Biomarqueurs en pathologie mammaire et approche de la classification moléculaire des cancers invasifs

Biomarqueurs en pathologie mammaire et approche de la classification moléculaire des cancers invasifs Anne Vincent-Salomon Département de Biologie des Tumeurs et INSERM U 934 Institut Curie, Paris Anne.salomon@curie.fr

Marqueurs prédictifs et pronostics des cancers du sein Quand avons nous besoin de ces marqueurs? 1. Carcinomes In situ : Pour définir ceux qui ont un risque de rechute pour adapter le traitement 2. Carcinomes infiltrants Prédictifs = marqueurs prédisant la réponse à un traitement (ciblé ou chimiothérapie classique) Pronostic = marqueur prédisant de la maladie

Marqueurs prédictifs et pronostics des cancers du sein Quand avons nous besoin de ces marqueurs? 1. Carcinomes In situ : Pour définir ceux qui ont un risque de rechute pour adapter le traitement 2. Carcinomes infiltrants Prédictifs = marqueurs prédisant la réponse à un traitement (ciblé ou chimiothérapie classique) Pronostic = marqueur prédisant de la maladie

Clinico-pathological prognostic and/or predictive factors (Patient age) Tumour size Histo-pronostic grade Axillary lymph node status Old but good ones! Vascular invasion

+ + One cheap but powerful «prognostic marker» the histo-pronostic grade (Elston et Ellis) Tubule and gland formation: >75% : score 1 10-75%: score 2 <10%: score 3 Nuclear pleomorphism (score 1 to 3) Mitotic count (score 1 to 3) depending on field area Final grading: add scores Total 3-5 = grade I Total 6-7 = grade II Total 8-9 = grade III ifferent grade I 29% grade II 41% grade III 30% Blamey et al, Oncopool Eur J Cancer 2007

The Nottingham Index: integrates biology and anatomy Nottingham Score = Grade + (Size in cm x 0,2) + stage N (1 à 3) EPG : Excellent Pronostic Group GPG : Good Prognosis Group MGP : Moderate Prognosis Group PPG : Poor Prognosis Group VPG : Very Poor Prognosis Group Blamey et al, Eur J Can July 2007

Acquis des 10 dernières années 2001-2003 2004-2005 2005-2008 2009 2012 2013 Carcinomes Basal-like sporadiques = Phénocopies des BRCA1

Identification des sous-groupes moléculaires de carcinomes canalaires infiltrants Récepteurs Oestrogènes - Récepteurs Oestrogènes + Basal-like ERBB2 Luminal A, B, C

Reproductibilité des classifications moléculaires Kappa score >0.81 pour les HER2 RO- et Triples négatifs-basal like Kappa score < 0.61 pour Les luminals MacKay A et al JNCI 2011

Molecular classification in practice: Luminal carcinomas ER+ Ki67 < 14% PR > 20% Luminal A Ki67 > 14% PR < 20% Luminal B HER2 Amplification HER2 Mutations (ILC) HER2 Normal status Cheang et al, JNCI 2009 Kennecke et al, JCO 2010 Prat et al, JCO 2013 Bose et al, Cancer Discovery 2013

Hétérogénéité des CCI Luminal A RO > 10% et RP >20% HER2- Ki67 <14% ER PR KI67 Luminal B RO > 10% et RP <20% HER2- ou HER2 + (3+ / 2+ avec amplification) Ki67 >14% ER PR KI67

Molecular classification in practice: Identification of triple negative breast carcinomas ER negative <10% PR negative <10% HER2 (0/1+/2+ non amplified) High proliferation ER PR HER2 KI67 +++

Molecular classification in practice HER2 (3+ score) ER- ve

Hétérogénéité moléculaire et morphologique des carcinomes TYPES RARES majoritairement RO+ Cribriforme 100% ER+ HER2 ~ 0%, Ki67 bas Lobulaire 90% ER+ HER2+ 5%, Ki67: 10% Tubuleux 100% ER+ HER2 ~ 0%, Ki67 bas Papillaire 100% ER+ HER2 ~ 0%, Ki67 bas Micropapillaire 70-80% ER+ HER2+ 20% Mucineux 80-90% ER+ HER2 ~0%

Comment intégrer la classification moléculaire des carcinomes mammaires avec les types histologiques? Luminal A Luminal B ERBB2 Triple-négatifs RO+ Ki67<14% RP > 20% Tubuleux, cribriforme, CI TNS grade 1, Mucineux CLI grade 1 RO+ Ki67 >14% RP < 20% ERBB2 + possible Micropapillaire CLI grade 2 et 3 CI TNS grade 2 et 3, Mucineux hypercellulaire RO- ERBB2 3+ Haut Grade Apocrine RO- RP- ERBB2- Proliferation Ki67 haut Haut grade CI de type médullaire Adénoïde kystique Sécrétants CLI grade 3 CI TNS grade 3 Apocrine Weigelt et al, J Pathol 2010, Cheang et al JNCI 2009, Cheang et al CCR 2008, Prat et al JCO 2013, Gudej et al Oncogene 2012

