Thèse de Doctorat. Présentée par. Nadia ZEKRI

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1 N d ordre: 3049 Thèse de Doctorat Présentée par Nadia ZEKRI Discipline : Chimie Option : Chimie de l environnement Étude phytochimique et Activités Biologiques des Huiles Essentielles et des Extraits des M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.) et M. spicata (L.) du Moyen-Atlas Marocain Devant le jury composé de: Président: Soutenue le 29/12/2017 Mme Souad EL HAJJAJI PES, Faculté des Sciences de Rabat Examinateurs: Mme Touriya ZAIR Mme Fatima EL HILALI PES, Faculté des Sciences de Meknès PES, Faculté des Sciences de Meknès M. Mohammed TABYAOUI Vice-Doyen, Faculté des Sciences de Rabat M. Mohammed EL AZZOUZI PES, Faculté des Sciences de Rabat M. Ahmed SATRALLAH PES, IAV Hassan II de Rabat M. Mohammed ALAOUI ELBELGHITI PES, Faculté des Sciences de Rabat Faculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P RP, Rabat Maroc Tel +212 (0) /35/38, Fax : +212 (0) ,

2 قال رسول هللا عليه الصالة والسالم: (( من سلك طريقا يلتمس فيه علما سهل هللا له به طريقا إلى الجنة (( ] مسلم عن أبي هريرة] «A la lumière de la connaissance, l heureux résultat semble presque aller de soi ; tout étudiant ( ) peut l appréhender sans trop de difficulté. Mais les longues années de tâtonnements, de recherches dans le noir, avec leur lancinante tension, l alternance des périodes de confiance et de découragement, puis finalement la sortie vers la lumière, seuls ceux qui ont prouvé cela peuvent le comprendre.» A. Einstein (1934).

3 Dédicace A la mémoire de mon cher père qui aurait été fier de moi et qui était à tout moment à mes côtés pour m encourager. A ma chère mère, pour ses prières et son soutien infaillible tout au long de ces années, avec toute ma reconnaissance et mon amour. A mon frère Karim, A mes sœurs Fatima, Zahra et Siham, A mes neveux Jad et Iyad, et mes nièces: Safaa, Doàae, Nouha, Basma et Bayane, Et à ma tante Fatima pour son soutien et son affection A tous qui me sont chers

4 AVANT-PROPOS C est avec une grande joie que j arrive aujourd hui à écrire ces remerciements car ils sont la conclusion finale de toutes ces années de travail. Cette thèse doit beaucoup aux nombreuses personnes qui m ont encouragée et soutenue durant ces quelques années qui sont passées si rapidement. Je voudrais leur adresser ces quelques mots afin de les remercier Je tiens tout d abord à exprimer mes remerciements à Monsieur le Doyen de la faculté des Sciences Mohammed V de Rabat pour l importance qu il accorde à la recherche scientifique au département de Chimie. Les travaux de recherche de cette thèse ont été réalisés dans le cadre d une collaboration entre le laboratoire de Chimie- Physique générale au département de Chimie de la faculté des Sciences de Rabat et le Laboratoire de Chimie des Molécules Bioactives et de l Environnement au département de Chimie de la Faculté des Sciences de Meknès. J adresse mes sincères remerciements au directeur de ma thèse, M. Mohammed ALAOUI EL BELGHITI, Professeur au département de Chimie, Faculté des Sciences de Rabat, pour m avoir accueillie au sein de son équipe et pour m avoir fait l honneur de diriger ce travail. Je lui suis reconnaissante pour la confiance et le soutien permanent qu il m a témoigné dans ce travail ainsi que pour la grande autonomie qu il m a accordée. À ma co-directrice, Mme Touriya ZAIR, Professeur au département de Chimie à la faculté des Sciences de Meknès, je profite de l occasion qui m est ainsi donnée pour leur exprimer ma profonde reconnaissance tant pour m avoir accordée sa confiance que pour m avoir guidée dans mon travail tout au long de ces années de recherche. Son expérience, sa patience et sa disponibilité m ont été bénéfiques. Ses précieux conseils et sa gentillesse à mon égard ont contribué au bon déroulement de ce travail de recherche. Qu elle trouvera ici toute mon affection et mes remerciements pour sa présence permanente. Ma plus profonde gratitude va à Mme Souad EL HAJJAJI, Professeur au département de Chimie à la faculté des Sciences de Rabat pour m avoir honorée en acceptant de présider le Jury. J adresse mes vifs remerciements à M. Mohammed TABYAOUI Vice Doyen de la faculté des Sciences de Rabat pour sa contribution à ma thèse comme rapporteur. C est un honneur pour moi de vous compter parmi mon jury, veuillez croire en mes sentiments les plus respectueux. J exprime également mes remerceiments à M. Mohammed EL AZZOUZI, Professeur au département de Chimie à la faculté des Sciences de Rabat, pour ses qualités humaines et son soutien permanent durant les années de recherche ainsi d avoir accepté de juger mon travail. J adresse aussi mes sincères remerciements à Mme Fatima EL HILALI, professeur au département de Chimie à la faculté des Sciences de Meknès d avoir accepté de juger cette thèse. Je tiens aussi à lui exprimer toute ma gratittude et mon profond respect.

5 Je suis particulièrement reconnaissante à M. Ahmed SATRALLAH, Professeur au département de Chimie, à l Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II de Rabat, qui a aimablement accepté de faire partie du jury, et pour son soutien et sa disponibilité tout au long des années de préparation de ma thèse. Qu il soit assuré de ma respectueuse considération et de ma gratitude. Je remercie très sincèrement au professeur Ahmed BOUGHDAD de m avoir accueilli au sein du laboratoire de Protection des Plantes et de l Environnement à L Ecole Nationale de l Agriculture de Meknès pour effectuer une bonne partie des tests insecticides. Je le remercie vivement pour sa collaboration et pour son soutien dans les analyses statistiques. Je tiens également à remercier M. Mohamed IBN TATTOU, Professeur au département de Botanique à l Institut Scientifique de Rabat, pour sa contribution dans l identification des plantes étudiées. De même, je remercie M. Abdelhamid CAIDI, Professeur au département des Sciences Fondamentales à l Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II de Rabat, pour son aide et son soutien dans les analyses statistiques. Je tiens aussi à remercier mes collègues doctorants du Laboratoire de Chimie des Molécules Bioactives et Environnement pour leur constante bonne humeur et leur aide. Ainsi, je remercie particulièrement mon collègue Ismail AMALICH pour son soutien, sa générosité et sa disponibilité durant les années de recherche, et mon collègue Aziz DRIOCHE pour son aide dans la réalisation des tests antibactériens. Les moments partagés avec vous, nos échanges et nos discussions font partie des meilleurs souvenirs de cette période doctorale. Il m est particulièrement agréable de remercier tous mes collègues du Laboratoire National de l Énergie et des Mines pour leur encouragement, leur soutien et pour le réconfort qu ils ont pu m apporter. Qu ils trouvent ici le témoignage de ma reconnaissance. Un merci très sincère et affectueux à mes meilleures amies : Hafssa, Ibtissam, Bouchra, Khadija T et Khadija A. Les appels fréquents et leur soutien permanent m ont souvent permis de repartir du bon pied lorsque je me sentais découragée. Merci mes chères. C est avec un grand plaisir que je rends hommage à la mémoire de mon père et à ma mère en témoignage de ses sacrifices, ses encouragements qui m ont été particulièrement précieux, et son soutien sans pareil durant toute ma vie. J ai été particulièrement sensible à l attachement de mon frère et mes sœurs ; ils ont su être à mes côtés aux moments les plus difficiles, et m ont apporté un grand soutien moral. Je les prie, tous d accepter tous mes hommages les plus profonds. Je rends hommage à tous les membres de mes deux familles ZEKRI et IBOURK, tout particulièrement la famille de mon oncle Ahmed IBOURK, qui m ont toujours encouragée durant la préparation de cette thèse. Leur dévouement a été sans limite, et je ne saurais trouver les mots pour leur exprimer ma reconnaissance, ma gratitude et mon amour.

