Croissance bactérienne et expression des protéines Stéphane Delbecq Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire EA 4558 «vaccination antiparasitaire» Faculté de Pharmacie sdelbecq@univ-montp1.fr 2015-2016
Caractéristique d un vecteur d expression (E. coli)
Inhibiteur de T7RNA pol
Caractéristique d un vecteur d expression (E. coli) Clonage en phase avec la protéine de fusion (ex.: GST) ou le tag (ex.: His6) Choix des sites de restriction et des amorces (PCR)
Devenir des protéines synthétisées chez E. coli
vitesse de traduction > vitesse de repliement Interactions entre segments hydrophobes de polypeptides en cours de synthèse (non repliés)
Croissance bactérienne sur milieu solide Manipulation des bactéries (transformation ) Adaptation au milieu Archivage à court terme (qqes semaines à +4 C) Ex de culture sur milieu solide à but d identification des bactéries (lecture automatisable)
Croissance bactérienne en milieu liquide Ex de culture en milieu liquide à but diagnostique (hémoculture) Petit volume (1-10 ml): - test de croissance - archivage long terme (cryostabilat) - test d expression de protéine Lecture automatisable
Croissance bactérienne en milieu liquide: production de biomasse 10-1000 ml 0.5 l - x m3
1: phase de latence 2: phase de croissance exponentielle 3: phase de ralentissement 4: phase stationnaire 5: phase de déclin
Loi de Monod «Approximation» de la croissance bactérienne
Taux de croissance et conditions environnementales: Exemple de la température
Croissance en diauxie et milieux «autoinductibles»
Quelques autres systèmes d expression
Quelques autres systèmes d expression
Localisation cellulaire (membrane, compartiments..) tissulaire (type cellulaire) temporelle (profil d expression) Protéine Structure taille structure 3D modifications post-traductionnelles Fonction activité enzymatique interactions protéiques Ligands-récepteurs
Différentes stratégies d étude Séquence du gène est connue: Protéine recombinante Identification de domaines Analyse bioinformatique Analyse in vivo Étude structurale Étude fonctionelle Anticorps (monoclonaux)
Séquence du gène est inconnue, protéine pure Biologie moléculaire (criblage par Ac, clonage) Identification directe du profil de digestion Séquençage Nterminal Protéolyse (trypsine) HPLC Séquençage des peptides par spectrométrie de masse Séquençage Nterminal des peptides Obtention de la séquence du gène
Séquence du gène est inconnue, mélange complexe de protéines Caractérisation du mélange: MS, 2D Obtention d un moyen de détection spécifique de la protéine: anticorps, activité enzymatique, affinité pour un ligand Purification de la protéine d intérêt (critères??) protéine pure Études sur la protéine native étude in vivo
Séquence du gène est inconnue, criblage de banques Utilisation d anticorps spécifique Recherche d une fonction particulière: ex: affinité pour un ligand Criblage de banque d expression (cdna) Utilisation de banques d expression «fonctionnelle»: ex: double hybride, sélection type phage display Séquence ADN Séquence ADN
Critères de choix de la méthode : Méthodes informatiques : besoin de la séquence + homologies Méthodes biologiques: - transfection: cellule génétiquement manipulable - banques «fonctionnelles» : expression soluble, modifications post-trad., - expériences types complémentation: expression soluble, lien avec un phénotype Méthodes biochimiques: protéine naturelle ou recombinante - électrophorèses, immunodétection (Western blot, ELISA,IP, IFA) - chromatographies (gel filtration, échangeuse d ions, affinité ) Méthodes physiques: - spectrométrie de masse : protéine naturelle ou recombinante - structure : RX, RMN protéine recombinante soluble - spectroscopies (CD, fluorescence, IR ) protéine recombinante soluble
Analyse de séquence 1ère étape: identifier la phase de lecture ouverte et la séquence protéique déduite (intron etc) Analyses «physico-chimiques»: profil d hydrophobicité, recherche de séquences répétées, prédiction de structures secondaires et signaux d adressage, prédiction de linker Homologies: - sites de modification post-trad. (glycosylation, phosphorylation, acylation, GPI ) - motifs et signatures (sites actifs, interactions ) - recherche d homologies de séquences : BLAST, PSI-BLAST - recherche d homologies de structures Modélisation: - prédiction de la structure 3D à partir de celle d un homologue (modèle) - recherche de ligand spécifique (docking) Rem: annotation des génomes fonctionne essentiellement par homologies!
