La microscopie multi-photons Ou microscopie non linéaire. Théorie & applications

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1 La microscopie multi-photons Ou microscopie non linéaire Théorie & applications F. Brau FP CNRS Avril 2009

2 Absorption multi-photonique Maria Göppert-Mayer Principe E hc 1931 Prédiction théorique Un atome peut être excité par l interaction de deux quanta de lumière abs E abs nphotons nphotons E n x abs abs monophoton monophoton

3 Principe Probabilité d absorption simultanée de 2 photons Au soleil, une molécule de Rhodamine B absorbe 1 photon/sec contre une paire de photons simultanément/10 millions d années. L absorption simultanée de trois photons n est pas statistiquement envisageable durant l âge total de l univers!!!! = extrêmement faible Probabilité d absorptionξ section efficace 1p-abs cm 2p abs abs abs t N a 1 GM = cm 4 s Comment augmenter cette probabilité?

4 Les conditions de la réussite Absorption s e Principe s à 10-7 s Relaxation Vibrationnelle Temps de vie de l état excité S 1 Conversion interne s à s s à 10-7 s à s 10-9 s g t s Concentrer la lumière d excitation 1) Temporellement Pour provoquer l absorption Pour entretenir le phénomène

5 Principe Obtenir une densité temporelle de photons élevée : Les lasers pulsés continu pulsé Pour une Pmoyenne identique Pcrête>> en pulsé T t 1961 Kaiser&Garett : Mise en évidence du phénomène sur un cristal de CaF2

6 Power (W) Principe Gain avec un laser pulsé 3.0 Titan-Sapphire spectra Excitation Emission Wavelength (nm)

7 Spectres d absorption des molécules Principe D après Zipfel et al. Nat. Biotech, 2003 Multimarquages

8 Structure d un laser pulsé Principe

9 Lasers pulsés commerciaux Principe

10 Principe Probabilité d absorption et caractéristiques de l excitation Probabilité d absorption Ex: Laser Ti:Saphir Facteur d augmentation par rapport à un laser continu T 10 ns t 100 fs Femtoseconde g tf R n 1 T 10 ns t 10 ps Picoseconde g 10 3 La probabilité =f(puissance 2 ) : processus non-linéaire

11 Principe Les conditions de la réussite Concentrer la lumière d excitation 2) Spatialement Objectifs à forte ouverture numérique Focalisation Cette double excitation procure une résolution tri-dimensionnelle intrinsèque en microscopie de fluorescence à balayage laser. Watt W. Webb Denk W, Strickler JH, Webb WW (1990). Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science 248, 73-76

12 Microscopie et confinement de l excitation Conséquences : 1) sur la résolution Principe Création de la lumière uniquement dans le plan focal D après Dufour P et al. Med. Sciences, 2006 D après Zipfel et al. Nat. Biotech, 2003

13 La microscopie multi-photonique Application à la biologie Détection «Non Descannée» D après Zipfel et al. Nat. Biotech, 2003 D après Dufour P et al. Med. Sciences, 2006

14 La microscopie multi-photonique excitation beam Application à la biologie x/y-scanning device & dichroic mirror (DM) prisma for spectral analyse DM DM descanned PMT 1 & 2 non-descanned (NDD) PMT 3 & 4 objective specimen condensor DM trans-non-descanned (NDD) PMT 5 (with modification Oertner, 2002)

15 Application à la biologie Conséquences : 2) Restriction de la photo-toxicité (3D-FITC-dextran gel; irradiated area ~ 10 x 20 µm) single-photon absorbtion (488 nm; Ar) focal plane y x x z two-photon absorbtion (760 nm; Ti:Sa) focal plane 20 µm 10 µm (with modification Kubitscheck et al., 1996)

16 Application à la biologie La microscopie multi-photonique multi-points Le TrimScope

17 Profondeur de pénétration Application à la biologie Principalement limitée par la diffusion et l absorption du milieu. photons balistiques : trajectoire rectiligne photons diffusés : le photon dévie de sa trajectoire rectiligne

18 Biologie et longueurs d ondes utilisées Application à la biologie Ca peut quand même bouillir Absorption proche IR plus faible : Moins de diffusion Moins d auto-fluorescences parasites =Profondeur de pénétration plus grande

19 depth of ligh penetration (µm) visible light UV Application à la biologie Profondeur de pénétration plus grande IR wavelength (µm)

20 Application à la biologie Applications Imagerie de molécules endogènes (NAD(P)H, flavoprotéines) Imagerie en profondeur à haute résolution Imagerie intravitale (viabilté) Suivi de cellules, exploration fonctionnelle, suivi d interactions cellulaires, de signalisation Exemple : circulation de Lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques (M. Bajenoff (U924 Inserm).

21 Application à la biologie

22 Autres phénomènes non-linéaires La Génération de Seconde Harmonique Diffusion non-linéaire dans le sens de la source (voire plus ) À /2 Observation de structures ordonnées sans marquage

23 Conclusion Avantages Pouvoir de pénétration tissulaire Photo-toxicité confinée Accordabilité de la source Photoblanchiment réduit Inconvénients Lourdeur de la mise en œuvre Echauffement à maîtriser Gestion des multi-marquages