6 RESUME Cette thèse s inscrit dans le cadre d une contribution à la valorisation des trois plantes largement utilisées au Maroc: M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.) et M. spicata (L.) via l identification de leurs compositions chimiques en huiles essentielles (HE) et en hydrolats, le screening phytochimique de leurs extraits et l évaluation de leurs activités biologiques. La composition chimique des HE et des hydrolats de menthes, de différentes origines, a été identifiée. Les HE issues de M. pulegium (L.) sont dominées par la pulégone et/ou de la pipériténone, celles du M. suaveolens sont riches en oxyde de pipéritenone et/ou en piperitenone alors que la carvone et le limonène sont les composés majoritaires des HE du M. spicata (L.). Pourtant, le profil chimique des hydrolats renferme abondamment des composés hydrosolubles dont les composés majoritaires sont: le carvacrol et la pipériténone pour M. pulegium; l oxyde de pipériténone pour M. suaveolens, et le 1,8-cinéole et le camphre pour M. spicata (L.). Le criblage phytochimique des feuilles et/ou fleurs des menthes a permis de mettre en évidence des familles chimiques intéressantes comme les flavonoïdes, les tanins et les alcaloïdes. Ceci a été confirmé par le dosage des polyphénols totaux et des flavonoïdes. Ainsi, les teneurs obtenues en ces composés varient selon l espèce de menthe, le solvant et la méthode d extraction utilisée. L évaluation, in-vitro, de l activité antioxydante des différents extraits de menthes a été réalisée par la méthode de piégeage du radical (DPPH ). Ainsi, ces extraits présentent des activités antiradicalaires intéressantes dépendantes du contenu en polyphénols totaux et en flavonoïdes; les fractions les plus riches en flavonoïdes étant les plus actives. Les HE et les hydrolats des menthes ont été également évalués contre six souches de bactéries pathogènes. L évaluation qualitative et quantitative a montré un effet antimicrobien des HE testées à partir des valeurs obtenues des zones d inhibition et de CMI/CMB. Quant aux hydrolats, ils ont manifesté leur efficacité inhibitrice contre certaines souches. Ces travaux ont été achevés par l étude du pouvoir insecticide des HE vis-à-vis des adultes du ravageur S. oryzae, et des hydrolats à l égard d un ravageur de Citrus T. aurantii. Les HE s avèrent toutes actives mais l HE du M. suaveolens est plus efficace que celles du M. pulegium et du M. spicata. De même, l hydrolat du M. suaveolens est plus actif que celui du M. pulegium. L ensemble des résultats obtenus est une confirmation du pouvoir thérapeutique de ces menthes ainsi de leur aptitude à être une source intéressante de composés à potentialité antioxydante, antibactérienne et insecticide. Mots clés : Mentha, huile essentielle, hydrolat, polyphénols, flavonoïdes, activités antioxydante, antibactérienne, insecticide.

7 ABSTRACT This thesis is a contribution to the valorization of the three plants widely used in Morocco: M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.) and M. spicata (L.) via the identification of its essential oils (EOs) and its hydrosols chemical composition, the phytochemical screening of their extracts, and the evaluation of their biological activities. The chemical composition of EOs and hydrosols from different origins was identified. M. pulegium (L.) EOs are dominated by pulegone and/or piperitenone, M. suaveolens EOs are rich in piperitenone oxide and/or piperitenone whereas carvone and limonene are the major compounds of M. spicata (L.) EOs. However, the chemical profile of hydrosols contains abundantly water-soluble compounds and the majority compounds are: carvacrol and piperitenone for M. pulegium; piperitone oxide for M. suaveolens, and 1,8-cineol and camphor for M. spicata (L.). The phytochemical screening of the leaves and/or flowers of the mints revealed interesting chemical families such as flavonoids, tannins and alkaloids. This was confirmed by the determination of total polyphenols and flavonoids. Thus, the contents obtained in these compounds vary depending on the species of mint, the solvent and the used extraction method. The in-vitro evaluation of the antioxidant activity of the various extracts was carried out by the radical scavenging method (DPPH). Thus, these extracts exhibit important anti-radical activities dependent on the total polyphenols and flavonoids content; the richest fractions in flavonoids are the most active. Mints EOs and hydrosols were also evaluated against six pathogenic bacteria. The qualitative and quantitative evaluation showed an antimicrobial effect of the EOs tested on the basis of the values obtained from the inhibition and MIC / CMB zones. As for hydrosols, they showed their inhibitory efficiency against some strains. This work was completed by the study of the insecticidal power of the EOs against the S. oryzae adults and the hydrosol towards a pest of Citrus T. aurantii. The EOs are all active but that of M. suaveolens is more effective than those of M. pulegium and M. spicata. Similarly, the M. suaveolens hydrosol is more active than that of M. pulegium. All the obtained results are a confirmation of the therapeutic power of these mints as well as their ability to be an interesting source of compounds with antioxidant, antibacterial and insecticidal potential. Keywords: Mentha, essential oil, hydrosol, polyphenols, flavonoids, antioxidant, antibacterial, insecticidal activity.

8 LISTE DES ABREVATIONS ABTS : Sel d Ammonium de l acide 2,2 -azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique BHA : Hydroxyanisol butylé BHT : Hydroxytoluène butylé CI : Concentration d inhibition CL50 : Concentration létale à 50% CL99 : Concentration létale à 99% CMI : Concentration minimale d inhibition CMB : Concentration minimale bactéricide DPPH. : Diphényl-Picrylhydrazyle EAG : Equivalent d Acide Gallique ED : Eau distillée EQ : Equivalent de la Quercétine ERO : Espèces Réactives de l Oxygène FRAP : Ferric ion Reducing Antioxidant Parameter HE : Huiles essentielles HYD : Hydrolat IC : Intervalle de confiance IK : Indice de Kovats MHA : Mueller Hinton Agar MS : Matière sèche ORAC: Oxygen Radical Absorbance Capacity PAM : Plantes Aromatiques et Médicinales PhC : Contenu en polyphénols TBARS: Thiobarbituric Acid Reactive Substances TRAP : Total Radical-Trapping ZI : Zone d inhibition

9 LISTE DES FIGURES Figure 1: Principaux clients du Maroc pour les PAM (HCEFLCD)... 6 Figure 2: Les principales PAM exploitées au Maroc... 7 Figure 3 : (a) Acide caféique (b) Acide férulique (c) Acide salisylique (d) Acide gallique... 9 Figure 4 : Structure chimique de l acide ellagique Figure 5: Squelette moléculaire de base des flavonoïdes avec la numération classique Figure. 6 : Structure de quelques classes des flavonoïdes Figure 7: Balance oxydatif Figure 8: Action des antioxydants au cours du métabolisme des dérivés d ERO Figure 9: Acide ascorbique Figure 10 : Structure chimique des tocophérols Figure 11 : Deux exemples de caroténoïdes Figure 12 : Mécanismes d action des antioxydants phénoliques (piégeage des radicaux libres) Figure 13 : Différents états de S. oryzae. A: larve, B: nymphe, C: adulte Figure 14: (a) Puceron noir (b) Pucerons noirs de différents âges Figure 15: Aires de répartition des menthes dans le monde Figure 16: M. pulegium L Figure 17 : M. suaveolens Ehrh. ( 60 Figure 18: Feuilles de M. spicata L Figure 19: Espèces des menthes étudiées de différentes régions du Moyen-Atlas Figure 20: Rendements en polyphénols des extraits de menthes obtenus par soxhlet Figure 21: Rendements en polyphénols des extraits de menthes obtenus par macération Figure 22: Teneurs en polyphénols des extraits du M. suaveolens Ehrh Figure 23: Teneurs en polyphénols des extraits du M. pulegium L Figure 24: Teneurs en polyphénols des extraits du M.spicata L Figure 25: Teneurs en flavonoïdes des extraits du M.pulegium L Figure 26: Teneurs en flavonoïdes des extraits du M.suaveolens Ehrh Figure 27: Teneurs en flavonoïdes des extraits du M.spicata L Figure 28: Evaluation de l activité antiradicalaire in-vitro des extraits de menthes Figure 29: Pourcentage d inhibition du DPPH en fonction des concentrations de l acide ascorbique Figure 30: Pourcentage d inhibition du DPPH Figure 31: Pourcentage d inhibition du DPPH Figure 32 : Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait butanolique du M. pulegium (L.) Figure 33: Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait brut du M. spicata (L.) Figure 34: Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait d acétate d éthyle du M. spicata (L.) Figure 35: Pourcentage d inhibition du DPPH par Figure 36 : Valeurs de la CI 50 des différents extraits du M. pulegium (L.) Figure 37: Valeurs da la CI 50 de différents extraits du M. Spiata (L.) Figure 38: Pourcentage d inhibition du DPPH en fonction des concentrations de l acide ascorbique Figure 39 : Pourcentage d inhibition de DPPH par l HE du M. pulegium (L.) Figure 40 : Pourcentage d inhibition de DPPH par l HE du M. suaveolens (Ehrh.) Figure 41 : Pourcentage d inhibition de DPPH par l HE du M. spicata (L.) Figure 42 : Valeurs de la CI 50 des menthes et du standard de référence