Histological types associated with > 90% overall survival at 10 yrs ER+ ER- Tubular Cribriform Adenoïd cystic t(12;15) (ETV6; NTRK3) Kit+++ Mucinous Papillary Secretory t(6;9) (MYB ;NFIB) Li, Horm Cancer 2010, vol 1: 156-165; Ellis et al WHO Breast carcinomas classification 2003 Rhakha et al JCO 2010, Laé et al, Mod Path 2008, Azoulay et al, Mod Path 2005, Weigelt & Reis-Filho, Nat Rev Clin Oncol 2010

Interest of genomic signatures C Sotiriou and L Pusztai, NEJM 2009

Diminution des indications de chimiothérapie depuis Prise en compte de la prolifération Hassett et al JCO Juin 2012

Wirapati et al Br Can Res 2008

Several commercial tests are available Are they useful?

Ongoing Prospective Validation

Genomic grade (MapQuant, Ipsogen) not superior to Ki67 index Prediction of metastases events at 10 years of follow-up Reyal et al PLOS One 2012

Oncotype DX RT PCR quantitative on fixed tissues Key impact of proliferation in the signature!

IHC4 score for prognostic definition IHC 4 : combined score ER (% of cells with the three different intensities) PR HER2 Ki67 Low cost Easy determination = Recurrent Score (Oncotype DX ) Cuzick et al JCO, 2011

Autre analyse comparant les valeurs Pronostiques des Paramètres cliniques N, T par rapport À Oncotype Dx (Recurrent Score) Ou à PAM50 (ROR) Dans le graphe du bas On voit que si PAM 50 discrime mieux les patientes que IHC4 IHC4 fait mieux que Oncotype Dx Sestak et al JNCI Sept 13

Immunohistochemical assessment of Ki67 to measure proliferation in breast cancers Marqueur pronostic de niveau 1B Standardisation de détermination à respecter et améliorer Improtance des étapes de pré-analytique (Fixation +++) Contrôles positifs (amygdales ou ganglions lymphatiques) MIB1 anticorps recommandé Comptage manuel > 3 champs à fort grandissement (xg40) au niveau des zones périphériques infiltrantes > 500 à 1000 cellules % de cellules marquées (quelque soit ) Yerushalmi et al Lancet Oncol 2010 Luporsi et al Br Can Res TTT 2011 Dowsett et al JNCI 2011

Ki67: le choix du cut-off est problématique car une variable continue Pour le pronostic : 20% est largement choisi Pour la classification moléculaire : 14% Mais certaines études ont montré que si on établit des classes de tumeurs avec des cut-offs tous les 10% de % de cellules marquées il existe une différence pronostique Aleskandarany et al. Breast Cancer Research 2012

Ki67: est très intéressant pour séparer le groupe des grade 2 en deux classes de pronostics différents Aleskandarany et al Br Cancer Res and TTT 2011, 127: 591-599

50 cas En TMA 8 laboratoires

New prognostic markers Nature Reviews Clinical Oncology, June 2013

Genomic complexity (number of chromosomal breakpoints) as a prognostic marker in luminal A pt1t2n0 < 34 brkpts > 34 brkpts Genomic profiles of tumors (Affymetrix SNP6.0 profiles) Analysis performed with GAP algorithm, Popova et al, Genome Biology 2009 Vincent-Salomon et al PlosOne 2013

Genomic complexity (number of chromosomal breakpoints) as a prognostic marker in luminal A pt1t2n0 < 34 brkpts > 34 brkpts p=0.009 (log-rank test) RR= 5.29 (CI=[1.32-21.26]) Vincent-Salomon et al PlosOne 2013

Genomic complexity (number of chromosomal breakpoints) as a prognostic marker Genomic complexity prognostic value investigated by other teams Rusness et al, Science Translational Research June 2010 Vollan HKM et al, SABCS 2013 METABRIC study (P2-10-20) : A tumor DNA complexity index is an independent predictor of survival in a dataset of 1950 breast cancers (1950 ER- and ER+ cancers); a METABRIC group study

Marqueurs prédictifs et pronostics des cancers du sein Quand avons nous besoin de ces marqueurs? 1. Carcinomes In situ : Pour définir ceux qui ont un risque de rechute pour adapter le traitement 2. Carcinomes infiltrants Prédictifs = marqueurs prédisant la réponse à un traitement (ciblé ou chimiothérapie classique) Pronostic = marqueur prédisant de la maladie

