaires Récepteurs membranaires Àactivité enzymatique Sans activité enzymatique RTK (RYK) RTP (RYP) Canaux ioniques Couplés Prot G R cytokines
Phosphorylation Généralités γ Adénine Groupements phosphate Ribose ATP ADP Protéine kinase Protéine OH Protéine phosphatase Pi H 2 O Protéine O I HO P = O I OH
Phosphorylation Généralités Tyrosine (Y) Sérine (S) Thréonine (T) Tyrosine kinases Récepteurs : EGF-R, Ins-R Autres : Bmx, Itk Sérine-thréonine kinases Ex : MAPKs, PKA, PKC
Récepteurs à activité TK Mise en évidence de la phosphorylation de protéines in vitro ATP 32 P Na 3 32 PO 4 stimulus - Stimulus - + cellules en culture Extraction protéines Electrophorèse SDS-PAGE + Coloration Autoradiographie
Phosphorylation Un interrupteur biochimique
Phosphorylation Protéine Kinase A (PK AMPc-dépendante) 5 AMP Phosphodiesterase (PDE) ATP PP AMPc PKA
Phosphorylation Protéine Kinase A AMPc PKA Cytoplasme Noyau
Phosphorylation Glycogène n+1 Glycogène + UDP-glucose n Glycogène synthase Glycogène synthase syntase P PKA Phosphorylase kinase Phosphorylase kinase P Glycogène phosphorylase Glycogène Phosphorylase phosphorylase P Glycolyse Glycogène n Glycogène n-1 + glucose 1-P
Récepteurs membranaires Récepteurs membranaires À activité enzymatique Sans activité enzymatique RTK (RYK) RTP (RYP) Canaux ioniques Couplés Prot G R cytokines
Récepteurs à activité TK N Caractères communs Protéines transmembranaires Domaine extracellulaire : N-terminal, glycosylé, riche en cystéines, Site de reconnaissance du ligand Domaine transmembranaire : hélice α, 22-25 aa C Domaine intracellulaire C-terminal, domaine activité TK, Tyrosines
Récepteurs à activité TK
Principe d activation
Principe d activation P P P P P P
Récepteurs à activité TK Mise en évidence de l autophosphorylation Méthode historique : Na 3 32 Na ATP 32 P PO 4 32 PO EGF Lysat cellulaire Electrophorèse + autoradiographie
Récepteurs à activité TK Mise en évidence de l autophosphorylation Incubation Ac anti-(egf (EGF-R) EGF EGF receptor receptor EGF receptor Centrifugation Lavage Electrophorèse + autoradiographie
Récepteurs à activité TK Mise en évidence de l autophosphorylation UnT EGF EGF-R 170 kda Pi-EGF EGF-R 170 kda
Récepteurs à activité TK Principe d activation?
Récepteurs à activité TK Principe d activation
Récepteurs à activité TK EGF-R
Récepteurs à activité TK EGF-R Domaines SH = Src homology domains N SH4 SH3 SH2 SH1 C SH1 : Tyrosine Kinase activity SH2 : ptyr-met/val Met/Val-X-Met SH3 : R-X-X-P-X-X-P SH4 : myristylation
Récepteurs à activité TK EGF-R SH2
Récepteurs à activité TK EGF-R SH3
Récepteurs à activité TK Src EGF-R 1911, Peyton ROUS Rous Sarcoma Virus (RSV) Gag, pol, env, src Oncogène, ne, proto-oncog oncogènene V-src,, c-srcc 1956, Nobel
Récepteurs à activité TK EGF-R
Récepteurs à activité TK EGF-R GRB-2 (Growth Receptor Binding protein) SH3 SH2 SH3 SOS (Son Of Sevenless) RasGEF Pro-rich rich
Récepteurs à activité TK EGF-R Ras 21 kda Monomère GTPase GTP / GDP Active / Inactive Proto-oncog oncogènene Ras/GDP
Récepteurs à activité TK EGF-R SOS (GEF) GAP GEF : Guanine nucleotide Exchange Factor GAP : GTPase Activating Protein
Récepteurs membranaires EGF Récepteur à activité TK membrane Ras GDP Ras GTP GTP Raf MAPKKK P GRB2 SOS MEK P MEK MAPKK ERK1/2 MAPK : Mitogen-Activated Kinase (Kinase ) MEK : MAPK/ERK Kinase ERK : Extracellular signal-regulated Kinase P P ERK1/2 Cytoplasme Noyau MAPK
Récepteurs membranaires ATP ADP P ERK MEK P P P ERK SRF : Serum Response Factor SRE : Serum Response Element