10 Figure 43 : Tests pour la détermination de la CMI/ CMB des HE de menthes Figure 44 : Feuilles infestées par les pucerons noirs Figure 45: Taux de survie des adultes du S. oryzae fumigés par l'he du M. pulegium (L.) Figure 46: Taux de survie des adultes du S. oryzae (L.) fumigés par l'he du M. suaveolens (Ehrh.) 130 Figure 47: Taux de survie des adultes du S. oryzae (L.) fumigés par l'he du M. spicata (L.) Figure 48: Mortalité des pucerons noirs selon la Figure 49: Mortalité des pucerons noirs selon la dose de l hydrolat de M. Suaveolens (Ehrh.) Figure 50: Pourcentages de mortalités de la population de T. aurantii traitée par l hydrolat du M.pulegium (L.) Figure 51: Pourcentages de mortalités de la population de T. aurantii traitée par l hydrolat du M.suaveolens (Ehrh.)

11 LISTE DES TABLEAUX Tableau 1: Les importations en HE et extraits aromatiques les plus importantes au Maroc... 7 Tableau 2: Lieux et périodes de récolte des espèces étudiées Tableau 3: Composition chimique des HE du M. pulegium (L.) du Moyen-Atlas Tableau 4: Composition chimique des HE du M. suaveolens (Ehrh.) du Moyen-Atlas Tableau 5: Composition chimique des HE du M. spicata L. du Moyen-Atlas Tableau 6: Composition chimique des hydrolats des menthes étudiées Tableau 7: Résultats du screening phytochimique des menthes au moyen des réactions Colorées Tableau 8: Rendements d extraction des polyphénols totaux dans les trois menthes Tableau 9: Teneurs en polyphénols de différentes fractions des menthes Tableau 10: Les teneurs en flavonoïdes des différentes fractions de trois menthes Tableau. 11: Valeurs de la CI50 des extraits du M. pulegium L Tableau 12: Valeurs da la CI50 des extraits du M. spicata L Tableau 13:Teneurs en polyphénols et en flavonoïdes et Valeurs de la CI50 des extraits du M. pulegium L Tableau 14: Teneurs en polyphénols et en flavonoïdes et Valeurs de la CI50 des extraits du M. spicata L Tableau 15: Zones d inhibition des bactéries traitées par les HE de menthes Tableau 16: Valeurs des CMI/CMB des HE de menthes contre les bactéries testées Tableau 17: Zones d inhibition des bactéries traitées par les hydrolats de menthes Tableau 18: Paramètres de toxicité de l'he du M. pulegium vis-à-vis des adultes du S.oryzae Tableau 19: Paramètres de toxicité de l HE du M. suaveolens Ehrh. vis-à-vis de S. oryzae 130 Tableau 20: Paramètres de toxicité de l HE du M. spicata L. vis-à-vis des adultes du S. oryzae Tableau 21: Paramètres de toxicité des hydrolats de menthes en fonction de l âge de T. Aurantii

12 LISTE DES ARTICLES PUBLIES ET COMMUNICATIONS Articles publiés: N. Zekri, S. Amalich, A. Boughdad, M. Alaoui El Belghiti, & T. Zair, Phytochemical study and insecticidal activity of Mentha pulegium L. oils from Morocco against Sitophilus oryzae (L.). Mediterr. J. Chem. 2(4), (2013). N. Zekri, H. Sabri, S. Khannouchi, M. Alaoui El Belghiti, & T. Zair, Phytochemical study and fumigant toxicity of Mentha suaveolens (Ehrh.) essential oil from Morocco against adults of S. oryzae (L.). Aust. J. Basic Appl. Sci. 7(14) (2014), N. Zekri, S. Amalich, M. Alaoui El Belghiti &T. Zair. Phytochemical Screening and Chemical Composition of Essential Oils and Hydrosols of Mentha Species from Morocco. Advances in Environmental Biology, 8(17) September (2014), N. Zekri, N. Handaq, A. El Caidi, T. Zair & M. Alaoui El Belghiti. Insecticidal Effect of Mentha pulegium L. and Mentha suaveolens Ehrh. Hydrosols against a Pest of Citrus, Toxoptera aurantii (Aphididae). Research on Chemical Intermediates. 42 (3) (2015), N. Zekri, H. Elazzouzi, A. Drioche, A. Satrallah, M. Alaoui El Belghiti & T. Zair. Effect of Geographic Locations on Chemical Composition of M.Spicata L. Essential oils from Moroccan Middle-Atlas. Der Pharmacia Lettre, (2016), 8 (4), Chemical Characterization and Antibacterial Evaluation of Juniperus phoenicea (L.) Leaves and Fruits' Essential Oils from Eastern High Atlas (Morocco). Smail AMALICH, Nadia ZEKRI, N'Dédianhoua K. SORO, Kamal FADILI, Youssef KHABBAL, Malika MAHJOUBI, EL Hassan AKDIM, and Touryia ZAÏR. International Journal of Innovation and Applied Studies (4), pp Phytochemical screening and in-vitro antibacterial activity of an endemic plant of Morocco; Artimesia ifranensis J. Didier essential oil against bacterial strains Agrobacterium vitis and Erwinia amylovora. H. Elazzouzi, N. ZEKRI, J.G. Barnés, T. ZAIR & M. Alaoui El Belghiti. Der Pharma Chemica, 2016, 8(3): Physical and chemical properties of biodiesel from fish oil. Physical and chemical properties of biodiesel from fish oil. N. Filali, A. Slita, N. ZEKRI, H. Elazzouzi, R. Rochdi, M. El Joumani, L. El Moussaoui, O. K. Kabbaj, A. Zrineh, S. Kitane, I. Hassanain, M. Belgharza, A. Bouziane, S. Saoiabi, T. Dahass, O. Dahass & M. Alaoui El Belghiti. Der Pharma Chemica, 2016, 8(10): Comparing the density of the oils: Plant (Lio, Sunflower, Neem, Nigel) and diesel. Nadia Filali, Assia Slita, Hanane Elazzouzi, Nadia Zekri, Aicha Sifou, Layla El moussaoui, Imane Hassanain, Rajae Rochdi, Laarbi Lhammari, Faouzia Hlimi, Sanaâ Saoiabi, Mohamed Elazzouzi and Mohamed Alaoui El Belghiti. Der Pharma Chemica, 2016, 8(8):

