Geoffrey MASUYER Décembre 2004 Master 2 Pro Expression Génique et Protéines Recombinantes PROTEASOME Inhibition de la dégradation de p53 par le Protéasome Interaction MDM2-p53 Résumé La croissance et le métabolisme normaux des cellules sont dépendants non seulement de la présence et de l activation de protéines critiques, mais également de leur dégradation en temps voulu, permettant le bon déroulement du cycle cellulaire. Un acteur clé dans la dégradation des protéines de la cellule est le protéasome 26S. La majorité des dégradations de protéines cellulaires sont réalisées par la voie ubiquitine-protéasome. Le suppresseur de tumeur p53 est l un des principaux médiateurs de l arrêt du cycle cellulaire et initiateur de l apoptose en réponse à des dommages cellulaires. Ainsi le contrôle de la stabilité de p53 et de son activation représente une approche intéressante en vue d une thérapie anti-cancéreuse. La régulation de p53 dans la cellule repose essentiellement sur son régulateur négatif MDM2 avec lequel p53 interagit. Un moyen d empêcher la dégradation de p53 par le protéasome est de cibler l interaction p53-mdm2 par des antagonistes de MDM2. Mots clés : protéasome, inhibition du protéasome, interaction p53-mdm2, Nutlin
Introduction L homéostasie des protéines est critique pour les processus biologiques qui sont fondamentaux pour la survie des cellules cancéreuses. Ainsi, l un des principaux points d intérêts de la recherche contre le cancer est de cibler la régulation de la production et la destruction des protéines. En particulier les facteurs qui favorisent la prolifération et autres caractéristiques particulières des cellules malignes. Récemment, il est devenu largement admis que la destruction ordonnée des protéines responsables de la régulation du cycle cellulaire est cruciale pour le contrôle des phénomènes cellulaires associés au cancer. La voie ubiquitineprotéasome qui intervient dans 80% de la dégradation de toutes les protéines cellulaires est le principal mécanisme de dégradation des protéines, incluant celles jouant un rôle dans le cycle cellulaire [1 ]. En conséquence, le protéasome apparaît comme une cible attractive pour la thérapie cancéreuse. Cette étude introduit tout d abord les caractéristiques principales du protéasome ainsi que son rôle dans la cellule. Ensuite l intérêt de l inhibition du protéasome et plus particulièrement la responsabilité de p53 et son interaction avec MDM2 seront discutés. Le protéasome Le protéasome 26S est un complexe enzymatique multicatalytique exprimé dans le noyau et le cytoplasme de toutes les cellules eucaryotes. Sa fonction première est de dégrader les protéines, ses substrats incluent entre autres les suppresseurs de tumeurs, les régulateurs du cycle cellulaire, les facteurs de transcription et les protéines anti-apoptotiques [2]. Quand la dégradation de ces protéines est interrompue, les effets sont potentiellement vastes, particulièrement dans les cellules cancéreuses se développant rapidement et nécessitant des protéines favorisant la croissance pour soutenir la mitose incontrôlée, caractéristique du développement des tumeurs. La voie ubiquitine-protéasome Pour qu une protéine soit reconnue par le protéasome, un petit peptide, l ubiquitine, doit d abord être attaché à la protéine cible. Ce processus intervient 2
Figure 1: Ubiquitination des protéines ciblées pour le protéasome. [3 ] Une enzyme activatrice de l ubiquitine (E1) se lie à l ubiquitine, qui est alors transféré à une enzyme conjugatrice de l ubiquitine (E2); une ubiquitine-ligase (E3) aide le transfert de l ubiquitine à la cible substrat. Plusieurs molécules d ubiquitine sont attachées aux protéines avant leur reconnaissance et dégradation par le protéasome 26S; avant la dégradation, la chaîne d ubiquitine est détachée, permettant à l ubiquitine libre d être recyclée. Figure 2: Représentation schématique du protéasome 26S [2] 3
