NOYAU INTERPHASIQUE
CYCLE CELLULAIRE C'est l'intervalle de temps s'écoulant entre le moment où une cellule vient de se former (après une mitose) et le moment où elle donne deux cellules filles à la suite d'une nouvelle division. C'est donc une interphase et une mitose: c'est le temps d'une génération à l'échelle cellulaire. Le cycle cellulaire (voir planche 75 du polycopié de cytologie) est subdivisé en plusieurs phases : G1, S, G2, pour l'interphase et M pour la mitose. Phase G (de gap = espace, intervalle) Elle survient dès la fin de la télophase. En raison de la variabilité de sa durée, cette phase détermine la durée du cycle cellulaire. GI = 0 pour les cellules à divisions rapides (cellules jeunes d'embryons, cellules souches de certains tissus, cellules cancéreuses). G: = durée de la vie de la cellule (G1 = G0) pour les cellules ayant perdu leur capacité mitotique (cellules musculaires, globules rouges). G, à durée variable pour les autres catégories de cellules Cette phase se caractérise par un noyau contenant 2Q d'adn. Chaque molécule d'adn correspondant à un chromosome de mitose, n'est présentée qu'en un seul exemplaire et les chromosomes ne sont pas visibles. Cette quantité d'adn reste constante en G1. Pendant cette phase, il y a aussi réactivation dans le noyau de la transcription en ARNm et de la synthèse des protéines dans le cytosol, en particulier celles qui sont nécessaires au bon fonctionnement de la cellule interphasique. Phase S (S pour synthèse) dure 6 à 8h La durée de cette phase est constante pour un type de cellule donnée. Au cours de la phase S, il y a réplication de l'adn grâce à des DNA polymérases. La quantité d'adn est donc doublée. Il y a passage de 2Q d'adn à 4Q d'adn et à la fin de la phase S, chaque molécule d'adn est représentée en double exemplaire correspondant aux deux chromatides filles du chromosome mitotique. Il y a aussi synthèse de protéines dans le cytosol, en particulier des histones qui seront associées à l'adn. Phase G2 Sa durée est également constante mais cette fois-ci le noyau est à 4Q d'adn. Le cytoplasme se prépare à la mitose avec une grande activité de synthèse protéïque: en particulier les tubulines qui serviront à la formation du fuseau achromatique. La phase G2 peut être bloquée par l'action de la colchicine qui empêche la formation des microtubules labiles ou par les rayons X. Phase M C'est la mitose qui est présentée dans les planches 141 à145 du polycopié et dans le film mitose: les 2n chromosomes deviennent visibles et seront répartis dans les deux cellules filles qui auront toutes les 2n chromosomes et 2Q d'adn grâce à la séparation à l'anaphase des chromatides sœurs. De nombreuses protéines assurent la régulation du cycle cellulaire.
LE NOYAU INTERPHASIQUE
DEFINITION Organite spécifique aux cellules eucaryotes, il est délimité par l'enveloppe nucléaire qui sépare son contenu du reste du cytoplasme. Il renferme le nucleoplasme dans lequel baigne essentiellement la chromatine et un ou plusieurs nucléoles. Il est le centre vital de la cellule et il contrôle grâce a l ADN toutes les activités de la cellule. L'ADN constituant essentiel de la chromatine porte les gêner du patrimoine hériditaire ou génome. I. STRUCTURE ET ULTRASTRUCTURE 1. Au Microscope Photonique (MP) Au microscope photonique le noyau a l'interphase apparaît souvent de forme sphérique et de taille variable. On le rencontre généralement en un seul exemplaire par cellule, Il existe toutefois quelques cellules plurinucléées, contenant plusieurs noyaux (Ex. ostéoclastes ou cellules osseuses) et d'autres anucléées avant perdu leur noyau au cours de leur maturité (Ex. hématies ou globules rouges). Remarque Pour mettre en évidence la chromatine, on utilise certaines techniques telles le test de Feulgen, qui permet la coloration de l ADN en violet, ou le test de double coloration de Brachet utilisant le vert de méthyle et la pyronine qui colorent respectivement l ADN en vert et l'arn en rose. 2. Au Microscope Electronique L'observation, des coupes minces au MET et au MEB avec l utilisation de différentes techniques: augmentation de contraste, cryodecapage, coloration négative associées aux traitements des images en 3 dimensions par ordinateur etc. ont permis de montrer "organisation ultrastructurale de: 2.1. L'enveloppe nucléaire (polycopié p17) C'est une portion spécialisée du Réticulum Edoplasmique (RE). Elle est formée de 2 membranes de 6nm d'épaisseur chacune (à structure trilamellaire, asymétrique et mosaïque fluide), séparées par une cavité de 10 a 50 nm en continuité avec celle du RE : l espace périnueléaire. La membrane nucléaire externe porte sur sa face cytosoilque des ribosomes et la membrane nucléaire interne est associée sur sa face nucleoplasmique a une fine couche dense aux électrons correspondant à un réseau de filaments intermédiaires constitués de lamines (voir cytosquelette): la lamina densa. Elle permet un support structural rigide a l enveloppe nucléaire et sert à la fixation des fibres de chromatine à la périphérie du noyau. L'enveloppe nucléaire permet de maintenir la forme du noyau mais assure surtout la protection du matériel génétique. Comme le REG elle est impliquée dans la synthèse de certaines protéines résidentes de l'enveloppe nucléaire et comme le REL elle est un lieu de stockage du calcium. Les complexes des pores nucléaires (polycopié p17 et Figures 1, 2 et 3) L'enveloppe nucléaire est une barrière sélective au niveau de laquelle se trouvent des zones d'interruption: les pores nucléaires. Leur nombre est variable selon le type mais surtout selon l'activité physiologique des cellules, Ils contiennent une structure complexe, le complexe du pore nucléaire (CPN). Il est constitué de 2 grands anneaux de 120nm de diamètre (l'anneau cytosolique et l'anneau nucleoplasmique) délimitant un orifice central ou transporteur central de de 30nm de diamètre. Chacun des 2 anneaux est un assemblage de 8 bras radiaires qui font saillie dans l'orifice central, délimitant 8 canaux latéraux. Un troisième petit anneau est situe à l'intérieur du nucléoplasme. Il semble qu'il existe une interconnexion très stable entre les CPN et la lamina densa, suggérant que la lamina sert aussi d'ancrage pour les CPN
Le transport passif de molécules solubles s'effectue au niveau des canaux latéraux et le transport actif de molécules plus grosses se fait par le canal ou transporteur central. L'enveloppe nucléaire permet aussi l'importation et l'exportation de molécules diverses à travers les CPN et les doubles membranes (Figure 4). Elle assure ainsi le control et la regulation des échanges entre cytosol et le nucleoplasme.