13 Présentations orales: Nadia Zekri, Mohammed Alaoui El Belghiti &Touria Zair. Effet de séchage sur la composition chimique des huiles essentielles de M. spicata (L.) du Moyen-atlas et leur pouvoir insecticide sur les adultes de S. oryzae (L.). 1 ère Rencontre Internationale des jeunes chercheurs sur les plantes aromatiques et médicinales (Communication orale) Octobre 2014 Meknès. Smail. Amalich, Nadia. Zekri & Touriya Zair. Etude phytochimique et évaluation antibactérienne et antioxydante des feuilles et des fruits du Juniperus phoenicea. 1ère Rencontre Internationale des jeunes chercheurs sur les plantes aromatiques et médicinales Octobre 2014 Meknès. Présentations par affiche: N. Zekri, K. Lakrari, S. Khannouchi, A. Boughdad, F. El Hilali, M. Alaoui EL Belghiti & T. Zair. Étude du pouvoir insecticide de l'hydrolat de Mentha suaveolens Ehrh. et Mentha pulegium L. sur un ravageur des argumes, Toxoptera aurantii. SIPAM 4. Symposium International sur les Plantes Aromatiques & Médicinales (Communication par affiche) Mai 2011 Mohammedia. K. Lakrari, N. Zekri, M. Alaoui EL Belghiti, F., T. Zair, N. Hassanain & S. Kitane. Propriétés électriques des huiles végétales et essentielles. SIPAM 4. Symposium International sur les Plantes Aromatiques & Médicinales (Communication par affiche) Mai 2011 Mohammedia. N. Zekri, A. Boughdad, F. El Hilali, M. Alaoui EL Belghiti & T. Zair. Composition chimique et activité antimicrobienne des huiles essentielles de quelques espèces de menthes de la région de Meknès. Colloque International sur Problématique de l émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques et nouvelles approches thérapeutiques (Communication par affiche). 7-8 Octobre 2011 Meknès. T. Zair, N. Zekri, F El Makhoukhi, S. El Hajjaji, K. Lakrari, S. Mounzil & M. Alaoui EL Belghiti. Composition chimique et activité antimicrobienne des huiles essentielles de quelques espèces de menthes de la région d Azrou. Colloque international sur Chimie, Environnement et Développement durable Octobre 2011 Rabat. N. Zekri, S. Khannouchi, A. Boughdad, F. El Hilali, M. Alaoui EL Belghiti &T. Zair. Étude du pouvoir insecticide de l'hydrolat de Mentha suaveolens Ehrh. et Mentha pulegium L. sur un ravageur des argumes, Toxoptera aurantii. Journées internationales. Substances Naturelles et Développement Durable (Communication par affiche) Juin 2012 Rabat. Nadia Zekri, Smail Amalich, Houssin Sabri, Mohammed Alaoui El Belghiti &Touria Zair. Composition chimique et pouvoir insecticide des huiles essentielles de M. Pulegium et M. suaveolens du Moyen-Atlas sur les adultes du S. oryzae. 1ère Rencontre Internationale des jeunes chercheurs sur les plantes aromatiques et médicinales (Communication par affiche) Octobre 2014 Meknès. Nadia Zekri, Smail Amalich, Mohammed Alaoui El Belghiti & Touria Zair. Screening phytochimique et étude comparative de la composition chimique des huiles

14 essentielles et hydrolats des trois menthes du Maroc. 3ème édition des journées jeunes chercheurs : Innovation thérapeutique du fondamental à l appliqué (Communication par affiche) Novembre 2014 Rabat. Nadia Zekri, Smail Amalich, Mohammed Alaoui El Belghiti & Touria Zair. Phytochemical study and insecticidal effect of Mint essential oils and hydrosols from Morocco against Food pests. International Symposium the plant Kingdom: Source of Drugs, Nutraceuticals and Cosmetics (Communication par affiche) avril 2015 Marrakech. Nadia Zekri, Smail Amalich, Hannou Zerkani, Mohammed Alaoui El Belghiti & Touria Zair. Composition chimique des huiles essentielles de Mentha spicata (L.) du Moyen-Atlas et leur Pouvoir insecticide sur les adultes de Sitophilus oryzae (L.). International Environnement et Développement Durable. 8 au 10 Octobre 2015 Errachidia. Nadia Zekri, Smail Amalich, Hannou Zerkani, Mohammed Alaoui El Belghiti & Touria Zair. Composition chimique des huiles essentielles de Mentha spicata (L.) du Moyen-Atlas et leur Pouvoir insecticide sur les adultes de S. oryzae (L.). La première journée scientifique du doctorant en biologie de l USMBA. 15 Octobre 2015 Fès. Nadia Zekri, Hannou Zerkani, Smail Amalich, Mohammed Alaoui El Belghiti & Touria Zair. Etude phytochimique, Teneurs en polyphénols et Activité antioxydante des extraits de Mentha spicata L. du Moyen-Atlas Marocain. 4ème Edition des Journées Internationales Jeunes Chercheurs (JIJC4) "Chimie Thérapeutique: Compétences Plurielles. 19 et 20 Novembre 2015 El Jadida.

15 TABLE DES MATIERES AVANT-PROPOS LISTE DES ABREVIATIONS LISTE DES FIGURES LISTE DES TABLEAUX RESUME ABSTRACT TABLE DES MATIERES INTRODUCTION GENERALE... 1 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre. I: Métabolites secondaires des plantes I. Généralités sur les plantes aromatiques et médicinales (PAM) Aperçu historique de l utilisation des PAM Secteur des PAM au Maroc... 4 II. Métabolites secondaires des PAM Rôle des métabolites secondaires Classification des métabolites secondaires Les polyphénols Acides phénoliques Lignanes Coumarines Tanins Quinones Flavonoïdes Alcaloïdes Terpénoïdes et Stéroïdes Monoterpènes Sesquiterpènes Diterpènes Triterpènes et stéroïdes Tetraterpènes Autres métabolites secondaires des plantes Mucilages Oses et holosides Hétérosides cyanogéniques III. Les huiles essentielles Définition Propriétés physiques Composition chimique des huiles essentielles Contrôle qualité des huiles essentielles Répartition et fonction des huiles essentielles dans la plante Propriétés et utilisations des huiles essentielles En pharmacie En parfumerie... 22

16 6.3. En domaine agro-alimentaire Marché des huiles essentielles Toxicité des huiles essentielles Techniques d extraction des huiles essentielles L hydrodistillation La vapo-hydrodistillation L hydrodiffusion Méthodes d analyses des huiles essentielles Chromatographie en phase gazeuse Couplage CPG/SM IV. Les hydrolats Généralités Composition chimique Utilisations des hydrolats Activités biologiques et pharmacologiques des hydrolats Activité antibactérienne Activité antifongique Activité pharmacologique Activité antioxydante Chapitre. II: Activités biologiques des plantes I. Activité antioxydante des plantes Radicaux libres Le stress oxydant Les antioxydants Les antioxydants enzymatiques Les antioxydants non enzymatiques Acide ascorbique (Vitamine C) Tocophérols (dont Vitamine E) Caroténoïdes et composés phénoliques Les antioxydants de synthèse Méthodes d évaluation de l activité antioxydante II. Activité antibactérienne des plantes Problème de résistance aux antibiotiques Activité antibactérienne des huiles essentielles des plantes Description des bactéries étudiées Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Proteus mirabilis Modes d action des huiles essentielles contre les bactéries Méthodes de la détermination de l activité antibactérienne Technique en milieu solide: Méthode de diffusion Technique en milieu liquide: Méthode de dilution III. Activité insecticide des plantes Aperçu biologique sur Sitophilus oryzae (L.) Les caractères généraux de la famille des Curculionidae Origine et répartition géographique du S. oryzae (L.)... 45

17 Importance économique et dégâts Ennemis naturels Méthodes de lutte contre les insectes des denrées stockées Lutte physique Lutte chimique Lutte biologique Aperçu biologique sur Toxoptera aurantii (Aphididés) Les caractères généraux de la famille des Aphididés Origine et répartition géographique du S. oryzae (L.) Régime alimentaire Ennemis naturels Importance économique et dégâts Méthodes de lutte contre les pucerons Lutte préventive Contrôle chimique Contrôle physique Contrôle biologique Mode d action des huiles essentielles sur les insectes Chapitre. III : Monographie des espèces végétales étudiées I. Genre Mentha Présentation botanique du genre Mentha Utilisations des menthes dans la pharmacopée traditionnelle II. Mentha pulegium (L) Aspect botanique Constituants chimiques Usages thérapeutiques III. Mentha suaveolens (Ehrh.) Aspect botanique Constituants chimiques Usages thérapeutiques IV. Mentha spicata (L.) Aspect botanique Constituants chimiques Usages thérapeutiques PARTIE EXPERIMENTALE Chapitre. I: Etude phytochimique des HE et des extraits des M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.) et M. spicata (L.) I. Introduction II. Matériels et Méthodes Matériels végétaux Méthodes d extraction et d analyses des composés volatils Extraction des HE de trois menthes Extraction des hydrolats de trois menthes Analyse des HE et des hydrolats par CG/MS Criblage phytochimique Test des Alcaloïdes Test des Tanins... 70