Récepteurs membranaires Stimulus fact. croiss., mitogènes Stress, cytokines inflammatoires, fact. croiss. Ras Rac/Cdc42 MAPKKK Raf PAK/MLK MLK, TAK, ASK1 MAPKK MEK1/2 MKK4/7 MKK3/6 MAPK ERK1/2 JNK P38 MAPK Thr-Glu-Tyr Thr-Pro-Tyr Thr-Gly-Tyr Effets biologiques Croissance, différenciation, développement Inflammation, apoptose, croissance, différenciation
Effets de l activation de Tyrosine Kinase de EGFR Expression de facteurs angiogéniques Angiogenèse* LIGAND fixation EGFR-TK Autophosphorylation EGFR-TK P ras / raf / MAPK voie de transduction de signal Progression dans le cycle cellulaire Prolifération cellulaire* Apoptose Apoptose* Adhésion cellulaire et mobilité Invasion et métastase* * Potential effects of blocking EGFR-TK signal transduction pathways EGFR-TK, Epidermal growth factor receptor - tyrosine kinase
Récepteurs à activité TK EGF-R / ras une cible thérapeutique
Récepteurs à activité TK EGF-R
Récepteurs à activité TK EGF-R
Récepteurs à activité TK GF EGF-R - Cross-Talk P PLC PIP 2 DAG GDP Ras Ras GTP membrane IP 3 [Ca 2+ ] RasGRF Cm Ca 2+ -dependent Ras activation Voie PLCγ Voie Ras Cm : calmoduline
Récepteurs à activité TK EGF-R
Récepteurs à activité TK PI3K = phosphatidylinositol-3-oh kinase Lipide kinase 3 du cycle inositol des phospho-inositides membranaires. PI(4,5)P2 PI (3,4,5)P3 >> PI PI(3)P ; PI(4)P PI(3,4)P2 Hétérodimères res : p110 (110 kda) : Sous-unit unité catalytique p85 (85 kda) : Sous-unit unité régulatrice (2 domaines SH2) An aval PKB (Akt) & PDK (Phosphoinositide( Phosphoinositide-Dependent Kinase) Pleckstrin Homology domain (PH)
Récepteurs à activité TK PIP2 PI3K PIP3
Récepteurs à activité TK Ins-R IRS : Insulin Receptor Substrate PI3K Grb2/SOS & Ras
Récepteurs à activité TK Ins-R
Récepteurs à activité TK Ins-R
Récepteurs à activité TK Ins-R
Récepteurs à activité TK Pathologie Ins-R Défaut dans la voie de signalisation de l insuline Conséquences : Hyperglycémie, Glycosurie, Type 1 Diabète juvénile ou diabète sucré insulino-dépendant (IDDM) Type 2 Diabète sucré non insulino-dépendant (NIDDM)
Récepteurs à activité TK EGF-R
Récepteurs à activité TK Principe d activation Auto- ou trans-phosphorylation??
Récepteurs à activité TK
Récepteurs à activité TK EGF En médecine EGR, ErbB, Herceptine et Cie EGF-R / ErbB-1 EGF-R / ErbB-1 EGF-R / ErbB-1 ErbB-2 EGF-R / ErbB-1 ErbB 3 ou 4
Récepteurs à activité TK EGFR/ErbB-1 En médecine 30 % des cancers du poumon Agressivité, mauvais pronostic ErbB-2 (HER2/neu) Normal: 20 000-100 000 recepteurs à la surface d une cellule nombreux cancers (cell. épithéliales) 1-2 10 6 récepteurs Cancer du poumon : Agressivité, survie courte Oncogène +++ Orphelin ErbB-3, ErbB-4 EGR, ErbB, Herceptine et Cie
Récepteurs à activité TK En médecine EGR, ErbB, Herceptine et Cie Surexpression de ErbB-2 : Immunohistochimie Tumeur du poumon ErbB-2 + + + Tumeur du poumon ErbB-2 +
IRESSA (ZD1839) Monotherapy for Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Oncologic Drugs Advisory Committee Meeting September 24, 2002 ONCOLOGY
IRESSA R R EGF & cellules cancéreuses R R K K K K Gene transcription and cell cycle progression myc cyclin D1 Jun Fos
IRESSA R R EGF & cellules cancéreuses R R P P P K K PI3-K P K P K P RAS RAF SOS GRB2 MEK AKT MAPK Inhibition of apoptosis Gene transcription and cell cycle progression Jun Fos myc cyclin D1 Proliferation Angiogenesis Metastasis
Mean tumor volume, cm 3 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 IRESSA Inhibits Growth of A549 Xenograft Tumors (NSCLC) IRESSA 200 mg/kg, po days 10-72 IRESSA 200 mg/kg, po days 10-30 Vehicle 20 40 Day 60 80