2.2. La chromatine (polycopié p77) Au MET la chromatine se présente sous 2 aspects: - Condensée, dense aux électrons: l'hétérochromatine située essentiellement en périphérie du noyau et un peu autour du nucléole. - Décondensée, claire: l'euchromatine, diffuse ou dispersée dans le reste du noyau. L'application de la technique de l'autoradiographie dont le principe consiste à utiliser des précurseurs radioactifs (voir TP) a montrée la synthèse d'arn au niveau de l'euchromatine et pas dans l'hétérochromatine. Ainsi l'euchromatine est la forme active de la chromatine et l'hétérochromatine la forme inactive. La chromatine intervient dans la division et la croissance cellulaire (voir cycle Cellulaire) II. ANALYSES DES DIFFERENTS CONTITUANTS L'UCD permet d'isoler la fraction noyau (PL 2 Techniques et polycopié p 35). La rupture de l'enveloppe nucléaire après action d'ultrasons ou de chocs osmotiques et un certain nombre d'ucd permettent d'isoler séparément les sous fractions du noyau: l'enveloppe nucléaire, le nucléoplasme, la chromatine et le nucléole. Les sous fractions isolées sont soumises â des analyses aussi bien utrastructurales (à fort grossissement) que biochimiques, celles-ci ont permis d'apporter un complément d'information â l'aspect ultrastructural, à la composition chimique et à l'architecture moléculaire des différents constituants. 1. Le nucléoplasme (Figure 5) C'est un gel visqueux équivalent au hyaloplasme, dans lequel se trouve une matrice nucléaire composée de minces fibrilles protéiques en réseau comportant des granules à l'intersection de ses mailles, une sorte de squelette nucléaire qui maintient la forme du noyau et agit comme un échafaudage sur lequel s'organise la chromatine. Cette matrice sert d'ancrage à l'adn et aux ARN dans les mécanismes de réplication, de transcription et de maturation Le nucléoplasme contient aussi diverses molécules: des protéines variées (enzymatiques au structurales), des ARNm et ARNt, différents types d'ions Ca ++, Na +, K + et Mg ++, des nucléotides, des sous unités ribasomales et un autre réseau protéique sous membranaire à organisation grillagée qui englobe le petit anneau nucléosomique des CPN (Figures I et 2). Figure 5: La matrice nucléaire au MET (d'après David G. Capco Katherine M.Wan et SheldonPenman). 2. La chromatine Après son isolement, son étalement et l'application de la technique de la coloration négative, on peut observer au MET à fort grossissement qu'elle est constituée de 2 types de fibres: - La fibre A de 10 à 11 nm de diamètre, organisée en collier de perle, constituant l euchromatine. - La fibre B de 25 à 30nm de diamètre, beaucoup plus condensée et plus épaisse, constituant l hétérochromatine.
2.1. Composition chimique Elle contient 30 à 35% d ADN ; 30 à 40% de petites protéines basiques comprenant 5 classes d'histones, H1, H2A, H2B, H3 et H4 ; 10 à 25% de protéines acides et 5 à 10% d ARN liés à l'adn au niveau de l'euchromatine. 2.2 Organisation moléculaire (Figures 6, 7a. 7h et 8) 221. La libre A ou euchromatine Dans l'organisation en collier de perles de la fibre A, les perles représentent les nucléosomes ainsi la fibre A correspond a la fibre nucléosomique (Figure 7a).Un nucléosome, disque de 10 à 11 nm de diamètre et de 6 nm de hauteur est un octamère d'histones qui comporte une paire de H2A. H2B, H3, et H4. L'ADN situé a la périphérie s'enroule autour de l'octamère d'histone. Une cinquième histone H1 intervient pour verrouiller l'adn en se liant à chaque nucléosome prés du site où l'hélice d'adn entre et sort de I'octamère d'histone. En sa présence l'adn constitue 2 tours complets. Les nucléosomes sont relies entre eux par l'adn internucléosomique. L'ADN entourant d'histones et l' internucléosomique sont constitués au total d'environ 200 paires de nucléotides. Figure 6: Le nucléosome, unité élémentaire de la chromatine 22.2. La fibre B ou hétérochromatine L'histone H1 constituée par une partie globulaire et de bras correspondant aux extrémités amino et carboxy terminales intervient aussi dans l'empilement des nucleosomes en se liant grâce a sa portion globulaire à un site unique sur un nucléosome et il est supposé que ses bras se déploient pour entrer en contact avec d'autres sites sur l'octamère d'histones des nucléosomes adjacents. Les nucléosomes sont ainsi réunis en une rangée répétitive et régulière organisée en hélice, présentant ainsi une structure d'ordre supérieure en solénoïde, d'où le nom de fibre de solénoïde correspondant à la fibre B (Figure 7b). Figure 7: (a) Chromatine en collier de perles ou fibre A et (b) fibre en solénoïde ou fibre B (Barbara Hankalo et Victoria Foe).
2.3. Le chromosome (polycopie p85 et Figure 8) La chromatine et le chromosome sont deux états morphologiques différents d'un même matériel génétique. Au cours de la mitose la chromatine se condense de plus en plus et de façon plus complexe grâce à la participation de protéines acides qui constituent un squelette de base ( scaffold= échafaudage) autour duquel la fibre solénoïde constitue des boucles qui se condense de plus en plus pour atteindre le maximum au cours de la métaphase. A cc stade le chromosome est 50 000 fois plus court que la molécule d ADN déroulée. 3. Le nucléole C'est une structure plus ou moins sphérique dans le noyau, non délimitée par une membrane (polycopié p77). En nombre défini pour chaque type cellulaire, généralement 1 ou 2 par noyau ou plusieurs (Ex, ovocytes en croissance) ou absent (Ex. spermatozoïdes), il disparaît à la prophase et se reforme à la télophase, pour persister durant toute l interphase. Au MET (Figure 9) le nucléole présente 3 parties relativement distinctes - Le centre fibrillaire CF généralement central (ou plusieurs CF) -Le composant fibrillaire dense CFD entourant le CF - Le composant granulaire CG situé en périphérie des 2 parties précédentes L agencement de ces 3 parties peut toutefois varier selon le type cellulaire (voir TP noyau). 3.1. Composition chimique Le CF contient les séquences intercalaires non transcrites de L'ADN nucléolaire Le CFD contient les séquences transcrites de l'adn nucléolaire en activité, les transcrits ARNr 45S,
Les protéines diverses (protéines ribosomales L «Large» et S «Small» associées aux transcrits ARNr 45S, des histones, de nombreux enzymes etc. Le CG contient les ARNr en cours de maturation associés aux protéines ribosomales L et S, des enzymes et des catalyseurs qui interviennent dans la maturation comme l'arnase et les ribonucléoprotéines ou RNP (ARN + protéine), des petites et grosses sous unités ribosomales en fin de synthèse. Figure 9: Ultrastructure du nucléole. 3.2. Organisation du nucléole (polycopié p87 et Figure 10) Le nucléole contient de grandes boucles d'adn qui proviennent de plusieurs fibres de chromatine ou chromosomes, chacune d'elle contenant le gène d'arnr 45S amplifié: il est répété plusieurs fois en tandem (ou gène redondant) orienté dans un seul sens, séparé chaque fois par une séquence d'adn non transcrite. On appelle chaque boucle du nucléole l organisateur nucléolaire.