18 3.3. Test des flavonoïdes Test des Saponosides Test des Stérols et Triterpènes Test des Anthraquinones Test des Mucilages Test des Oses et Holosides Test des Composés Réducteurs Méthodes d extraction et du dosage des polyphénols Extraction des polyphénols Extraction par macération Extraction par soxhlet Dosage des phénols totaux des trois menthes Dosage des polyphénols (Réactif de Folin-Ciocalteu) Dosage des flavonoïdes III. Résultats et Discussion Composition chimique des huiles essentielles des menthes Rendements et composition chimique des HE du M. pulegium (L.) Rendements et Composition chimique des HE de M. suaveolens (Ehrh.) Rendements et Composition chimique des HE de M. spicata (L.) Composition chimique des hydrolats des trois menthes Criblage phytochimique des parties aériennes des trois menthes Résultats du dosage des composés phénoliques Rendements d extraction des polyphénols Teneurs en polyphénols totaux Teneurs en flavonoïdes IV. Conclusion Chapitre. II: Activité antioxydante des Extraits et des HE des M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.) et M. spicata (L.) I. Introduction II. Tests in-vitro de l activité antioxydante des extraits et des HE des menthes III. Résultats Évaluation de l activité antioxydante des extraits des menthes testées Évaluation du pouvoir antioxydant des extraits du M. pulegium (L.) Évaluation du pouvoir antioxydant des extraits du M. spicata (L.) Discussion Étude de l activité antioxydante des HE des menthes testées Évaluation de l activité antioxydante de l HE du M. pulegium (L.) Évaluation de l activité antioxydante de l HE de M. suaveolens (Ehrh.) Évaluation de l activité antioxydante de l HE du M. spicata (L.) IV. Conclusion Chapitre. III: Activité antibactérienne des HE et des Hydrolats des M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.) et M. spicata (L.) I. Introduction II. Matériels et Méthodes Choix des souches bactériennes Détermination de l activité antibactérienne des HE par la méthode de diffusion sur disque sur milieu solide

19 3. Détermination de l activité antibactérienne des HE par la méthode sur milieu liquide III. Résultats et Discussion Evaluation de l activité antibactérienne des HE des menthes étudiées Evaluation de l activité antibactérienne des hydrolats des menthes étudiées IV. Conclusion Chapitre. IV: Activité insecticide des HE et des Hydrolats des M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.), et M. spicata (L.) I. Introduction II. Matériels et Méthodes Ravageurs traités Sitophilus Oryzae (L.) Toxoptera aurantii Bioessais Tests de toxicité des HE par fumigation vis-à-vis du S. oryzae (L.) Tests de toxicité des hydrolats à l égard du Toxoptera aurantii Analyses statistiques VI. Résultats des tests insecticides Evaluation de l activité insecticide des HE des menthes sur S. oryzae (L.) Etude de l activité insecticide de l HE de M. pulegium (L.) Etude de l activité insecticide de l HE du M. suaveolens (Ehrh.) Etude de l activité insecticide de l HE du M. spicata (L.) Activité insecticide des hydrolats des menthes à l égard du Toxoptera aurantii VI. Conclusion CONCLUSION GENERALE REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES Annexe 1: Profils chromatographiques des HE et des hydrolats des menthes étudiées Annexe 2: Tests de détection des métabolites secondaires des menthes étudiées Annexe 3: Tests du dosage des polyphénols dans les extraits des menthes Annexe 4: Courbes d étalonnage des standards de référence pour tester l activité antiradicalaire Annexe 5 : Zones d inhibition de la croissance antibactérienne par l HE des menthes étudiées Annexe 6 : Tests de l activité insecticide des HE et des hydrolats des menthes étudiées Annexe 7 : Résumés des articles publiés

20 INTRODUCTION GENERALE

21 Introduction Générale Depuis des milliers d années, les plantes ont occupé une place prépondérante dans la vie de l'homme. Toutes les civilisations connues ont utilisé les plantes soient sauvages soient cultivées pour subvenir à leurs besoins de base : nourriture, abris, vêtements et également pour leurs besoins médicaux. L utilisation des plantes médicinales a évolué progressivement avec l évolution des besoins de l homme. Au fil des siècles, une première distinction a pu être faite entre plantes comestibles et toxiques. Par la suite, les connaissances empiriques accumulées ont permis à l homme de prendre les plantes comme source essentielle de médicaments. L étude de ces connaissances par les sciences modernes révèle progressivement quelques secrets de la nature qui permettent à l homme de poursuivre son évolution. Jusqu'au début du 20 ème siècle, presque tous les médicaments étaient à base de plantes. Aujourd'hui encore, la médecine moderne dépend beaucoup des plantes dont leurs vertus thérapeutiques ont été confirmées. Quelles que soient les parties et les formes utilisées des plantes, elles sont extrêmement riches en structures chimiques complexes. Le métabolisme des plantes contient de milliers de différents constituants, qui appartiennent à des familles chimiques très diverses, telles que les alcaloïdes, les phénols, les flavonoïdes, les terpénoïdes, les stéroïdes. Ces métabolites secondaires, extraordinairement diversifiés, sont très exploités dans différents domaines: dans le domaine culinaire comme colorants et arômes, dans le domaine médicinal comme antibiotiques, antioxydants, drogues..etc., et dans le domaine agricole comme pesticides. En fait, les huiles essentielles (HE) sont les plus exploitéesgrâce à leur large spectre d activités biologiques connues. De nombreux composés volatils des HE sont aujourd hui des ingrédients courants des préparations pharmaceutiques comme la pulégone, le menthol et le thymol (Pauli, 2001); l α-pinène, constituant fort demandé sur le marché international, entre dans la fabrication de la vitamine E (Ghanmi et al, 2007). De même, la propriété anticancereuse de l α-humelène, sesquiterpène présent dans l'huile essentielle d'ables balsamea, a été prouvée par Legault et al. (2003). Toutefois, les hydrolats sont des coproduits des HE qui ne sont pas encore valorisés; ils sont considérés pour la plupart du temps comme un déchet de l'hydrodistillation malgré qu ils possèdent des propriétés thérapeutiques intéressantes et bien souvent différentes de celles de l'he correspondante (Price et al., 2004). Citons à titre d exemple, l'hydrolat du Hamamelis virginiana est un composant fréquent des produits dermatologiques en raison de ses propriétés désinfectantes et astringentes; malgré cela, les scientifiques ne s'y intéressent que très peu. La composition chimique et les propriétés biologiques des hydrolats peuvent être un sujet de recherche qui reste à explorer. 1