Méthodes informatiques: traduction M A S S L R Q I L D S Q K M E W R S ATG GCT TCT TCT CTG CGT CAA ATT CTG GAT TCT CAA AAA ATG GAA TGG CGT TCT 18 54 N A G G S M S D K I I H L T D D S F AAC GCT GGT GGT TCT ATG AGC GAT AAA ATT ATT CAC CTG ACT GAC GAC AGT TTT 36 108 D T D V L K A D G A I L V D F W A E GAC ACG GAT GTA CTC AAA GCG GAC GGG GCG ATC CTC GTC GAT TTC TGG GCA GAG 54 162 W C G P C K M I A P I L D E I A D E TGG TGC GGT CCG TGC AAA ATG ATC GCC CCG ATT CTG GAT GAA ATC GCT GAC GAA 72 216 Y Q G K L T V A K L N I D Q N P G T TAT CAG GGC AAA CTG ACC GTT GCA AAA CTG AAC ATC GAT CAA AAC CCT GGC ACT 90 270 A P K Y G I R G I P T L L L F K N G GCG CCG AAA TAT GGC ATC CGT GGT ATC CCG ACT CTG CTG CTG TTC AAA AAC GGT 108 324 E V A A T K V G A L S K G Q L K E F GAA GTG GCG GCA ACC AAA GTG GGT GCA CTG TCT AAA GGT CAG TTG AAA GAG TTC 126 378 L D A N L A * CTC GAC GCT AAC CTG GCC TAG 132 Exemple: séquence protéique déduite de la séquence du gène de la thioredoxine A (E. coli) Séquence protéique déduite dépend du code génétique appliqué lors de la traduction informatique (Archea, mitochondrie )
Index d hydrophobicité Méthodes informatiques: prédictions-homologies N résidus Profil d hydrophobicité : segments transmembranaires, peptides signaux
Prediction de région non-structurée
Méthodes informatiques: prédictions-homologies Homologies de séquence: - site actif - fonction (type de protéine) - modélisation
électrophorèse Migration de molécules chargées en solution et soumises à un champ électrique Résidus acides Résidus basiques
électrophorèse Ratio SDS-protéine constant : charge proportionnelle à la masse
électrophorèse
électrophorèse kda 80 70 60 50 40 30 25 20 1 2 3 4 5 6 7 8
Électrophorèse 2D IEF: IsoElectroFocalisation Protéines (bandes) au niveau du pi
Électrophorèse 2D
DiGE: difference gel electrophoresis
Western blot overlay blot Papier Gel Membrane Papier Immunodétection avec un produit coloré précipitant (ou chimioluminescence) Transfert
Western blot Coloration au Bleu de Coomassie 60 kda 50 kda 40 kda 30 kda 25 kda 20 kda 15 kda 37 kda Western blot
Immunoprécipitation Marquage métabolique en culture in vitro : un précurseur radioactif est ajouté au milieu, ce précurseur est ensuite incorporé dans le métabolisme Selon le précurseur : méthionine, glucosamine, éthanolamine, palmitate, phosphate, sulfate attention au métabolisme des informations peuvent être obtenues: - ancrage lipidique - ancrage GPI - glycosylation - phosphorylation Selon le temps : expérience de pulse-chase: suivi de la maturation d une protéine Selon les inhibiteurs : ajout d inhibiteurs (de glycosylation, de sécrétion, de protéolyse )
Gel filtration Vi : volume interne Vg : volume du gel V0 : volume mort Vs : volume de la phase stationnaire
Gel filtration Polymère Volume d élution dépend de la taille, forme, oligomérisation
Dichroïsme circulaire
Dichroïsme circulaire
Séquençage dégradation d Edman PITC : phenyl iso thio cyanate dérivé spécifique pour chaque aa
Séquençage spectrométrie de masse
Protéolyse ménagée
Protéolyse ménagée Détermination des domaines détermination des sites de liaison (protéolyse +/- ligand)
SAXS small angle X-ray scattering Forme globale de la molécule en solution pas de marquage nécessaire
Analyse des domaines : - séquence - protéolyse ménagée Masse de la protéine : - SDS-PAGE - spectrométrie de masse Forme, repliement et oligomérisation : - gel filtration - dichroïsme circulaire - SAXS (small angle X-ray scattering) Schéma des ponts disulfures : - SDS-PAGE +/- réducteur - spectrométrie de masse - protéolyse ménagée Maturation de la protéine : - SDS-PAGE - spectrométrie de masse - immunoprécipitation Recherche d interactions : - co-immunoprécipitation - double hybride - phage display - systèmes in vitro
Recherche des partenaires d interaction banque expression Protéine - information génétique Protéine - information génétique Protéine - information génétique Protéine - information génétique Protéine - information génétique Sélection de la protéine (ligand, activité ) Protéine - information génétique Amplification séquençage Séquence ADN
Différentes méthodes d identification
Double hybride et dérivés Triple hybride ex: interaction avec un ARN Interaction avec ligand: liaison covalente entre L1 et L2 Environnement cytoplasmique: pas de glycosylation du partenaire connu, milieu réducteur diversité limitée par l étape in vivo
Phage display et dérivés Séquence protéique fusionnée à piii Sélection par liaison : anticorps ligand (héparane ) protéine cellule
Phage display et dérivés Phage sauvage Phage non infectieux Phage sélectivement infectieux Protéine connue fusionnée à la protéine du phage Production en système procaryote: interférence avec la voie de sécrétion (phage M13) production cytoplasmique (phage T7) pas de modifications type eucaryote efficacité d encapsidation et de transformation (diversité)
Systèmes in vitro Ribosome display (eucaryote ou procaryote) mrna display Expression in vitro: pas de modifications post-traductionnelle (pas de microsomes) grande diversité (pas de transformation)
Avantages et inconvénients des différents systèmes Techniques d exposition de protéines: recherche de partenaires d interaction identification de site d interaction Résultats à confirmer par d autres techniques
Phage display + proteolyse : identification de domaine
Séquence codante Mélange complexe Définition de domaine fractionnement Expression (optimisation ) Purification (> 10 mg) Caractérisation identification Outils spécifiques (Ac )