3.3. Biogenèse du nucléole Au cours de la mitose ces organisateurs nucléolaires se situent au niveau des constrictions secondaires des chromosomes qui les portent (10 sur 46 dans les cellules humaines polycopié p83). La disparition du nucléole à la prophase est liée à la condensation de la chromatine pour devenir chromosomes et donc à l'arrêt de l'activité des organisateurs nucléolaires. Sa réformation à la télophase est liée à la décondensation des chromosomes qui se transforment en chromatine et à la reprise de leur activité. 3.4. Rôles du nucléole 3.4.1. Biogenèse des sous unités ribosomiques La première fonction fondamentale du nucléole est la biogenèse des sous unités des ribosomes. C'est donc le lieu de formation de ces structures. Cette activité comporte 2 étapes: - Une étape transcriptionnelle: (Figure 11) Dans la zone fibrillaire dense, tous les gènes des ARNr 45S de la totalité des organisateurs nucléolaires du nucléole se mettent a transcrire des ARNr 45S dans le sen(3' ' 5)grâce à des ARN polymérases. A ces transcrits d'arnr 45S sont associées des protéines ribosomales L et S (polycopié p87), qui ont migrées dans le noyau après leur synthèse dans le cytoplasme. Les transcrits d'arnr 45S associés à leurs protéines L et S passent dans la zone granulaire tout en subissant une maturation (fragmentation) sous l'action des ARNases et des RNP, pour former différents ARNr matures: ARNr 28S, ARNr 18S et ARNr 5,8S. Remarque: Dans les préparations de la chromatine étalée (régions du nucléole) grâce à la disposition périodique des gènes des ARNr (en tandem) et leur transcription très rapide, ils peuvent être facilement observés. Les ARN polymérases et les transcrits qui leur sont associés sont groupes d'une manière si dense (environ 100/gène) que les transcrits s'écartent perpendiculairement à l'adn et donnent ainsi à chaque unité de transcription une allure caractéristique en «arbre de noël» ou plume d'oiseau. Comme pour toute transcription (quelque soit le type d'arn) le sommet de chaque arbre ou plume correspond sur l'adn au point de départ où débute la transcription et où les transcrits sont donc les plus courts, alors que l'autre extrémité de l'unité de transcription des ARNr est nettement délimitée par la disparition soudaine des molécules d'arn polymérase et de leur transcrits. Figure 11: Ultrastructure du gène amplifié d'arnr (D'après Ulrich Scheer). - Assemblage des sous unités des ribosomes: (Figure 12) L'assemblage des ARNr matures associés à leurs protéines L et S s'effectue dans la zone granulaire: l'arnr 18S et 30 à 33 protéines S constituent la petite sous unité ribosomale 40S. Les ARNr 28S et 5,8S et 40 à 50 protéines L auxquels vient s'associer un ARNr 55, synthétisé dans le noyau en dehors du nucléole (nucléoplasme), constituent la grosse sous unité ribosomale 60S. Les 2 sous unités ribosomales quittent séparément le noyau en passant par les pores nucléaires au cytoplasme, où elles s'associent grâce à l'arnm pour la synthèse des protéines. 3.4.2. Autres fonctions du nucléole Récemment, le nucléole a été impliqué dans d'autres fonctions cellulaires, comme l'assemblage ou la maturation de complexes impliquant des ARN différents des ARN.r tels le SRP (signal recognition particule = particule de reconnaissance du signal) qui intervient dans synthèse de protéines ou des ARN de transfert etc. Il intervient aussi dans le cycle cellulaire ou le vieillissement.
Figure 12 : Fonction du nucléole dans la synthèse des ribosomes Pour en savoir plus: 1- Alberts B., Bray D., Lewis.J., Raff M., Roberts K. et Watson J. 1989- biologie moléculaire de la cellule. 2eme édition, Edit. Flammarion Medecine-Sciences. 2- Beaudouin J. et Daigle N. 2002- La dynamique de l'enveloppe nucléaire. Médecine/ Science, N 1, Vol. 18, pp,4 I-43. 3- Cau P. et Seite R. 2002- Cours de biologie cellulaire (les cours du PCEM), 3eme édition, Edit. Ellipses. 4- De Robertis E., Nowinski W.et Saez F. 1974- Biologie Cellulaire, Traduction de la 5 édition de (Cell Biology, éd. Les pesses de l'université Laval. 5- Hernandez-verdun D. et Louvet E. 2004- Le nucléole: Structure, fonction et maladies associées. Médecine/Science N 1, Vol.20, pp.37-44. 6- Karp G. 2004- Biologie cellulaire et moléculaire (l et 2eme cycles LMD Sciences de la vie), 2eme édition, Edit. DeBoeck 7- Strachan T. et Read A.P. 1996-, Génétique moléculaire humaine, Édit. Flammarion Médecine- Science. 8- Wehner R. et Gehring W. 1999- Biologie et physiologie animale. 23eme édition, Edit. DeBoeck université Thieme Verlag.