22 Introduction Générale Les plantes constituent donc une source intéressante de nouveaux composés à propriétés diverses. La recherche de ces composés se lance fort dont le but est de découvrir des nouvelles thérapies efficaces contre les maladies qui n ont pas été traitées, et de réduire l utilisation des produits synthétiques qui sont nocifs à l homme et à son environnement, comme les antibiotiques, les antioxydants et les pesticides. Malgré les tentatives faites pour répertorier les plantes et leurs extraits, le nombre d espèces étudiées demeure relativement faible compte tenu du besoin croissant en composés naturels à intérêt aromatique et/ou médicinal. Au Maroc, les espèces qui sont reconnues pour leur usage aromatique et/ou médicinal comptent environ 400 à 600 parmi 4200 espèces et sous-espèces répertoriées. Cette diversité rend le secteur des PAM au Maroc l un des plus riches au Monde. Comme le secteur ne cesse pas d évoluer, le défi qui s impose est de conserver la biodiversité et de protéger les ressources naturelles tout en augmentant la valeur ajoutée de l exploitation des PAM à l échelle nationale (CRF, 2015), d où la nécessité de la collaboration de tous les acteurs du secteur y compris les chercheurs scientifiques. Dans ce contexte, l objectif de ce travail est de contribuer à la valorisation du potentiel aromatique et médicinal national via l étude de trois espèces de menthes: M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh., et M. spicata (L.), originaires du Moyen-Atlas; une zone qui dispose d une grande diversité floristique à laquelle s ajoute une tradition séculaire de leur utilisation par la population de la région. Le choix de ces menthes a été guidé d une part sur la base de leur large utilisation par les marocains dans leur vie quotidienne et dans la médecine traditionnelle, et d autre part sur leur richesse en principes actifs très recherchés dans le domaine pharmaceutique, cosmétique, agricole et industriel. Cette richesse en fait d elles des plantes aromatiques et médicinales par excellence. De même, les HE des menthes en termes d exploitation est l une des plus importantes parmi les produits agricoles car plusieurs industries sont dépendantes des produits extraits de la menthe (El Fadl et al., 2010). Ce travail réalisé, au sein du laboratoire de Chimie des molécules bioactives et Environnement, est centré sur la recherche des substances naturelles à activité antibactérienne, antioxydante et insecticide issues des menthes et qui peuvent constituer une bonne alternative aux produits synthétiques. La démarche poursuivie pour réaliser cette étude consiste à faire une extraction et une analyse qualitative et quantitative des composés volatils de ces menthes, forts demandés par l industrie; puis, une identification de différentes familles chimiques (flavonoïdes, tanins, alcaloïdes, terpénoïdes, etc.) à partir de leurs extraits bruts afin d évaluer leurs activités biologiques. 2

23 Introduction Générale Dans la première partie de ce travail qui comporte trois chapitres, nous présentons une mise au point bibliographique décrivant les notions essentielles à la compréhension de notre travail. Le premier chapitre dresse une revue de littérature sur les PAM, les métabolites secondaires, les procédés d'extraction des HE et des hydrolats et leurs propriétés biologiques et pharmacologiques. Les deuxième et troisième chapitres traitent les activités biologiques des plantes et la monographie des espèces végétales sélectionnées pour réaliser cette étude. La seconde partie ou la partie expérimentale regroupe quatre chapitres dont le premier représente les techniques d extraction des HE et des hydrolats des menthes sélectionnées, l identification des différentes familles chimiques qu elles contiennent et le dosage des teneurs en polyphénols et en flavonoïdes dans leurs extraits. Les trois derniers chapitres sont consacrés respectivement aux tests des activités antioxydante, antimicrobienne et insecticide des espèces sélectionnées suivis d une analyse et d une discussion des résultats obtenus. Enfin, le manuscrit se terminera par une conclusion générale qui permettra de tirer quelques perspectives de prolongement à ce travail. 3

24 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

25 Métabolites secondaires des plantes Chapitre. I

26 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes I. Généralités sur les plantes médicinales et aromatiques (PAM) 1. Aperçu historique de l utilisation des PAM Depuis des milliers d années, l homme a utilisé les plantes à d autres fins que de la nourriture. Que la plante soit comestible ou toxique, il a découvert par une suite d échecs et de réussites, l utilisation des plantes pour son mieux-être. La trace d utilisations médicinales très anciennes se trouve dans les civilisations chinoise, indienne et grecque. Les médicaments étaient d origine végétale et étaient répartis dans chaque catégorie en herbes, arbres, fruits, graines et légumes (Adossides, 2003). De nos jours, et dans plusieurs pays en voie de développement, une grande partie de la population fait confiance à des médecins traditionnels et à leurs collections de plantes médicinales pour se soigner. 75% des médicaments ont une origine végétale et 25% d'entre eux contiennent au moins une molécule active d'origine végétale (Adossides, 2003). Le recours à la médecine par les plantes peut s expliquer par le fait que les plantes sont accessibles et abondantes, rendant ainsi la médecine par le traitement des plantes, abordable. De plus, les effets secondaires causés par les plantes sont minimes voire absents, au contraire des médicaments semi-synthétiques ou synthétiques (OMS, 2002). Les PAM ont eu une infinie diversité d emplois, outre que le domaine thérapeutique, à signaler les domaines alimentaire, cosmétique, industriel, etc. Elles sont importantes pour la recherche pharmacologique et l élaboration des médicaments, non seulement lorsque les constituants des plantes sont utilisées directement comme des agents thérapeutiques, mais aussi comme matière première pour la synthèse des médicaments ou comme modèles pour les composés pharmacologiquement actifs. Elles servent également pour la production de produits pharmaceutiques, thés, onguents, crèmes et autres produits naturels. Environ 90 espèces servent à la production des médicaments industriels les plus importants et les remèdes traditionnels utilisés dans les pays en développement sont généralement élaborés à partir de mélanges d'herbes issus de collectes sauvages (Decaux, 2002). 2. Secteur des PAM au Maroc L importance du secteur des PAM ne cesse d augmenter en relation, d une part, avec la forte augmentation de la demande mondiale enregistrée ces dernières décennies pour les PAM et leurs produits dérivés et, d autre part avec le nombre croissant d utilisateurs et la diversité des domaines de leur valorisation. Cette conjoncture offre une réelle opportunité de 4

27 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes développement pour le Maroc, par l adoption d une politique adéquate, dans le domaine de la gestion, l exploitation et la valorisation des PAM (HCEFSD, 2008). Le Maroc, par ses contrastes géographiques, offre une gamme variée de bioclimats allant de l humide et de sub-humide au saharien etdésertique en passant par l aride, le semi-aride et le climat de haute montagne dans le Rif, le Moyen et le Haut-Atlas où les altitudes dépassent respectivement 2500, 3000 et 4000 m (Fennane, 1987). Cette diversité a permis l installation d une flore riche (plus de 4200 espèces) et une diversité de ressources phylogénétiques en PAM (600 espèces) existant à l état spontané (Armoise, Romarin, Menthe Pouliot, Thym, Origan, etc.) ou en culture (Rosier, Verveine, Jasmin, Lavande, Menthe Verte, etc.) (Zrira, 2015). A coté de ce contexte naturel prometteur, le Maroc dispose d un savoir-faire ancestral: la médication par les plantes, leur utilisation pour l aromatisation et la conservation des aliments, ainsi que pour l extraction des principes aromatiques destinés à la parfumerie familiale ou au marché (Benslimane, 2010). Le Maroc occupe le second rang après la Turquie en biodiversité. Plus de 800 espèces sont endémiques avec un taux d endémisme qui atteint 25% dont seules 280 espèces sont exploitées (Zrira, 2015). La production des PAM au Maroc se révèle ainsi riche et diversifiée, ce qui constitue un important atout pour l établissement et le développement du secteur. Plusieurs produits y sont connus comme étant des produits typiquement marocains. Cela signifie que la profession d exploitation des PAM au Maroc, malgré ses faiblesses, a réussi à introduire sur le marché international plusieurs produits nouveaux (Benslimane, 2010). Le Maroc est un fournisseur traditionnel du marché mondial en PAM. Cette activité met en exploitation aussi bien les plantes spontanées que les plantes cultivées, fraiches ou séchées. Selon les chiffres du HCEFLCD, les quantités moyennes cédées annuellement sont estimées de tonnes (Babba, 2015). Plus d une vingtaine d espèces sont utilisées pour la production d huiles essentielles ou d autres extraits aromatiques destinés essentiellement à l industrie de parfumerie et cosmétique ainsi que pour la préparation des produits d hygiène et la formulation des arômes (Zrira, 2015; Benslimane, 2010). La cueillette des plantes spontanées représente plus de 98% de la production nationale. Cette catégorie englobe une large gamme de plantes dont les plus importantes sont le thym, le romarin, le caroubier, la menthe pouliot, l origan, l arganier et les feuilles de laurier. Parmi les 5