Récepteurs à activité TK En médecine EGR, ErbB, Herceptine et Cie Herceptin (Trastuzumab) http://cis.nci.nih.gov/fact/7_45.htm Anticorps monoclonal Humanisé IV ErbB-2 Inhibiteur
Récepteurs membranaires Récepteurs membranaires Àactivité enzymatique Sans activité enzymatique RTK (RYK) RTP (RYP) Canaux ioniques Couplés Prot G R cytokines
Récepteurs membranaires Cytokines Erythropoïétine (EPO), Interleukines (IL) Granulocyte Colony-Stimulating Factor (G-CSF), Granulocyte Macrophage Colonystimulating Factor (G-CSF), Thrombopoïétine (TPO), Prolactine (PRL), Hormone de croissance (hgh)
CSF Flt3L BFU-E CD34 Cellule souche Cellule hématopoïétique pluripotente Erythrocyte Mégacaryocyte Epo Lymphocyte T M-CSF GM-CSF IL3, IL6, IL11, Epo, GM-CSF IL3, GM-CSF, Epo CFU-GM CFU-GEMM Progéniteur myéloïde Eosinophile Cellule dendritique Macrophage Neutrophile Mastocyte Basophile IL2, IL4 Lymphocyte B Progéniteur lymphoïde pré-t IL2, IL4 IL5, IL6 IL7 IL7 IL3 pré-b G-CSF GM-CSF IL3, GM-CSF, IL6 IL3, IL9, IL10 IL3, IL4, GM-CSF IL3, IL5, GM-CSF
Récepteurs membranaires EPO-R Erythropoïétine 165 AA ~ 40% glucides Produite par le rein Progéniteurs érythrocytaires Anémie
Récepteurs membranaires EPO-R Prolifération EPO Cellule souche BFU-E CFU-E Maturation EPO EPO Réticulocyte EPO Globule rouge
Récepteurs membranaires EPO-R
Récepteurs membranaires EPO-R EpoR IP : anti-epor WB : anti PY Epo - +
Récepteurs membranaires EPO-R JAK JAK P P P JAK P JAK P P JAK = Janus Kinase ou Just Another Kinase
Récepteurs membranaires EPO-R Cytosol Noyau STAT P P STAT STAT P P STAT Transcription P JAK P P STAT P JAK P P STAT STAT : Signal Transducing Transcription Activator
Récepteurs membranaires EPO-R
Récepteurs membranaires EPO-R P JAK JAK P CIS P JAK JAK P CIS P P CIS P P CIS : Cytokine Inducible SH2-containing proteins SOCS : Suppressor of Cytokine Signalling SHP-1 1 : SH2- containing phosphotyrosine Phosphatase -1
Récepteurs membranaires Récepteurs membranaires Àactivité enzymatique Sans activité enzymatique RTK (RYK) RTP (RYP) Canaux ioniques Couplés Prot G R cytokines
Récepteurs membranaires Récepteur phosphotyrosine phosphatase Substrats cytosoliques, membranaires CD45 / Leucocyte Common Antigen 1 Chaîne transmembranaire. Cell. hémato. & cell. immun.
Récepteurs membranaires Récepteurs membranaires Àactivité enzymatique Sans activité enzymatique RTK (RYK) RTP (RYP) Canaux ioniques Couplés Prot G R cytokines Et les autres!
Récepteurs membranaires Récepteur guanylyl cyclase Facteur Natriurétique Atrial (ANF) Détection de l extension (stretch) des fibres musculaires des oreillettes prohormone Pro-ANF (126 aa) ANF (28 aa)
Récepteurs membranaires Récepteur guanylyl cyclase Mb pl Domaine TK Domaine GC
Récepteurs membranaires Récepteur guanylyl cyclase ANF R Guanylyl cyclase cgmp PKG phosphorylations ( GMP (PDE)) Rein : natriurèse (sortie Na + + H 2 O) volume plasmatique Cellules musculaires lisses : relaxation vasodilatation PA
Récepteurs membranaires Récepteur guanylyl cyclase
Récepteurs membranaires Récepteur guanylyl cyclase The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1998 "for their discoveries concerning nitric oxide as a signalling molecule in the cardiovascular system" Robert F. Furchgott Louis J. Ignarro Ferid Murad USA SUNY Health Science Center Brooklyn, NY, USA 1916 - USA UCLA School of Medicine Los Angeles, CA, USA 1941 - USA University of Texas, Health Science Center Dallas, TX, USA 1936 -
Récepteurs membranaires Récepteur Guanylyl cyclase
Hanahan and Weinberg Cell 100:57
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