EP and PR: predictive markers 1. Response to hormonotherapy 2. Resistance to classic chemotherapy 60 to 85 % ER +ve 15 to 40 % ER-ve

HER2: predictive marker for anti HER2 therapies Score 0/1+ Score 3+ Score 2+ 9 to 13% No amplification Low level Amplification No amplification High level Amplification 70-85 % of 2+ cases 15-30% of 2+ cases Anti-Her2 ttt Anti-Her2 ttt

PLAN - Détermination Méthodes (FISH/ SISH / CISH/ DISH) Scores et cas équivoques (score 2+) Contrôle de qualité et recommandations Stabilité du statut de ERBB2 au cours du processus métastatique Diversité des carcinomes HER2 amplifiés en fonction du statut des RO, du Paramètres de réponse aux Anti-HER2 Perspectives 37

ERBB2/ Neu/HER2 Gène: oncogène, situé sur le chromosome 17q12 Protéine = récepteur tyrosine-kinase trans-membranaire 4

ACTIVATION de ERBB2/HER 2 dans les cancers du sein par amplification du gène 39

Amplification et surexpression de ERBB2: 10 à 15% des carcinomes infiltrants Homogène dans la tumeur 41

Méthodes de détermination du statut de HER2 Analyse du gène : Sur coupes tissulaires Sur un microscope à fluorescence: FISH En lumière optique, CISH ou en Dual ISH en une seule coupe SISH sur deux coupes (une pour le centromère du chr 17, une pour ERBB2) Par PCR quantitative sur ADN extrait du bloc paraffine Analyse de la protéine par immunohistochimie A ajuster sur le statut du gène Contrôle de qualité indispensable au long cours 42

43

Score Marquage Indication Herceptin 0 Absence de marquage ou < 10% de cellules non + Marquage faible et incomplet de >10% de cellules non ++ Marquage faible ou modéré et complet de > 10% de cellules +++ Marquage fort et complet de > 30% de cellules Oui seulement si amplification prouvée par FISH/CISH/SISH oui Wolff et al, JCO 2007 44

Signature moléculaire commerciale pour la détermination du statut de HER2? Sur matériel fixé, par RT PCR quantitative Test commercial Oncotype DX Détermination inexacte du statut de ERBB2 seuls 10 des 28 cas 3+ sont considérés + par le test. (Dabbs et al, JCO Nov 2011)

Calibration de la technique et interprétation des marquages statut du gène (FISH ou SISH) concordance > 95% Utilisation indispensable de témoins multi-tissulaires au nombre de copies du gène HER2 connu. Contrôle de qualité interne et externe, importance du préanalytique Nombre de cas testés par an suffisants (250 cas) Interprétation adéquate des marquages (en fonction de Recommandations du GEFPICS, Annales de Pathologie 2011 Wolff et al JCO 2007

Témoins bloc multi-tissulaire (0, 2+, 3+) Glandes Normales 0 2+ À demander à centre expert ou à définir par FISH/SISH 3+ Faux négatifs rares si pré-traitement par la chaleur 47

Préparation des blocs témoins Forage blocs donneurs 48

des types histologiques et du stade Canalaires (de type non spécifique) T1a, b (<1cm) 9% < 2 cm 10-15% > 2 cm 20-25% grade I 5% grade II 10-17% grade III 29% N- 9-20% N+ 1-3: 16-21% N+ > 4: 28% Autres types Lobulaire < 5% Tubuleux 0% Médullaire, basal-like 0% BRCA1 0% BRCA2 6 % Cancer inflammatoire 30% Cancer du sein Homme 11% à 30% Bartlett et al, JCO 2007 Penault-Llorca et al, 2008 Rodrigues et al JCO 2010 Ignatiadis Nat Rev Clin Oncol Janv 2012

Bien identifier les cas équivoques à analyser par FISH/CISH CAS 2+ (5 à 15% des cas): Marquage complet soit non uniforme soit faible avec un marquage evident circonférentiel membranaire >10% des cellules Cas hétérogènes (exceptionnels <1% des cas) Marquage complet et intense de Définition >10% et en < 30 pratique % des cellules : toute tumeur carcinomateuses avec marquage infiltrantes de 10 à 50% de cellules intensité 3+

Conclusions : en 10 ans -nous appris sur les carcinomes HER2 (3+)? 9 à 30% des cancers infiltrants (stade et type histologique) Cancers HER2 = Plusieurs entités (RO+ / RO-; Stroma inflammatoire ou non) Réponse aux anti-erbb2 : fonction des altérations moléculaires associées» Autres amplicons (CCND1» Mutations de Importance de la calibration et du contrôle de qualité de la technique de détermination du statut de HER2