grâce à une cascade d enzymes (E1, E2, et E3) (figure 1, [3 ]) qui active l ubiquitine libre et la dirige vers la protéine cible. E1 active et transfère l ubiquitine sur la protéine porteuse E2. E2 présente l ubiquitine à E3. E3 se lie à la protéine cible et interagit avec E2 pour attacher l ubiquitine à la protéine cible de façon covalente. Ce processus est répété plusieurs fois, créant une chaîne poly-ubiquitine qui va pouvoir être reconnue pour la destruction par le protéasome. Actuellement une seule protéine E1 est connue, alors qu il existe une vingtaine d enzymes E2 et encore un plus large nombre de ligases E3. Cette hiérarchie permet des interactions très spécifiques qui sont essentielles à la forte coordination que nécessite la dégradation des protéines cellulaires. Cette voie par laquelle les protéines sont ubiquitinées et dégradées par le protéasome est critique à la fois pour la cellule mais également pour la réponse inflammatoire et la présentation des antigènes. Structure Le complexe multiprotéique du protéasome consiste d un corps principal 20S qui est associé avec une ou deux particules régulatrices 19S (figure 2, [2]). Chaque sous-unité 19S est capable de se lier à la chaîne poly-ubiquitine et de la détacher de la protéine substrat. Ce substrat est alors dénaturé et introduit dans le cœur protéolytique. La particule 20S est un cylindre composé de quatre anneaux empilés, elle possède une faible activité catalytique dans son milieu cellulaire [3 ]. Les deux anneaux extérieurs (appelés «α») se complexent avec les particules régulatrices 19S, formant un canal étroit à travers lequel seules les protéines dénaturées peuvent passer. La chambre catalytique est formée par les deux anneaux β internes, chacun contenant trois sites actifs. Ces sites diffèrent dans leur spécificité et activité et sont nommés d après les enzymes qui présentent des activités protéolytiques similaires. Ces sites sont ainsi dénommés chymotrypsique, trypsique, et PGPH pour postglutamyl peptide hydrolase-like. Les protéines sont dégradées par le cœur protéolytique d une façon progressive, générant des peptides de 3 à 25 acides aminés de long qui peuvent servir à la présentation des antigènes. 4
Classe de protéines Protéine Fonction protéique Cyclines et protéines associées Cyclines A, B, D, E Progression du cycle cellulaire Cycline-dépendante kinase inhibiteurs Régulation de l'activité cycline Suppresseur de tumeur p53 Facteur de transcription Oncogènes c-fos/c-jun Facteur de transcription c-myc Facteur de transcription N-myc Facteur de transcription Protéines inhibitrices IκB Inhibiteur de NF-κB p130 Inhibiteur de E2F-1 Enzymes cdc 25 phosphatase CDK1/cycline B phosphatase Tyrosine amino transferase (TAT) Métabolisme de la tyrosine Topoisomérase I DNA supercoiling Topoisomérase IIα DNA supercoiling Table 1: Fonction des protéines relatives au cycle cellulaire dégradées par le protéasome [1 ] 5
Inhibition du protéasome Le protéasome 26S est donc responsable de la dégradation des protéines chez les eucaryotes et parmi elles plusieurs protéines responsables du cycle cellulaire (Table 1, [1 ]). Une indication du rôle important que joue le protéasome dans ce processus est que l arrêt des fonctions du protéasome stoppe la division cellulaire. Aussi les cellules tumorales apparaissent plus sensitives à la perte d activité du protéasome et des études montrent que ces cellules sont plus sensibles à l apoptose [1 ]. Le premier inhibiteur du protéasome à être entré en phase clinique est le Bortezomib [2], de la famille des peptides analogues au boronate, et qui permet l inhibition de l activité chymotrypsine du protéasome en se liant au site correspondant. La capacité thérapeutique de l inhibition du protéasome repose dans la possibilité de stabiliser les protéines qui inhibent la survie cellulaire et la progression du cycle cellulaire [16]. Une telle protéine, p53, à été mise en évidence par MacLaren et al [11 ]. Interaction p53-mdm2 Une autre approche allant dans ce sens est d inhiber la dégradation d une cible importante du cycle cellulaire en amont de sa dégradation par le protéasome. Depuis la découverte de ses puissantes activités, suppression de la croissance et apoptose, le suppresseur de tumeur p53 a été largement étudié. D autant plus qu il est majoritairement contrôlé par un seul régulateur, MDM2 (pour mouse double minute 2) qui s y attache et contrôle négativement son activité et sa stabilité [8 ]. Ainsi, des