LES RIBOSOMES I- Définition: Les ribosomes sont de petites particules compactes présentes dans toutes les cellules, en très grand nombre. Ce sont des complexes ribonucléoprotéïques majeurs de la cellule aussi bien procaryote qu'eucaryote, qui catalysent l'assemblage des AA dans un ordre prédéterminé et donc l'allongement des polypeptides = synthèse des protéines. II- Ultrastructure: Au MET ils apparaissent comme des particules globulaires distinctes denses aux e-, de 14 à 23 nm de diamètre. Ils existent dans les cellules: * soit libres dans te hyaloplasme: sous forme de deux sous unité séparées lorsque inactifs regroupés en chapelets sur l'arnm constituant des polyribosomes (ou polysomes) lorsque actifs. * Soit attachés en polyribosomes sur la face externe (face cytosolique) de la membrane des citernes du REG et de l'enveloppe nucléaire. On les rencontre aussi dans les mitochondries et les chloroplastes. III- Mise en évidence: La technique de coloration négative qui consiste à augmenter le contraste au MET par utilisation d'une substance dense aux e - tel que l'acide phosphotungstique (polycop.p.31), a permis de révéler que les ribosomes sont des édifices compacts et relativement denses, constitués de 2 sous unités de forme et de taille différentes, qui s'adaptent l'une à l'autre grâce à la présence d'une molécule d'arnm pendant leur activité qui est ta traduction. IV - Composition chimique I- Isolement (voir planche des différentes méthodes d'isolement): Broyage cellulaire homogénat 3 UCD de surnageant microsomes (fragmentation du REG en petites vésicules avec ribosomes) dans le dernier (31ème) culot -----addition de détergent au 3ième culot détachement des ribosomes des membranes des microsomes 4éme UCD à vitesse très élevée ribosomes libres des microsomes dans culot 4, UCD dans un gradient de concentration de saccharose. Les ribosomes sont ensuite caractérisés selon leur vitesse de sédimentation dans le gradient de saccharose par leur coefficient de sédimentation exprimé en unité de Svedberg ou S. 2- Résultats de l'analyse: Les ribosomes de toutes les cellules comprennent donc une grosse sous unité (ou gros élément) et une petite sous-unité (ou petit élément). Celles-ci renferment des molécules d'arn ribosomiaux (ARNr) de diverses longueurs pour 2/3 (env.65%) et un certain nombre de protéines différentes pour 1/3 (env.35%). Les protéines ainsi que les ARNr sont différents d'une sous unité à l'autre. La grosse sous unité comprend une grande molécule d'arnr principale, la petite sous unité, une petite molécule d'arnr. On désigne la taille des sous unités et leur molécule d'arnr en unité de Svedberg(S), une mesure de la vitesse de sédimentation des particules en suspension après leur ultracentrifugation dans un gradient de saccharose (Unité ni additive ni rigoureusement proportionnelle à la taille des molécules ou des
particules). La grosse sous unité comprend des protéines différentes entre elles représentées par la lettre L (pour large en anglais= gros), la petite sous unité, d'autres protéines, différentes aussi entre elles représentées par la lettre S (pour small=petit). Les ribosomes des cellules procaryotes et des cellules eucaryotes ont une structure et une fonction semblables. Cependant la longueur des molécules principales d'arnr,.la teneur en protéines de chaque sous unité et; par suite, la taille des éléments diffèrent entre procaryotes et eucaryotes. Un trait remarquable du ribosome est qu'on peut le reconstituer in-vitro à partir de ces constituants ribonucléoprotéiques. En effet en mélangeant dans des conditions choisies les ARNr et les protéines ribosomiales purifiées, on obtient un ribosome fonctionnel. Grosse S/U (Gros élément) Petite S/U (Petit élément) Ribosome assemblé (actif) PROCARYOTE 50S ARNr 23S+5S entre31 à 34 protéines L 30S ARNr16S 21 protéines S 70S taille réduite moins nombreux EUCARYOTES 60S ARNr28S+5.8S±5S entre 45 à 50 protéines L 40S ARNr18S entre30 à 33 protéines S 80S taille plus grande plus nombreux REMARQUE : On trouve aussi des ribosomes dans les chloroplastes et les mitochondries; les ribosomes des chloroplastes sont semblables aux ribosomes des procaryotes (70S) ; les ribosomes des mitochondries possèdent de plus petits ARNr et moins de protéines que les ribosomes des procaryotes. V -Organisation moléculaire ou structure du ribosome La microscopie électronique à haute résolution couplée à des analyses immunologiques (marquage in situ par des anticorps spécifiques) a révélé que la structure du ribosome est très volumineuse et complexe. Sa structure tridimensionnelle complète (de sa grosse S/U unité et de sa petite S/U) n'a été déterminée que récemment Elle a permis de montrer que ce sont les ARNr à configuration tridimensionnelle très précise et non les protéines ribosomiales qui sont responsables de la structure globale du ribosome, de sa capacité à positionner l'arnt sur l'arnm et de son activité catalytique pour la formation de liaisons peptidiques. Ainsi la forme générale du ribosome est déterminée par le repliement des ARNr. Les protéines ribosomiales sont généralement localisées à sa surface et remplissent les fentes et les crevasses formées par les ARNr repliés, liées par des liens non covalents aux ARNr et entre elles. Le rôle principal des protéines ribosomiales est essentiellement structural puisqu'elles semblent jouer un rôle de stabilisatrices des ARNr tout en permettant les variations de conformation des ARNr
nécessaires à leur catalyse efficace de la synthèse des protéines. Il a été ainsi identifié sur les ARNr les sites où viennent se fixer l'arnm et l'arnt tous en jeu dans le mécanisme de synthèse protéique. Ainsi le ribosome possède 4 sites de liaisons pour les autres molécules d'arn, situés exclusivement sur les ARNr: 1site de liaison de l'arnm situé sur ARNr du petit élément (petite sous unité) 3sites de liaison des ARNt situés en grande partie sur l'arnr du gros élément(gsu) le site de liaison de l'aminoacyl-arnt= site A, qui fixe la molécule d'arnt entrante, portant un nouveau acide aminé. Le site de liaison du peptidyl-arnt =site P, qui fixe la molécule d'arnt portant le polypeptide en croissance, c'est le site où se forme une nouvelle liaison entre 2 AA traduits. Ce site catalytique de la formation de la liaison peptidique est clairement formé par l'arnr 23S. La peptidyl transférase n'est donc pas une enzyme protéique ribosomiale mais un ARNr. Et enfin le site de liaison de l'arn t vide sortant=site E (Exit). Ainsi ce sont les molécules d'arnr qui ont un rôle catalytique comme des enzymes et non les Protéines; pour cette raison on considère les ribosomes comme étant des ribozymes V1 Fonction des ribosomes et molécules impliquées 1- Fonction : -la fonction des ribosomes est la traduction ou synthèse des protéines, dont les différentes étapes résumées sont les suivantes: La petite S/U (le petit élément) fait correspondre les ARNt aux codons de l'arnm La grosse S/U (le gros élément) catalyse la formation des liaisons peptidiques qui lient en semble les AA en une chaine polypeptidique. Les 2 éléments se rassemblent sur une molécule d'arnm à son extrémité 5' pour débuter la traduction. Le ribosome se déplace le long de l'arnm en traduisant codon par codon la séquence nucléotidique dans le sens 5 3' en une séquence d'aa, utilisant les ARNt comme adaptateurs pour ajouter l'ordre correcte de chaque AA à l'extrémité de la chaine polypeptidique en croissance. Les 2 éléments se séparent quand la synthèse de la protéine ou du polypeptide est achevée. 2. Molécules impliquées dans la traduction : les molécules impliquées dans les différentes étapes de la synthèse protéique sont succinctement: * Des molécules d'arnr constituant le ribosome et dont certaines jouent le rôle d'enzyme Une molécule d'arnm venue du noyau portant l'information génétique sous forme de codons ou triplets de bases. Des molécules d'arnt venues aussi du noyau avec l'anticodon et portant les AA activés, provenant du cytosol Les AA présents dans le cytosol Plusieurs types de facteurs cytosoliques protéines enzymatiques: + Facteurs responsables de l'activation des AA et de leur accrochage aux ARNt (différents entre procaryotes et eucaryotes). + Facteurs intervenant à plusieurs étapes de la traduction : facteurs d'initiation, facteurs d'élongation et facteurs de terminaison. - L'ATP (Adénosine triphosphate) e-gtp (guanosine triphosphate) REFEREN CES: -La cellule par Alberts Bray, Lewis, Raff, Roberts et Watson. Second édit, 1990; -L'essentiel de la biologie cellulaire: Introduction à la biologie moléculaire de la cellule par Alberts, Bray, Lewis, Raif et Walter. VA (1998), VF (1999), -Biology par Raven et Johnson. 5éme édit. 1999.