Ki67 >20%: predictive value for response to taxanes 699 carcinomas ER+ve PACS01 trial Penault-Llorca et al JCO 2009 Conclusions to be confirmed All tumors from the PACS01 trial Jacquemier et al Br Can Res 2011 Yerushalmi et al Lancet 2010

Bio-markers in breast cancers 1. To diagnose a special type of breast cancer: 2. To define the prognosis and the risk of relapse: grade/nottingham index, Ki67, IHC4, genomic signatures (OncotypeDX, Mammaprint ) New tools: circulating DNAs, circulating tumor cells (CTCs) genomic complexity Nature of the stroma 3. To predict the response to treatment or resistance to therapy To chemotherapy: grade, KI67, ER, molecular classification To targeted therapies: HER2 status (amplification and mutations), ER/PR status 4. To identify new targets thanks to whole genome sequencing

Alterations génomiques en fonction du grade Bas grade Grade intermédiaire Haut grade 1q+, 16q- CCND1 + BCL2 + 1q+, 3q+, 17q+, 8q+, 11q-, 14q-, 8p-, 13q- TP53 mutations Amplification ERBB2 Amplifications 8q22, 11q13, 6q22 Prolifération (Ki67)

CCIS : hétérogénéité moléculaire identique aux infiltrants Luminal A (56 à 61%) RO +++ Bas grade >>> haut grade 1q+, 8p+, 16q-, ERBB2 (16 à 37%) RO - HG>>>NHG 4p-, 8p-, 3q-, 17q+ TP53* 3% Pathways des oestrogènes et antiapoptotique Luminal B + ERBB2 3+ RO + TP 53* 10% TP53* 35% cellulaire, métabolisme des acides grade et des kinases Triple négatifs / basal-like (5 à 8%) HG; 33% TP53* Vincent-Salomon Clin Can Res 2008; Bryan, Mod Path 2006; Dabbs, Mod Path 2006; Collins Mod Path 2005; Livasy Hum Path 2007

Facteurs biologiques de prédiction de la rechute des lésions pré-cancéreuses

JNCI 2010 1162 patientes CCIS traités par chir conservative seule Entre 1983 et 1994 324 rechutes (Infitrantes ou in situ) Revue centralisée des CCIS avec analyse IHC

Oncotype DCIS 327 patientes Essai ECOG E5194, chirurgie sans radiothérapie RO+ (97%), HER2 (86% ) et avec berges à > de 3mm (> 96%) 46 rechutes : 20 infiltrantes et 26 in situ Solin et al JNCI 2013

Lésions de néoplasie lobulaire in situ

Immunophénotype CLIS: Faible prolifération RO + HER2- E-cadhérine -

47 patientes, Age moyen 51.3 ans CLIS classique (97%) E-cadhérine negative (71%) ou faible (29%) 34 cas RO + et KI67 <10% (79%), 9 cas RO + et KI67 >10% (21%), 1 cas RO RP et EGFR + A 5 ans: Rechutes: 1/34 RO+ et Ki67 bas 3 /9 RO+ et KI67 élevé 2 IDC; 1 ILC (p= 0.0054).

CLIS classique CLIS P non apocrine CLIS P apocrine N 24 18 13 Age moyen 50 51 60 Nécrose 0 (0%) 9 (50%) 13 (100%) E-cadherine - 21 (100%) 18 (100%) 13 (100%) GCDFP + ND 7 (50%) 13 (100%) RO + 21 (100%) 16 (100%) 3 (23%) RP + 21 (100%) 16 (94%) 2 (17%) Ki-67 median 4.2% 9.9% 13.9% HER2 (3+) 0 (0%) 0 (0%) 4 (31%)

Histoire naturelle des néoplasies lobulaires

Epithelium Normal Progéniteur luminal CD24+ CD44- CK5/6- CK8/18+ Progéniteur myoépithélial CD44+ CD24- CK5/6+ CK8/18- Cellule myoépithéliale Mutations E-cadherine LCIS ACCL 16q- RO+ BCL2+ ADH 1q+16q- ER+ BCL2+ DCIS low grade 1q+16q- ER+ BCL2+ DCIS Luminal A GATA3+ ER+ lésions précurseur?? DCIS Luminal B GATA3+ ER+ ERBB2+ DCIS ERBB2+ GATA3-ER- TP53* Mutations P53 Inactivation BRCA1 DCIS Basal-like GATA3- ER- ERBB2- TP53* IDC low grade 1q+16q- ER+ BCL2+ IDC Luminal A ER+ IDC Luminal B ER+ ERBB2+ IDC ERBB2+ ER- IDC Basal-like ER- ERBB2-