Gene Delivery with Hyperbranched Polylysine
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1 Gene Delivery with Hyperbranched Polylysine THÈSE N O 5216 (2011) PRÉSENTÉE le 4 novembre 2011 À LA FACULTÉ SCIENCES ET TECHNIQUES DE L'INGÉNIEUR LABORATOIRE DES POLYMÈRES PROGRAMME DOCTORAL EN SCIENCE ET GÉNIE DES MATÉRIAUX ÉCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE LAUSANNE POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR ÈS SCIENCES PAR Zuzana Kadlecova acceptée sur proposition du jury: Prof. D. Damjanovic, président du jury Prof. H.-A. Klok, directeur de thèse Dr A. Gauthier, rapporteur D. Takeuchi, rapporteur Prof. F. M. Wurm, rapporteur Suisse 2011
2 Table of Contents Table of Contents ACKNOWLEDGMENTS 3 TABLE OF CONTENTS 5 LIST OF ABBREVIATIONS 6 SUMMARY 8 RÉSUMÉ GENE DELIVERY - GENERAL BACKGROUND Gene Delivery to Mammalian Cells Design of Polycationic Gene Carriers Polycations for Large Scale Protein Production via TGE References A COMPARATIVE STUDY ON THE IN-VITRO TOXICITY OF LINEAR, DENDRITIC AND HYPERBRANCHED POLYLYSINE ANALOGUES Introduction Materials and Methods Results and Discussion Conclusion Supporting Information References DNA DELIVERY WITH HYPERBRANCHED POLYLYSINE: A COMPARATIVE STUDY WITH LINEAR AND DENDRITIC POLYLYSINE Introduction Materials and Methods Results and discussion Conclusions Supporting Information References HYPERBRANCHED POLYLYSINE: AN EFFICIENT, BIODEGRADABLE TRANSFECTION AGENT FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS BY TRANSIENT GENE EXPRESSION Introduction Materials and Methods Results and Discussion Conclusion References CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES Conclusions Perspectives References CURRICULUM VITAE 138 5
3 Summary Summary The delivery of exogenous nucleic acids into mammalian cells is a valuable technique for basic research studies on the expression, regulation and function of genes and proteins. At the same time, gene delivery to cultivated mammalian cells has become fundamentally important as a technology for the production of therapeutic proteins for preclinical and clinical applications. Alongside with the applications of gene delivery in biotechnology, gene transfer emerged in the early 1990s as a potential therapeutical method in which a functional copy of the defective gene is introduced to provide the missing function. Polymeric cations are widely used as nonviral transfection agents. The efficiency of these vectors, however, is lower than that of viral vectors and has until now precluded their extensive use in applications where stable and high level gene expression is required. Therefore a better understanding of the parameters that govern transfection efficiency of polycationic vectors is crucial for rational design of novel gene carriers. Thus, the main motivation behind this research was to investigate the role of the architecture and molecular weight of the polycation on the efficiency of transfection. The efficiency of transfection is determined by the cytotoxicity of the gene carrier, its reversible complexation with DNA, and proper intracellular trafficking of the resulting complex. For this purpose the 17 member library was synthesized, containing linear (LPL), hyperbranched (HBPL) and dendritic polylysine (DPL) analogues covering a broad range of molecular weights. HBPL, a new class of cationic polymers prepared by polycondensation of L-lysine, was developed to explore the influence of very high molecular weights and randomly branched structures on cytotoxicity, transfection efficiency, and internalization. The thesis is divided into four chapters. Chapter 1 reviews the current state-ofthe-art on gene carriers and the future prospects of the field. Additionally, the current use of polycationic gene carriers for the production of recombinant proteins (r-proteins) via a large-scale transient gene expression (TGE) is discussed. The main goal of the Chapter 2 was to determine the influence of the architecture and molecular weight of the polycations on their in vitro biocompatibility. The extent of acute cell death after short exposure was found to be molecular weight dependent. The acute cytotoxicity of high molecular weight polycations was triggered by the permeabilization of the cell membrane. At high concentrations of small molecular weight 8