antagonistes de MDM2 capables de séparer les deux protéines sont supposés stabiliser et activer le suppresseur de tumeur, induisant l arrêt du cycle cellulaire et la mort programmée des cellules cancéreuses. Le suppresseur de tumeur p53 joue un rôle clé dans la protection contre le développement de cancer du à diverses formes de stress cellulaire [14 ]. Ce stress engendre des modifications post-traductionnelles, c est à dire la phosphorylation des sérines 15 et 20 de p53. Ceci entraîne la dissociation de MDM2 et permet donc la tétramérisation de p53 qui va pouvoir réguler la transcription. p53 est un facteur de transcription efficace qui régule de multiples gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, l apoptose et l antiangiogénèse. 6
p53 MDM2 MD M2 stress cellulaire p53 MD M2 26S p53 Ub dégradation MD M2 p53 apoptose p53 MD M2 Cytoplasme Noyau Figure 3: Schématisation du rôle de MDM2 dans la voie de p53 Figure 4: Représentation de l interaction p53-mdm2, structure cristallographique réalisée par Kussie et al (Science 1996) [10] En vert, MDM2, et en jaune le domaine de transactivation de p53. En évidence les 3 acides aminés critiques F19, L26 et W23. 7
La concentration en p53 dans la cellule est soumise à un contrôle fort par MDM2. En effet, MDM2 est une phosphoprotéine qui joue le rôle d ubiquitine ligase pour p53, elle permet entre autre l exportation de p53 du noyau vers le cytoplasme et son ubiquitinilation, favorisant ainsi sa dégradation par le protéasome 26S [14 ]. (Figure 3, 4). De plus il existe une boucle de régulation entre p53 et MDM2, puisqu une forte concentration en p53 favorise la transcription de MDM2. Inhibition du protéasome et importance de p53 MacLaren et al [11 ] ont étudié l apoptose p-53-dépendante induite par l inhibition du protéasome chez des cellules épithéliales mammaires. Pour cela l inhibition du protéasome par un peptide aldéhyde inhibiteur spécifique (MG132) est observée sur une lignée cellulaire murine (KIM-2). Cette lignée cellulaire représente un bon model in vitro pour étudier le développement des cellules épithéliales mammaires car elle possède les marqueurs de différentiation spécifiques à ce type de cellules. La figure 5 représente les résultats obtenus pour l examen du traitement de ces cellules par MG132 pendant 24 heures. L apoptose est analysée par le test à l annexin V. Les résultats montrent que des cellules apoptotiques apparaissent après 4h de traitement. Le niveau d apoptose augmente jusqu à 18-20 h où il atteint un maximum de 20%. Ceci corrèle avec le temps de division cellulaire qui est de 24h dans cette lignée. Par ailleurs, d autres inhibiteurs du protéasome 26 S sont testés et présentent le même type de résultats, permettant de conclure que l initiation de l apoptose est due au blocage de la dégradation des protéines par le protéasome 26S. De plus il est reconnu que p53 est impliquée dans les signaux d induction de l apoptose [14 ]. Son importance dans ce phénomène au niveau de l inhibition du protéasome est donc étudiée. Des cellules ES contenant p53 sauvage et d autres étant nulles pour p53 ont été obtenues et traitées avec MG132, inhibiteur du protéasome (plus particulièrement au niveau de l activité chymotrypsique). Ces cellules sont ensuite analysées comme précédemment. Les résultats de la figure 6 montrent que l apoptose est très fortement augmentée dans les cellules exprimant p53 sauvage comparées aux p53 nulles. De plus le même test a été réalisé dans une lignée cellulaire exprimant une p53 mutée, montrant un faible de taux d apoptose 8
Figure 5: Mesure de l Annexin V au cours du temps sur les cellules KIM-2. Les cellules sont traitées avec MG132 pendant 24h. Les échantillons sont récoltés et soumis à une analyse à l Annexin V. Les résultats montrés sont la moyenne de trois expériences, et sont exprimés comme pourcentage des cellules positives à l Annexin V. [11] ES wt p53 ES p53 nulle Figure 6: Dépendance à p53 de l apoptose induite par l inhibition du protéasome. Des cellules ES contenant p53 sauvage ou non (nulle) sont traitées au MG132 à différentes concentrations. Une analyse par Annexin V est ensuite réalisée. [11] 9