28 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes principales PAM cultivées au Maroc, on peut citer: le géranium, la lavande, la rose, le jasmin, la verveine, la menthe et le safran (Babba, 2015; Zrira, 2015). Par ailleurs, l exploitation et le commerce des PAM au Maroc représentent pour plusieurs familles, surtout dans les zones rurales les plus défavorisées où l activité économique est potentiellement très faible, une source de revenue non négligeable en plus de petites entreprises ou coopératives qui se sont développées ces dernières années (Zrira, 2015). Actuellement, le Maroc est classé 12ème exportateur mondial des PAM. Les principales destinations des exportations marocaines en PAM sont le marché de l UE, mais l'ouverture sur d'autres destinations (Japon, Canada, Suisse, Espagne, Allemagne) a permis d'augmenter les volumes (Figure 1). Figure 1: Principaux clients du Maroc pour les PAM Plus de 50% de ces exportations concernant le secteur alimentaire (épices, arômes...), alors que 35% sont destinées à la parfumerie et à la cosmétique contre environ 5% sont exploitées pour leurs propriétés médicinales (Figure 2). Depuis l année 2005, les exportations marocaines des PAM connaissent une augmentation importante. Ainsi, la valeur des exportations de PAM est passée de 67 MDH en 2002 à 233 MDH en La valeur des exportations des HE quant à elle est passée de 62 MDH en 2005 à 139 MDH en

29 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Figure 2: Les principales PAM exploitées au Maroc Quant aux principaux produits importés, ils concernent les condiments dont, à part le cumin, l importation ne peut être remplacée par des productions locales. Il s agit du poivre qui vient en tête avec 43% des quantités globales importées suivi du gingembre (16%), du cumin (12%), du curcuma (9%), de la cannelle (9%) et du girofle (5%) (Babba, 2015). Ainsi, les importations en huiles essentielles (HE) et extraits aromatiques (EA) les plus importantes au Maroc sont représentées dans le Tableau 1 (Zrira, 2015): Tableau 1 : Les importations en H.E et extraits aromatiques les plus importantes au Maroc Produit Quantités moyennes en (t) HE d'eucalyptus 7 HE de menthe 7,8 HE d'orange 4,8 Autres HE 43,2 Eau distillée aromatique & solutions d HE 23,4 Enfin, les PAM constituent des ressources à forte valeur ajoutée; les recettes moyennes annuelles des ventes de PAM par adjudication sont de l'ordre de 5,3 millions de dirhams pour une quantité annuelle d'environ tonnes ajoutant que les PAM procurent des revenus alternatifs aux communautés locales, générant en moyenne quelques journées de travail/an (Babba, 2015). II. Métabolites secondaires des PAM Les plantes possèdent des métabolites dits secondaires par opposition aux métabolites primaires que sont les protéines, les glucides et les lipides. Ces composés diffèrent selon les espèces et ils regroupent plusieurs dizaines de milliers de molécules différentes, généralement rassemblés en superfamilles chimiques tels que les polyphénols, les terpènes et stérols, les 7

30 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes alcaloïdes, les polycétides, etc. Outre la très grande diversité chimique qu ils représentent, ces métabolites secondaires se caractérisent généralement par de faibles concentrations dans les tissus végétaux ainsi que par leur stockage souvent réalisé dans des cellules ou organes dédiés. Ils sont très différents selon les espèces et s accumulent en faible quantité. Leurs rôles dans la physiologie des plantes ne sont pas encore tous élucidés (Bourgaud, 2013). La diversité des espèces utilisées et des métabolites secondaires déjà isolés laisse présager de l'ampleur de ce qui reste à découvrir. On considère effectivement que, jusqu à ce jour, moins de 10 % des espèces de végétaux supérieurs qui peuplent actuellement la planète ont été explorées pour leurs propriétés chimiques et biologiques (Krief, 2003). 1. Rôle des métabolites secondaires Pour ce qui concerne leurs fonctions chez les plantes, les métabolites secondaires exercent un rôle majeur dans l adaptation des végétaux à leur environnement. Ils assurent des fonctions clés dans la résistance aux contraintes biotiques (phytopathogènes, herbivores, etc.) et abiotiques (UV, température, etc.). Sur le plan agronomique, le rôle de ces composés dans la protection des cultures est connu (résistance aux maladies cryptogamiques, aux infections bactériennes, à certains insectes). Ils constituent, aujourd hui, un des leviers d une possible intensification écologique de l agriculture, par substitution notamment de l usage d intrants chimiques par des mécanismes de défense naturelle des plantes (Bourgaud, 2013). D un point de vue pharmacologique, les métabolites secondaires constituent la fraction la plus active des composés chimiques présents chez les végétaux et on estime aujourd hui qu environ 1/3 des médicaments actuellement sur le marché contiennent au moins une telle substance végétale. Cette efficacité pharmacologique s est traduite par le développement de médicaments majeurs sur les 30 dernières années, tel que le Taxotère, ou la Vinorelbine utilisés dans le traitement de certains cancers (Newman et al., 2012). 2. Classification des métabolites secondaires On peut classer les métabolites secondaires en plusieurs grands groupes: parmi ceux ci, les composés phénoliques, les terpènes et stéroïdes, et les composés azotés dont les alcaloïdes. Chacune de ces classes renferme une très grande diversité de composés qui possèdent une très large gamme d'activités en biologie humaine. Ces classes sont présentées ci-après. 8

31 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes 2.1. Les polyphénols Les composés phénoliques constituent une famille de molécules très largement répandues dans le règne végétal. Ils sont des produits de métabolites secondaires des plantes depuis les racines jusqu aux fruits. Malgré qu ils n exercent pas une fonction directe dans l organisme végétal (croissance ou reprodution) mais ils jouent un rôle fondamental aux niveaux sensoriel (couleur et caractères organoleptiques) et nutritionnel. Les polyphénols prennent une importance croissante, notamment à cause de leurs effets sur la santé. En effet, leurs rôles d antioxydants naturels suscitent de plus en plus d intérêt pour la prévention et le traitement du cancer, des maladies inflammatoires, des maladies cardiovasculaires et des maladies neurodégénératives. Ils sont également utilisés comme additifs pour l industrie agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique (Bruneton, 2009). Les polyphénols sont communément subdivisés en acides phénoliques, en coumarines, en quinones, en flavonoïdes, en lignanes et en tanins Acides phénoliques Ce sont des composés qui se dérivent en deux groupes distingués: les acides hydroxycinnamiques tels que l acide caféique et l acide férulique, et les acides hydroxybenzoiques dont les plus répandus sont l acide salicylique et l acide gallique (Figure 3). Ils se trouvent dans un certain nombre de plantes médicinales et présents chez toutes les céréales. En outre, ce sont des substances phytochimques considérées comme non toxiques. a b c d Figure 3: (a) Acide caféique (b) Acide férulique (c) Acide salisylique (d) Acide gallique 9