Biologie moléculaire de la cellule par Lodish, Baltimore, Berk, Zipursky,Matsudaira et Darnell. Deboeck université. édit. 2000. Chapitre 4 p.128-140. -La cellule par Cooper G.MDeboeck université édit. 1999. chapitre 7 p.273-311, -Biologie par Campbell et Reece. Deboeck université édit 2004.chapitre 7 p. 11.1-122, chapitre 17 p337-353. -Biologie Moléculaire de la cellule par Alberts, Johynson, Lewis, Raif, Roberts et Walter.4eme édit-2004. Médecine- Sciences Flammarion.chapitre 6 p335-374. -Bologie cellulaire: des molécules aux organismes (cours, questions de révisions et QROC) par Callen J.C. (collabo. Perasso R.).2005, 2 édit. Dunod.chapitre 4, p.83-100.
LE SYSTEME ENDOMEMBRANAIRE DEFINITION Le système endomembranaire, présent uniquement dans les cellules eucaryotes, est l'ensemble des cavités cytoplasmiques limitées par des membranes intercommunicantes entre elles par l'intermédiaire de vésicules ou canalicules. Composants du système endomembranaire Les différents compartiments du système endomembranaire sont: le Réticuhnn Endoplasmique (RE), l'appareil de Golgi, les lysosomes, les phagosomes-endosomes et la vacuole végétale. A - RETICULUM ENDOPLASMIQUE (R.E.) Définition C'est un ensemble de membranes délimitant des cavités sous forme de citernes ou des tubules. II peut être dépourvu de ribosomes, c'est le réticulum endoplasmique lisse (REL) ou porteur de ribosomes, c'est le réticulum endoplasmique granulaire (REG) qui est en relation avec l'enveloppe nucléaire (polycope p103). I- Ultrastructure de la membrane du R.E Au MET la membrane est tripartite, dépaisseur plus petite que la membrane plasmique (6nm). Au MEB, il y a présence de particules globulaires intramembranaires. II-Composition chimique 1- Technique d'isolement: Le RE, est isolé à partir du 3éme culot de l'ultracentrifugation différentielle (polycopié p37, planche technique 2). Dans ce 3ème culot le RE, forme de petites vésicules= microsomes (rugueux, lisse). Après centrifugation dans un gradient de densité de saccharose, il y a séparation entre microsomes rugueux et microsomes lisses. Microsomes rugueux + détergents, après centrifugation, permet de séparer les ribosomes des membranes. Microsomes lisses (origine REL, appareil de Golgi et membrane plasmique) après centrifugation dans un gradient de concentration de saccharose, les microsomes lisses se séparent en fonction de leur densité. 2- Résultats: a- La membrane Elle est constituée: de protéines (70%) surtout des protéines enzymatiques (glycosyl transférase, cytocbmme P450, glucose 6 phosphatase etc.), de lipides (30%), les phospholipides forment une bicouche avec un pourcentage important d'acides gras insaturés: (fluidité importante) et du cholestérol présent en liés faible quantité, de glucides. Les chaînes glucidiques attachées aux protéines et aux lipides se trouvent sur le côté luminal. Architecture moléculaire de la membrane: mosaïque fluide asymétrique (polycope p107). b- Le contenu de la cavité: Il est différent d'une cellule à l'autre, Exemples: la cavité du REG de la cellule du pancréas exocrine contient des protéines enzymatiques, celle du REL de la cellule lutéale contient des hormones stéroïdes, la cavité du réticulum sarcoplasmique de la cellule contient du Ca ++.