dans ces cellules. Ces résultats confirment l importance de p53 sauvage dans l induction de l apoptose, et donc l intérêt d inhiber sa dégradation par le protéasome. Ciblage de l interaction p53-mdm2 Les différentes approches La découverte que la liaison p53-mdm2 implique une interaction de 3 résidus acides aminés critiques de p53 avec une poche hydrophobe bien définie à la surface de MDM2 (figure 4) a donné l espoir de pouvoir identifier des inhibiteurs pharmacologiques de cette interaction [13 ]. Différentes approches ont été utilisées pour valider l interaction p53-mdm2 comme cible médicamenteuse. Celles-ci incluent la micro-injection d anticorps monoclonaux dirigés contre le site de liaison de p53 sur MDM2 [4,5], l inhibition de l expression de MDM2 par des oligonucléotides antisens [7,17 ], ou encore la micro-injection ou expression intracellulaire de petites protéines de fusion [15]. Toutes ces études ont démontré que le blocage de la liaison p53- MDM2 peut perturber la boucle de régulation de p53, provoquant l accumulation et l activation de la voie de p53. Cependant, ces expériences ont principalement utilisé des outils protéiques (peptides ou protéines), qui ont donc des applications limitées, particulièrement pour le besoin d études en cellules vivantes ou des modèles animaux de cancer. L une des exceptions est cependant l approche utilisant les oligonucléotides antisens. Les études utilisant cette technique ont montré que des oligonucléotides à phosphorothioate (OPT) dirigés contre MDM2 peuvent supprimer efficacement l expression de MDM2, permettant ainsi l accumulation et l activation de p53. Les conséquences de cette activation ont été examinées dans plusieurs souris xenogreffes modèles de cancer humain [17 ]. Les observations ont confirmé une suppression de la croissance des tumeurs, améliorée par la combinaison avec des médicaments génotoxiques reconnus. De plus, d une façon surprenante, toutes les études impliquant l utilisation d oligonucléotides antisens ont démontré des effets de suppression de la croissance des tumeurs, c est à dire aussi bien chez les cellules cancéreuses exprimant p53 sauvage que mutée. Ces observations compliquent l interprétation des résultats mais laissent penser qu il existe une voie indépendante de p53 liant à l apoptose et activée par MDM2. 10
Figure 7: Structure et mode de liaison des inhibiteurs de MDM2. [13] A gauche, la structure cristallographique de MDM2 avec l inhibiteur Nutlin-2 A droite, recouvrement de la Nutlin-2 (Carbone en blanc, Azote en bleu, Oxygène en en rouge, et Bromine en marron) avec la chaîne peptidique Phe19, Trp23 et Leu26. Figure 8: Analyse de l inhibition de la liaison p53-mdm2 par Biacore. [13] 11
Un aspect important afin de valider l interaction p53-mdm2 comme cible du cancer est d évaluer les conséquences de l activation de p53 dans les tissus normaux proliférant. Il a été montré que l activation de la voie de p53 peut induire une forte toxicité dans les tissus à fort taux de prolifération. Cette toxicité peut être causée par les deux fonctions principales de p53 [14 ], c est à dire l arrêt du cycle cellulaire et l apoptose, et peut ainsi limiter toute fenêtre thérapeutique impliquant l activation de p53. Inhibiteurs pharmacologiques de l interaction p53-mdm2 De nombreux efforts sont dirigés sur le développement d antagonistes de MDM2 pouvant se diriger directement sur la liaison protéine-protéine. Les premières molécules chimiques ayant démontré une activité anti-tumorale, les «chalcones», peuvent se lier à la poche hydrophobique de MDM2 et activent la voie de p53 mais causent également de nombreux effets indésirables, limitant leurs applications [9]. Des dérivés de ces molécules sont également a l étude. Plus récemment, des molécules chimiques, les «Nutlins», antagonistes de l interaction p53-mdm2 ont été identifiées par criblage d une banque de molécules synthétiques [13 ]. Ce sont des dérivés de cis-imidazoline qui peuvent se lier étroitement dans la poche p53 de MDM2 grâce a une forte similitude avec l interaction entre MDM2 et les 3 acides aminés critiques de p53 (figure 7). La capacité de liaison de ces composés est analysée par résonance plasmonique de