4 Summary polycations, membrane destabilization was caused by increased osmotic pressure. In contrast, delayed cell death was correlated to the collapse of mitochondrial transmembrane potential, triggering caspase-dependent apoptosis after intracellular accumulation of the polycation. The onset and extent of the delayed mode of cell death was shown to be dependent on the molecular weight and degree of branching of the polylysine analogues. Based on these results, the differential long term cytotoxicity reflects the resistance of branched polylysine analogues to proteolytic degradation. Thus the degradability and cumulative cytotoxicty can be predetermined by fine-tuning the frequency of branching points in the architecture of peptidic polycation. Chapter 3 demonstrates the evolution of transfection activity with the molecular weight and degree of branching of polylysine analogues. In summary, the results show that under identical cell culture and transfection conditions, the most critical parameter for high gene expression is the structure of the gene carrier. HBPL is the most efficient gene carrier in comparison to LPL and DPL and results in gene expression levels comparable to polyethyleneimine (PEI). Physico-chemical characterization of complexes revealed that those derived from plasmid DNA and HBPL contained a high quantity of the free polycation in comparison to those formed by LPL and DPL. The presence of the free polycation in the course of endocytosis of the complex may provide an explanation for the high transfection efficiency of HBPL. Chapter 4 describes a feasibility study aimed at proving whether HBPL is potentially applicable to large-scale r-protein production via TGE. Gene delivery efficiency and yield of r-protein were evaluated in serum-free, suspension-adapted CHO- DG44 cells under conditions mimicking the industrial manufacture of r-protein by TGE. High molecular weight HBPL mediates transfection and r-protein expression at levels comparable to the ones obtained with PEI. The main advantage of HBPL is its partial enzymatic degradability, potentially decreasing its cumulative cytotoxicity in the course of TGE. Also, HBPL efficiently transfects cell lines and primary cells in the presence of serum, thus broadening the potential applications of HBPL as a novel gene carrier for basic research applications in molecular and cellular biology. In conclusion, it is possible to obtain an efficient gene carrier by simple rearrangement of the topology of poly-llysine. Keywords: polylysine, dendrimer, hyperbranched polylysine, structure and activity relationship, degree of branching, apoptosis, toxicity, transfection, non-viral gene delivery, recombinant protein, transient gene expression, trafficking, endocytosis. 9
5 Résumé Résumé L introduction d acides nucléiques exogènes dans des cellules mammifères est une méthode de choix permettant d étudier l'expression, la régulation et la fonction des gènes et des protéines. En marge de cette application pour la recherche fondamentale, le transfert de gènes dans des cellules en culture est devenu un outil technologique de plus en plus important permettant la production de protéines thérapeutiques pour des applications précliniques et cliniques. Enfin, et parallèlement à son application en biotechnologie, le transfert de gènes est apparu au début des années 90 comme une méthode thérapeutique prometteuse basée sur l introduction dans une cellule de la copie corrigée d un gène défectueux. Les polymères cationiques sont largement étudiés comme agents de transfection (processus permettant le transfert de gènes) non viraux mais trouvent finalement peu d applications à grande échelle. L'efficacité de ces vecteurs est plus faible que celle des vecteurs viraux, seuls capables pour le moment de garantir une expression stable et élevée des gènes. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes qui régissent le phénomène de transfection via un vecteur polycationique permettrait la mise au point de nouveaux types d agents. Dans ce cadre, ce travail s est focalisé sur l influence de l'architecture et du poids moléculaire du vecteur polycationique sur l'efficacité de la transfection, cette dernière dépendant de la cytotoxicité du vecteur, du caractère réversible de sa complexation avec l'adn, et du trafic intracellulaire du complexe qui en résulte. Pour ce travail, 17 types de polylysines ont été préparées. Celles-ci sont différenciées par leur poids moléculaire et la structure de leur chaîne : linéaire (LPL) ; hyperbranchée (HBPL) et dendritique (DPL).L architecture HBPL est une nouvelle classe de polymère cationique préparée par polycondensation de L-lysine et développée afin d explorer l'influence des très haut poids moléculaires et des structures ramifiées non ordonnées sur la cytotoxicité, l efficacité de la transfection et l'internalisation. Cette thèse est divisée en quatre chapitres. Le premier chapitre décrit l état actuel des connaissances concernant les transporteurs de gènes et les perspectives futures de ce domaine. Ce chapitre présente également l utilisation des transporteurs de gènes polycationiques pour la production à grande échelle de protéines recombinantes via un système d expression transitoire de gènes (TGE). 10