III- Fonctions du RE 1- Fonctions du REG Elles ont été mises en évidence en 1960-1964 par l'expérience de Palade (fig.1) qui a démontré qu ne cellule est capable de synthétiser et de transporter des protéines dans son cytoplasme par l intermédiaire de vésicules. L expérimentateur utilise une technique de marquage en pulse-chasse et exploite les résultats en autoradiographie Il fournit aux cellules pancréatiques un précurseur de protéines: la leucine radioactive, marquée au tritium pendant un temps court (" pulse") puis ensuite fournit le même précurseur, non radioactif, et beaucoup plus concentré ("chasse"). Les premières protéines sont marquées, les suivantes ne le sont pas et on peut ainsi suivre le devenir et le trajet des protéines marquées et les repérées grâce à l autoradiographie. Cette expériences a mis en évidence le trajet suivi par les protéines exportées vers l'extérieur de la cellule (ici enzyme pancréatique): surface du REG, lumière du REG, lumière des saccules golgiens, vésicules golgiennes et exocytose â l extérieur de la cellule. a - Synthèse et translocation des protéines La synthèse des protéines commence toujours dans le cytosol par l'initiation et le début de l'élongation. Deux types de protéines peuvent être synthétisées au niveau du REG: les protéines solubles ou luminales (Fig.2) et les protéines hydrophobes qui seront insérées dans la membrane (Fig.3B.C). a-1- Cas des protéines luminales (fig.2) Etape l La séquence signal est constituée par les premiers acides aminés hydrophobes synthétisés dans le cytosol situés à l extrémité N-terminal de la protéine. Elle permet l'adressage de la protéine synthétisée. Dès quelle émerge du ribosome, cette séquence est reconnue par un complexe ribonucléoprotéique présent dans le cytosol: la Signal Recognition Particule (SRP) ou Particule Signal de Reconnaissance qui se fixe sur la séquence signal et provoque un arrêt temporaire de la traduction. Cet arrêt favorise la fixation du SRF sur le récepteur du SRP de la membrane du REG. Etape 2 Ce récepteur capte le complexe ribosome-arnm-srp, favorisant son interaction avec le translocon (complexe protéique de translocation de la membrane du REG). La grande sous unité du ribosome est fixée sur la membrane du REG au niveau de son récepteur. Le translocon s'ouvre alors par un canal hydrophile permettant le passage de la protéine en cours de synthèse vers la lumière (translocation) et la traduction peut reprendre. La SRP se sépare alors de son récepteur et de la séquence signal. Etape 3 La protéine continue son élongation et s'engage dans le canal du translocon. Etape 4 Lorsque la protéine débouche dans la lumière du REG, une peptidase du signal coupe la séquence signal. La protéine qui se retrouve dans la lumière est une protéine luminale Au fur et à mesure que la protéine apparaît dans la lumière du REG, elle est prise en charge par des protéines chaperons (jouant un rôle dans le translocation et dans les modifications posttraductionnelles). a-2- Cas des protéines membranaires (fig3 B.C) Les protéines destinées aux membranes subissent aussi un adressage par la séquence signal. Mais la translocation des protéines destinées à la membrane est bloquée par une séquence très hydrophobe qui déstabilise le translocon et la protéine reste insérée dans la membrane du REG: c'est une protéine membranaire.
b-modifications post traductionnelles des protéines b-1- N- glycosylation Au cours de leur synthèse, les protéines peuvent être glycosylées : un "arbre oligosaccharidique" très riche en mannose est transféré en bloc sur la protéine en cours de traduction par une oligosaccharidyl transférase sur le groupement amine de l asparagine. b-2 Modifications des sucres Cet arbre oligosaccharidique est aussitôt modifié par les enzymes du REG. b-3- Etablissentent de ponts disulfures entre acides aminés soufrés. b-4- Association entre protéines et lipides membranaires (cas des protéines intégrées ancrées dans l'une ou l'autre des bicouches lipidiques (voir Fig.1 de membrane plasmique). e- Sortie du REG par un transport vésiculaire Ce sont des vésicules qui bourgeonnent du REG et qui vont fusionner avec la face cis de l'appareil de Golgi. Ces vésicules ont une membrane issue du REG et peuvent donc transporter les protéines luminales et les protéines membranaires intégrées. Le compartiment intermédiaire entre REG et appareil de Golgi est appelé Endoplasmic Reticulum-Golgi intermediate Compartment ou ERGIC (Fig.4). En fonction de certaines séquences, les protéines transmembranaires ou luminales dites "résidentes du REG (spécifiques du REG) ne peuvent sortir du REG. Si elles ont été transportées par erreur dans I'ERGIC par erreur, leur retour vers le REG est assuré. 2-Fonctions du REL: a- Synthèse des phospholipides Les phospholipides sont synthétisées grâce aux enzymes transmembranaires du REL dont le site actif est orienté vers le cytosol. Les lipides sont ensuite répartis dans les bicouches par des flipases, intégrées dans la membrane du REL, permettant ainsi leur basculement de I'hémi couche cytosolique vers l'hémicouche luminale. Le REL est le principal fournisseur de phospholipides pour les membranes cellulaires. b-synthèse des hormones stéroïdes à partir de la prégnénolone synthétisée dans la mitochondrie grâce au cytochrome P450. c- Détoxification Grâce au cytochrome P450, il y a hydroxylation des produits toxiques. Devenus hydrosolubles, ces produits seront facilement transportés et éliminés. d-accumulation et libération de Ca++ B- APPAREIL DE GOLGI (A.G.) Définition C'est un organite situé au voisinage du noyau, proche du matériel péricentrosomal. II est constitué par des empilements de saccules aplatis, associés à de nombreuses vésicules (poly 103).
1-Structure et Ultrastructure a- Structure: Au microscope photonique, après imprégnation au nitrate d'argent, Golgi a mis en évidence de petites écailles à proximité du noyau. b- Ultrastructure: b-1- organisation: Au M.E.T, il y a empilement de saccules (comme une pile d'assiettes) et des petites vésicules. Chaque empilement de 4 à 8 saccules est un dictyosome. En moyenne on compte environ 20 dictyosomes par cellule. Chaque dictyosome comporte des saccules cis (proches du RE), face d'entrée alimentée par le RE, des saccules médians et des saccules trans (face de sortie) en continuité avec un réseau de canalicules appelé le réseau trans- golgien ou T.G.N. (Trans Golgi Network) (Fig.4). b-2-- Caractéristiques des membranes golgiennes: Au MET membrane tripartite, au MEB présence de particules globulaires intégrées. L'épaisseur de ces membranes est variable et intermédiaire entre celle du REG et celle de la membrane plasmique (saccule cis 6 nm et saccule trans 7,5 nm). II- Composition chimique 1- Technique d'isolement (polycop. p37 et 103, Planche technique 2) Broyage brutal d'un fragment d'organe + U.CD. -> le 3ème culot contient des microsomes (voir R.E.), broyage aménagé (doux) + U.C.D. - le 3èm culot contient des saccules empilés. 2- Résultats de l'analyse chimique a- Membranes Lipides: taux intermédiaires entre celui de la membrane de RE et celui de la membrane plasmique. La longueur des chaînes d'acide gras, leur degré de saturation et par conséquent leur fluidité sont également intermédiaires entre membrane du RE, et membrane plasmique. Protéines: pourcentage intermédiaire entre le % des protéines de la membrane du RE et le % des protéines de la membrane plasmique. On distingue les protéines communes aux membranes du RE et de l'a.g. (glycosyl- transférases, cytochrome b5 réductase) et des protéines particulières aux membranes de 1 A-G. (les sulfo-transférases, les phosphatases). Glucides : la quantité est négligeable et situés sur la face luminale. Architecture moléculaire des membranes: Ce sont des mosaïques fluides asymétriques. b- Le contenu des cavités: Mêmes produits que ceux des cavités de RE, à des concentrations différentes. III- Fonctions (fig. 4) 1- Transport L ERGIC délivre les protéines et les glycoprotéines, les lipides et les glycolipides au cis-golgi qui sont ensuite transportés à travers l'appareil de Golgi, où ils passent du cis-golgi au Golgi médian puis vers le trans-golgi pour finalement atteindre le trans-golgi network (TGN). Ce transport est effectué grâce à des vésicules qui bourgeonnent des différents compartiments.