surface, grâce à l équipement Biacore, dans un format de compétition en solution (figure 8). Chaque composé est incubé, à une gamme de concentrations différentes, avec une MDM2 humaine recombinante (exprimée dans E.coli) puis injecté à la surface d une puce où est fixée p53. p53 est obtenue par expression dans E.coli et immobilisée grâce à un tag histidine. La liaison est mesurée à l équilibre et calculée par rapport au pourcentage maximum de liaison, déterminé lui par l interaction p53-mdm2 sans inhibiteur. Les résultats montrent que ces composés délogent p53 de MDM2 pour une moyenne de concentration variant de 100 à 300 nm. Ces imidazolines sont synthétisées en mélange racémique à partir duquel les énantiomères peuvent être séparés par colonne chirale. Ceci a permis de démontrer qu il existe une différence d activité entre les énantiomères de Nutlin, plus 12
mutant wt Figure 9: Inhibition de l interaction p53-mdm2 par la Nutlin. [13] Analyse par western-blotting des niveaux de p53, MDM2 et p21 dans des cellules exprimant une p53 mutante (SW430) ou sauvage (HCT116) traitées à la Nutlin-1 Figure 10: Inhibition de l interaction p53-mdm2 par la Nutlin. [13] Analyse par PCR en temps réel du niveau de transcription des gène de p53 (bleu), et p21 (rouge) dans des lignées cellulaires exprimant une p53 sauvage (HCT116, RKO, H460) traitées à la Nutlin-1. Les RNA totaux sont extraits puis convertis en cdna en utilisant le Taqman RT reagents kit. Les quantités de transcrits sont déterminées par Taqman en utilisant des sondes et amorces spécifiques. 13
particulièrement pour la Nutlin-3 (figure 8c) où une différence de 150 peut être observée entre ses deux formes. Afin de déterminer si l inhibition de l interaction p53-mdm2 par ces analogues d imidazoline se traduit par l activation de la voie cellulaire de p53, des cellules cancéreuses exprimant p53 sauvage sont étudiées [13 ] (HCT116 et RKO). Par ailleurs, des lignées cellulaires exprimant une p53 mutante sont utilisées comme contrôle négatif (SW480, MDA-MB-435, PC3). Tout d abord les effets des inhibiteurs de MDM2 sur les niveaux cellulaires de p53, MDM2 et p21 sont examinés (figure 9). Il faut préciser que p21 est une cible de transcription majeure de p53 activée. Les deux différentes lignées cellulaires, exprimant p53 mutée ou sauvage, sont incubées pendant 8h avec de la Nutlin-1. Les lysats cellulaires sont ensuite analysés par western-blotting en utilisant des anticorps spécifiques pour p53, MDM2 et p21. Les résultats montrent que le traitement à la Nutlin-1 a généré une augmentation des concentrations des trois protéines, dépendante de la concentration en inhibiteur chez les cellules exprimant p53 sauvage. A l opposé, les cellules exprimant p53 mutée ne montrent aucun changement dans les concentrations en protéines, si ce n est une plus forte quantité initiale de p53. Les mêmes observations sont faites dans des autres lignées cellulaires, en liaison avec le statut de p53. Ainsi, ces résultats confirment que p53 sauvage s accumule dans la cellule après un traitement à la Nutlin-1 et provoque une augmentation des taux de MDM2 et p21, conformément au cycle d activation de la voie p53. Afin de confirmer que l accumulation de p53 est due à une inhibition de la dégradation de la protéine plutôt qu à une augmentation du niveau d expression du gène p53, l expression des gènes p53 et p21 est mesurée par PCR en temps réel (Taqman), dans 3 lignées cellulaires exprimant p53 sauvage et traitées à la Nutlin-1 (figure 10). Les résultats montrent que la transcription de p21 augmente de manière dépendante de la concentration en inhibiteur et en accord avec l augmentation de la concentration en p53, son activateur. Par contre, la transcription du gène p53 n est pas affectée par le traitement à la Nutlin-1. Ces données indiquent que les Nutlins régulent p53 par un mécanisme post-traductionnel. Il peut être remarqué qu aucun témoin négatif n est utilisé pour cette expérience. Ceci peut s expliquer par le fait que la p53 mutée est inactive, et ne permettrait donc pas l activation de la transcription de p21, essentielle à l expérience. Aussi p53 garderait elle-même sa concentration de base et ne subirait pas de changement au niveau transcriptionnel. 14