6 Résumé L'objectif principal du second chapitre est de montrer l'influence de l'architecture et du poids moléculaire des vecteurs polylysine sur leur biocompatibilité en utilisant un modèle in vitro. Nous avons montré que la proportion de mort cellulaire brutale induite par une courte exposition à un type de polylysine donné dépend du poids moléculaire de celui-ci. La toxicité aiguë des polycations de poids moléculaires très élevés est induite par la perméabilisation de la membrane cellulaire. Pour des concentrations élevées de polycations de faibles poids moléculaires, la déstabilisation membranaire est causée par un accroissement de la pression osmotique. Nous avons également montré que les vecteurs polylysine induisent une mort cellulaire retardée après une longue exposition. Dans ce cas, l accumulation intracellulaire de polycations a induit un effondrement du potentiel transmembranaire mitochondrial, menant à une apoptose caspase-dépendante. Le début et l ampleur de ce phénomène de mort retardée dépend du poids moléculaire et du degré de ramification de la polylysine considérée. Ces résultats montrent que la cytotoxicité à long terme reflète la résistance que les polylysines à structure ramifiée ont vis-à-vis de la dégradation protéolytique. Ce chapitre nous a permis de conclure que la dégradabilité et la cytotoxicité des vecteurs polylysine peuvent être modulées en contrôlant le degré de ramification de la chaîne de polymère. Le troisième chapitre présente l influence du poids moléculaire et du degré de ramification sur l efficacité de transfection des vecteurs polylysine. En particulier, nous avons montré que pour des conditions de transfection et de culture cellulaire identiques, la structure du transporteur de gènes est le paramètre le plus important pour atteindre un fort niveau d expression des gènes. HBPL est le transporteur de gènes le plus efficace en comparaison avec LPL et DPL ; il permet d atteindre des niveaux d'expression comparables à ceux obtenus avec le polyéthylèneimine (PEI). La caractérisation physicochimique de complexes transporteurs-gènes a révélé que ceux formés à partir d ADN plasmidiques et de HBPL contenaient une grande quantité de polycations libres en comparaison à ceux formés avec LPL et DPL. Nous suggérons que la présence des polycations libres durant la phase d endocytose du complexe pourrait expliquer la grande efficacité de la transfection obtenue avec HBPL. Le quatrième et dernier chapitre de cette thèse présente une étude de faisabilité visant à évaluer l utilisation du polycation HBPL pour la production de protéines recombinantes à grande échelle par l'intermédiaire du système d expression transitoire de gènes (TGE). L efficacité du transport des gènes ainsi que le rendement en r-protéines ont été évalués en utilisant une lignée cellulaire CHO DG44 dans un milieu de culture sans 11
7 Résumé sérum et en suivant un protocole imitant la production industrielle de protéines recombinantes. HBPL avec un poids moléculaire élevé permet d obtenir des niveaux de transfection et d expression de protéines recombinantes comparables à ceux obtenus avec le PEI. Le principal avantage de HBPL vient de sa dégradabilité enzymatique partielle, ayant comme effet potentiel une diminution de son caractère cytotoxique à long terme durant le processus TGE. Nous avons également montré que HBPL permet la transfection de lignées cellulaires et de cellules primaires en présence de sérum, ce qui permet d étendre le domaine d application du HBPL comme transporteur de gènes pour des applications en recherche fondamentale, en biologie moléculaire et cellulaire. En conclusion, il est possible d'obtenir des transporteurs de gènes efficaces par le simple réaménagement de la topologie de la poly-l-lysine. Mots clés: polylysine, dendrimère, polylysine hyper-ramifiée, relation entre structure et activité, degré de branchement, apoptose, toxicité, transfection, transport de gène nonviral, protéine recombinante, expression de gènes transitoire, transport intracellulaire, endocytose 12
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