Mannose = ose Glc NAc = N acetylglucosamine Gal= galactose NANA= Acide N Acétyl Neuraminique
2-Gycosylation définitive des protéines a- Modifications des sucres Au cours du transport du REG vers le saccule cis et le saccule médian, les glycoprotéines subissent des modifications de leurs arbres oligosaccharidiques N liés. b- 0-Glycosylation Il y a construction d'oligosasaccharides O-liés dans les saccules médians et trans: ces oligosaccharides sont bâtis, oses par oses sur la protéine au niveau du groupement hydroxyle d un résidu sérine ou thréonine, grâce aux glycosyltransférases. 3-Phosphorylation du Mannose 6P dans les citernes cis. Cette étape ne s'effectue que pour les glycoprotéines (enzymes) destinées aux lysosomes. 2-4-Sulfatation dans les citernes trans. Il y a addition d'un groupement SO 4 sulfotransférases. grâce aux 5-Modification des lipides Certains lipides assemblés au niveau du REL sont modifiés pour former les glycolipides. 6- Stockage et libération du calcium 7-Formation des vacuoles de macroautophagie (voir 1ysosomes) La citerne membranaire encerclant l'organite à détruire peut provenir de citerne issue du trans, soit du REL. 8- Tri et maturation (Fig. 5 et 6) Ces deux phénomènes s'effectuent en même temps. Le tri se déroule au niveau du réseau transgolgien (TGN). Les vésicules en formation sont pourvues d un manteau cytoplasmique formé par des protéines et sont appelées vésicules recouvertes. Ce manteau reconnaît les signaux portés par la substance à transporter et permet sa concentration dans une zone restreinte (tri). De plus il permet le bourgeonnement de la membrane en vésicules. Les vésicules peuvent suivre deux voies: a- Voies de sécrétion (Fig.5et 6) La voie de sécrétion constitutive permet de déverser continuellement vers l'extérieur (par exemple sécrétion permanente des protéines de la matrice extra cellulaire). Ces vésicules sont recouvertes par un manteau de coatomères. - La voie de sécrétion régulée: le matériel de sécrétion soit hormonal (ex. insuline) ou de type exocrine (ex. enzymes du pancréas), subit une maturation au cours de son transport dans des vésicules recouvertes d'un manteau de clathrine et de protéines d'adaptation. Les vésicules augmentent de taille et forment des grains de sécrétion mâtures. Ce type de sécrétion après un signal selon les besoins. b- Voie endosomale, lysosomale Elle concerne les protéines pourvues d'un mannose 6P (M6P), mannose qui a été phosphorylé au niveau du saccule cis. Ces protéines luminales M6P reconnaissent un récepteur membranaire et l'ensemble est adressé aux lysosomes en passant par un compartiment intermédiaire endosomal caractérisé par un pli relativement acide 5 à 6. Les vésicules, déstabilisées par le ph acide perdent leur récepteur mannose 6P qui est recyclé vers le TGN. On obtient une vésicule, dépourvue de récepteur M6P, contenant des hydrolases acides et dont la lumière est à ph acide. Quelle que soit la voie suivie par les vésicules, elles perdent leur manteau avant d'atteindre leur destination.
Les vésicules dont la membrane est riche en cholestérol, en phospholipides en glycoprotéines liées à un GPI sont recouvertes de cavéoline, conservent ce manteau de cavéolin et par exocytose, elles insèrent dans la membrane plasmique des microdomaines riches en lipides (Fig.5). c- L'adressage des vésicules C'est un phénomène complexe moléculaire en voie de découverte faisant intervenir de nombreuses protéines. V1- Conclusion: Biogenèse membrane plasmique (Polycop. P107)
C- Compartiment endosomal Le compartiment endosomal (polycopié p.61) étudié en partie dans les échanges avec déformation de la membrane plasmique, fait partie du système endomembranaire. Les premiers endosomes formés juste après l'endocytose, proches de la membrane plasmique, sont appelés endosomes précoces (Fig.8). Leur fonction consiste à trier les molécules ingérées et dans le cas de l'endocytose par récepteurs ils jouent aussi un rôle dans le recyclage des récepteurs vers la membrane plasmique (CURL). Les endosomes qui contiennent la molécule triée, rapprochés du noyau, sont appelés endosomes tardifs (Fig.8). Ils évoluent en lysosomes. D- Compartiment lysosonial Définition: Découverts pour la première fois par De Duve grâce à leur fonction, ce sont des compartiments du système endomembranaire de forme variable, Ils renferment des enzymes bydrolytiques (hydrolases acides) permettant la digestion de particules et de molécules extracellulaires ingérées ou intracellulaires de petites tailles solubles et d'organites cellulaires vieillis ou inutiles. I- Ultrastructure au MET Ils apparaissent comme des vésicules de formes et de tailles variables de 0.05 à 0.5µm de diamètre selon le matériel ingéré. Ils peuvent être identifiés par des techniques cytochimiques grâce à une enzyme présente dans leur membrane la pbosphatase acide qui forme un précipité de phosphate de plomb dense aux e- (voir TP N 7). II- Composition chimique 1- technique d'isolement (Planche technique 2) Membrane lysosomale 2 UCD Choc osmotique Homogénat cellulaire Lysosomes 2 sous fractions Culot 2 UCD Contenu cavité lysosomale 2- Résultats a- la membrane C'est une membrane particulière car la plupart de ces protéines sont inhabituellement hautement glycosylées du coté luminale pour la protéger des hydrolases acides contenues dans la cavité. Les protéines membranaires sont de différents types (Fig.7): - des protéines enzymatiques (ex pbosphatase acide) et non enzymatiques ainsi que des perméases, transporteurs des matériaux à dégrader de petites tailles du cytosol et des produits terminaux de la digestion de macromolécules (ex. A.A., nucléotides, sucres simples etc...). - Des ATPases à protons (H + ) qui pompent les H + dans la cavité du lysosome, maintenant son PH très acide. b- Contenu de la cavité Elle contient environ 40 types d'enzymes digestives hydrolytiques (hydrolases acides), qui dégradent les protéines, les acides nucléiques, oligosaccharides et les phospholipides. Leur activité est optimale à ph5.