Figure 11: Inhibition de l interaction p53-mdm2 par la Nutlin. [13] Analyse de l activité antiproliférative et cytotoxique de la Nutlin-1 mesurée par le test MTT dans des lignées cellulaires cancéreuses exprimant une p53 sauvage (bleu: HCT116, RKO, SJSA-1) ou mutante (jaune: MDA-MB-435, SW480). Les cellules sont traitées pendant 5 jours à différentes concentrations. Figure 12: Activité antitumorale in vivo des inhibiteurs de MDM2. [13] Des souris nues (10 animaux par groupe de dose) portant des xénogreffes souscutanées de cancer humain (SJSA-1) d un volume moyen de 185 mm 3 reçoivent 200 mg/kg d une dose orale de Nutlin-3, 2 fois/jour ou une 10 mg/kg de doxorubicine en intraveineuse une fois par semaine pendant 3 semaines. Le volume des tumeurs est mesuré périodiquement pendant la durée du traitement. En carré noir: Nutlin-3 et carré blanc: contrôle En rond noir: Doxorubicin et rond blanc: contrôle 15
Ensuite, l effet de l inhibiteur de MDM2 sur la croissance et la viabilité des cellules cancéreuses est observé (figure 11). Cinq lignées cellulaires différentes, exprimant p53 mutée ou sauvage, sont incubées avec de la Nutlin-1 pendant 5 jours. La viabilité des cellules est mesurée avec le MTT assay. Cette méthode utilise une coloration au 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, et peut être mesurée par spectrophotométrie. Les résultats montrent une activité antiproliférative et cytotoxique concentration-dépendante, et en corrélation avec le statut de p53 dans les différentes lignées cellulaires. La valeur IC 50 des cellules avec p53 sauvage (1,4 à 1,8 µm) est sensiblement plus faible que celle des autres cellules avec p53 mutante (13 à 21 µm), démontrant que la voie de p53 ne peut être activée que dans les cellules exprimant la p53 sauvage. Finalement, la capacité de ces inhibiteurs de l interaction p53-mdm2 à supprimer la croissance de tumeur xénogreffe établie dans des souris est étudiée (figure 12). Pour cette expérience, la Nutlin-3 est utilisée ainsi que la lignée cellulaire SJSA-1 d osteosarcoma humain. La Nutlin-3 est bien tolérée par administration orale à 200 mg/kg, deux fois par jour pendant 20 jours, permettant d atteindre des concentrations dans le plasma au-dessus de son IC 90 déterminé dans la lignée cellulaire correspondante (3,5 µm). Le traitement à la Nutlin-3 chez les souris portant des tumeurs de 100 à 300 mm 3 résulte dans 90% des cas à l inhibition de la croissance des tumeurs, en fonction du mode d administration. De plus, les souris ne présentent pas de perte de poids ou autre anormalité après la fin du traitement [13 ]. Conclusion L interaction entre le suppresseur de tumeur clé p53 et son régulateur négatif MDM2 est un point d intérêt dans la recherche de médicament contre le cancer depuis une dizaine d années. De nombreuses études ont prouvé le concept que la disruption de cette interaction protéine-protéine peut activer la voie de p53 dans les cellules cancéreuses. L identification de molécules chimiques de synthèse antagonistes de MDM2, a permis de réaliser des études in vivo et de renforcer la notion de l interaction p53-mdm2 comme une stratégie potentiellement viable pour traiter le cancer. Cependant de nombreuses questions subsistent concernant le vrai 16
mécanisme de ces molécules pour la thérapie contre le cancer. Aussi, bien qu au moins 50% des tumeurs humaines retiennent leur p53 sauvage, et de ce fait doivent être sensibles à une thérapie d activation de p53, le taux de réponse peut être limité par des problèmes intervenant à d autres niveaux de la voie de p53. Actuellement, il est reconnu que les tumeurs qui répondent le mieux à une thérapie par des antagonistes de MDM2 sont celles possédant p53 et une amplification du gène MDM2. Dans ces cellules, la surexpression de MDM2 est la seule aberration et donc la restauration de la fonction de p53 doit permettre une forte réponse apoptotique. Des études pré cliniques en cours se concentrent sur le rôle du statut de MDM2 et la nature génétique des autres membres de la voie de p53 en réponse à l activation de p53. 17
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