Figure 7 : les constituants d'un lysosome III- Origine des matériaux à dégrader et biogenèse «possible*» des lysosomes (Fig.8 et polycopié p 119) Les matériaux à dégrader suivent en fonction de leur origine des voies différentes vers le stade lysosome. ils peuvent avoir 2 origines: 1- ExtraceIluIaire : voie hétérophagie Dans ce cas, ils sont ingérés par phagocytose ou par endocytose. Ils sont alors contenus dans des phagosomes ou dans des endosomes précoces à ph neutre (7.4).Cependant leur ph diminue progressivement à cause des ATPases à H + apportées par la fusion de vésicules golgiennes (appelées anciennement lysosomes primaires), provenant du TGN et renfermant dans leur cavité quelques hydrolases acides. Les endosomes précoces se transforment alors en endosomes tardifs à ph 6.5. De nombreuses vésicules golgiennes affluant du TGN continuent à fusionner avec les endosomes tardifs, augmentant ainsi le nombre des ATPases à H + et des hydrolases acides, permettant alors la conversion des endosomes tardifs en lysosomes à ph5. Des vésicules golgiennes à membrane riche en ATPases à H + et en hydrolases acides dans leur cavité fusionnent avec le phagosome qui se convertit aussi mais directement en lysosome à ph5. *Remarque : La transformation des phagosomes et des endosomes tardifs en lysosomcs est hypothétique. 2-Intracellulaire: voies autophagiques a- Micro autophagie Entrée directe dans le lysosome de petites molécules solubles du cytosol (ex peptides) via des perméases. b- Macro autophagie Création d'autophagosome (ou vacuole autophagique) formé par l'englobement (séquestration) d'organite(s) et d'un peu de cytosol par une citerne membranaire provenant de citerne soit du REL ou de l'appareil de Golgi (saccule Trans ou du TGN). Quelque soit son origine, cette citerne membranaire contient dans sa cavité quelques hydrolases acides qui deviennent actives après changement du ph intra cavitaire, grâce semble-t-il à la présence d'atpases à H + dans la membrane de la citerne. La digestion débute donc dans l'auto phagosome et s'achève dans le lysosome avec lequel il a fusionné ou en quoi il s'est converti. e- Crinophagie C'est une forme d'autophagie qui concerne l'élimination des grains de sécrétion (sécrétion régulée) qui ne sert plus ex. prolactine.
IV- Devenir des lysosomes (Polycopié p. l19) Les lysosomes âgés, dépourvus d'hydrolases fonctionnelles, constituent des corps résiduels. Le plus souvent ces corps résiduels libèrent leur contenu à l'extérieur de la cellule par exocytose: c'est la défécation cellulaire. Mais ils peuvent aussi persister dans la cellule toute sa vie. V- Fonction des lysosomes (Fig.9) Toutes les familles de molécules biologiques sont dégradées en métabolites élémentaires qui repartent vers le cytosol grâce à des protéines transporteurs de la membrane lysosomale. Ainsi les lysosomes jouent un rôle fondamentale dans la digestion cellulaire, la destruction des corps étranger et donc dans la nutrition cellulaires entre autres fonctions. Pour en savoir plus Ouvrages BASSAGLIA Y., 2001- Biologie cellulaire, Editions Maloine, Paris: 41-66. CAU P. et SEITE R., 2002- Cours de biologie cellulaire. Editions Ellipses, Paris: 312-383. Campbell J. et Reece M., 2004- biologie. Second édition, De Boeck université. Karp G. 2004 - biologie cellulaire et moléculaire. Second édition, De Boeck université MAILLET M., 2006- Biologie cellulaire, Editions Masson Paris. Articles ANTONY B., 2002- Contrôle de l'assemblage des manteaux protéiques COP par les petites protéines G Arf et Sar. MIS, 18: 1012-1016. BENICHOU S; BENMERAH A., 2003-Protéines Nef du VIII et dk3/k5 du virus associé au sarcome de Kaposi: des "parasites" de la voie d'endocytose. M/S, 19: 100-106. COURVALIN J.C., RABOUILLE C., 2002 - Réorganisation des compartiments intracellulaires membranaires pendant la mitose. M/S, 18: 1017-1026. GALLI T., MARTINEZ-ARCA S., PAUMET F., 2002- Mécanisme de la fusion membranaire. M/S, 18: 1113-1119. TIXIER-VIDAL A., 2002- Les compartiments membranaires de la cellule eucaryote. M/S, 18 1004-1011.
E- LA VACUOLE I- Définition La plupart des cellules végétales contiennent une ou plusieurs vésicules très grosses remplies de liquide appelées vacuoles. L'ensemble des vacuoles d'une cellule constitue l'appareil vacuolaire ou vacuome qui peut occuper selon le type cellulaire 30 à 90 % du volume cellulaire. Il fait parti du système endomembranaire. II- Structure et ultrastructure 1- au MP: La vacuole est limitée par une membrane continue appelée tonoplaste; celui-ci délimite une solution interne dite suc vacuolaire (colorée en rose ou autres couleurs selon le ph ou incolore). 2- au MET: Le tonoplaste est une membrane biologique, à structure trilamellaire, asymétrique (le feuillet dense cytosolique est plus mince que le feuillet dense luminale: présence d'un revêtement fibreux). 3- au MEB: Présence de particules globulaires après cryodécapage. III- Composition chimique 1- Isolement : tissu végétal plasmolysé protoplastes vacuoles digestion des parois choc osmotique + centrifugation ou thermique UCD.. vacuoles éclatées 2 sous fractions : tonoplaste et suc vacuolaire, Centrifugation 2- Résultats de l'analyse chimique: 2-1- le tonoplaste: 3 types de molécules (lipides, protéines et glucides) (Fig. 1). - lipides: phospholipides et stérols (stigmastérol et sitostérols). - protéines : grande diversité (structurales, enzymatiques et transporteurs). - glucides: revêtement fibreux (chaînes polysaccharidiques), non considéré comme le cell coat (g1ycocalyx). 2-2- le suc vacuolaire: contient une grande diversité de composés formant avec l'eau des solutions aqueuses dont la concentration varie en fonction de l'espèce végétale, de la fonction et de l'état physiologique (fruit, graine, fleur...) de la cellule, exemple: le grain d'aleurone présent dans la graine, riche en protéines cristallisées ( Polycopié p. 121). 1V- Architecture moléculaire (Fig. 1) Fig. 1: Constituants et architecture moléculaire du tonoplaste. AP, ATPase; EV, groupe enzymatique vectoriel; P, pore protéique-, T1 et T2, transporteurs spécifiques ; PP, protéines périphériques ; RC, relargage et absorption cytosolique; RV, relargage et absorption vacuolaires.