32 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Ils sont anti-inflammatoires, antiseptiques, antiradicalaires, cholagogues, hépatoprotecteurs, cholérétiques, immunostimulants (Bruneton, 2009). Les acides caféique et ferulique manifestent un pouvoir anticancéreux au niveau des poumons chez les souris alors que l acide gallique a montré le même effet en prévenant le déclanchement du cancer oesophagien chez les rats (Laraoui, 2007) Lignanes Les lignanes constituent une classe importante de métabolites secondaires dans le règne végétal. La distribution botanique des lignanes est large: plusieurs centaines des composés ont été isolés dans environ soixante-dix familles. Chez les végétaux supérieurs, ils ont été identifiés dans tous les tissus, ils ont été découverts dans toutes les parties des plantes : les racines, les feuilles, les fruits et les graines (Midoun, 2011). Ils présentent plusieurs activités biologiques: antivirale, antibactérienne, anticancéreuse et antioxydante (Pan et al., 2009) Coumarines Les coumarines ont été isolées pour la première fois en Elles sont présentes en quantités plus faibles dans plusieurs plantes comme le mélilot, la sauge sclarée et lavande, On la trouve aussi dans le miel, le thé vert, etc. Les coumarines sont des substances naturelles connues, issues du métabolisme de la phénylalanine via un acide cinnamique et l acide ƿ- coumarique (Harkati et al., 2011). Elles constituent, avec les flavonoïdes, les chromones et les isocoumarines, un très vaste ensemble de substances (Djmoui, 2012). Les coumarines libres sont solubles dans les alcools et dans les solvants organiques tels que l éther ou les solvants chlorés avec lesquels on peut les extraire. Les formes hétérosidiques sont plus ou moins solubles dans l eau. Elles ont un spectre UV caractéristique, fortement influencé par la nature et la position des substituants, profondément modifié en milieu alcalin (KOH, NaOCH3) (Bruneton, 2009). Les coumarines manifestent diverses activités biologiques; elles sont cytotoxiques, antivirales, immunostimulantes, tranquillisantes, vasodilatatrices, anticoagulantes, hypotensives; elles sont bénéfiques en cas d infections cutanées. Ils sont très utilisés en parfumerie et dans les produits cosmétiques. Les coumarines sont indiquées dans le cas de lymphoedème du membre supérieur après traitement radio-chirugical du cancer du sein (Gonzalez et al., 1997). 10

33 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Tanins Les tanins sont des substances d'origine organique que l'on trouve dans pratiquement tous les végétaux, et dans toutes leurs parties (écorces, racines, feuilles, etc.), caractérisés par leur astringence (sensation de dessèchement en bouche). Ils se composent en deux grands groupes : les tanins hydrolysables ou tanins galliques qui sont des esters de l acide gallique ou l acide ellagique (Figure 4) et les tanins condensés non hydrolysables ou tanins catéchiques dérivant des catéchols et des proanthocyanidols par condensation (Mamado, 2002). Figure 4 : Structure chimique de l acide ellagique La principale utilisation des tanins est le tannage des peaux ; ils confèrent aux cuirs leurs qualités d'imputrescibilité. Ils ont la propriété de précipiter les protéines (fongiques ou virales) et les métaux lourds. Ils favorisent la régénération des tissus et la régulation de la circulation veineuse, tonifient la peau dans le cas des rides. Ils sont abondants dans les organes végétaux jeunes. Certains tanins auraient des propriétés antioxydantes et bactériostatiques. Ils sont également utilisés dans les encres (par réaction avec des sels ferriques), la teinture d'étoffes, l encollage du papier ou de la soie, la coagulation du caoutchouc. Au niveau biochimique, ce sont des composés faisant précipiter les protéines. Lorsqu'il s'agit de celles de la salive, la lubrification de la bouche fait alors défaut, expliquant la sensation d'assèchement. Ils stopperaient également le développement des microbes. L'acide tannique est utilisé en médecine externe comme astringent antidiarrhéique Quinones Ce sont des substances colorées et brillantes, en général rouges, jaunes ou orange et possédant deux fonctions cétones. On trouve les quinones dans les végétaux, les champignons, les bactéries. Les organismes animaux contiennent également des quinones, comme par exemple la vitamine K, qui est impliquée dans la coagulation du sang. Les quinones sont utilisées dans les colorants, dans les médicaments et dans les fongicides (Kansole, 2009). 11

34 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Ils se subdivisent en benzoquinones, en naphtaquinones utilisés comme des colorants pour les cheveux et des fongicides, et en anthraquinones. Ces derniers sont des substances très répandues chez les plantes. Le goût amer typique est dû à ces composés. En outre, ils ont montré leurs activités anti-inflammatoires, analgésiques, antipyrétiques, antimicrobiennes et anti-tumorales (Liu et al., 2011) Flavonoïdes Les flavonoïdes sont formés d un squelette à 15 atomes de carbone (C6-C3-C6) correspondant à la structure du diphénylpropane. Deux cycles aromatiques (A et B) sont liés par une chaîne de 3 carbones formant un hétérocycle oxygéné (C) (Figure 5). Figure 5: Squelette moléculaire de base des flavonoïdes avec la numération classique Les flavonoïdes occupent une place prépondérante dans le groupe des phénols. Actuellement, près de 5000 flavonoïdes ont été décrits. On estime que 2 % environ du carbone organique photosynthétisé par les plantes, soient quelques 10 9 tonnes par an, est converti en flavonoïdes. Leur fonction principale semble être la coloration des plantes (thé, raisin, baies, agrumes). Les couleurs orange, rouge et bleue des légumes, fruits, fleurs et tissus de stockage des plantes sont dues à des anthocyanes hydrosolubles. Ils agissent dans les systèmes de défense des cellules végétales en réponses à certains stress telles que les radiations ultraviolettes. Ce sont également des inhibiteurs d enzymes, des agents chélatants des métaux nocifs aux plantes. De plus, ils sont impliqués dans la photosensibilisation et les transferts d énergie, la morphogenèse et la détermination sexuelle, la photosynthèse et la régulation des hormones de croissance des plantes (Pietta, 2000). a. Classe des flavonoïdes En basant sur leur squelette, les flavonoïdes peuvent être divisés en différentes classes: anthocyanidines, flavonoles, isoflavonoles, flavones, isoflavones, flavanes, isoflavanes, flavanols, isoflavanols, flavanones, isoflavanones et aurones (Bruneton, 2009) (Figure 6). 12

35 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Les flavonones et les flavonols Ils représentent environ 80% des flavonoïdes connus. La principale activité attribuée à ces flavonoïdes est une propriété vitaminique P veino-active. Ils diminuent la perméabilité des capillaires sanguins et renforcent leur résistance. Souvent anti-inflammatoires, ils peuvent être antiallergiques, hépato-protecteurs, antispasmodiques, diurétiques, antibactériens, antiviraux. Les isoflavones Leur distribution est restreinte et sont presque spécifiques des Fabaceae, de certaines Mimosaceae et des combretaceae. Les plus représentés sont des isoflavonones, des isoflavènes, des isoflavanes. Ce sont des produits de défense naturelle, de puissants oestrogènes, insecticides, antitumoraux, réducteurs des manifestations de la ménopause (bouffée de chaleur). Figure. 6 : Structure de quelques classes des flavonoïdes b. Distribution dans les plantes A de rares exceptions, seules les plantes ont la capacité de biosynthétiser des flavonoïdes. Ils peuvent être présents dans toutes les parties des plantes (racine, tiges, bois, feuilles, fleurs et fruits). Ils se trouvent sous forme libre (aglycone) mais dans la majorité des cas sous forme glycosilée car la glycosylation a pour effet de les rendre moins réactifs et plus hydrosolubles 13

36 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes permettant alors leur stockage dans les vacuoles des cellules épidermiques des fleurs, de l épiderme et du mésophylle des feuilles, des parenchymes des tiges et racines (Bruneton, 2009). Il est à noter que les flavanones et les flavones sont souvent présentes dans la même plante. Les flavones et flavonols ne se trouvent généralement pas ensemble, pas plus que les flavanols et les anthocyanes (Merken et al., 2000). c. Propriétés biologiques La propriété fondamentale des flavonoïdes est leur caractère antioxydant offrant des fonctions biochimiques particulièrement intéressantes pour notre santé. Les flavonoïdes ont la capacité de piéger les radicaux libres comme les superoxydes, les radicaux peroxydes ou les radicaux hydoxyles par transfert d hydrogène, qui sont générés par notre organisme en réponse aux agressions de notre environnement (cigarette, polluants, infections, etc.) et qui favorisent le vieillissement cellulaire. Ces composés renforcent nos défenses naturelles en protégeant les constituants tissulaires (Pietta, 2000). Ils jouent un rôle important dans la fonction immunitaire, l'expression génique, la circulation sanguine dans les capillaires et le cerveau, la fonction hépatique, l'activité enzymatique, l'agrégation des plaquettes et le métabolisme du collagène, des phospholipides, du cholestérol et de l'histamine (Messai, 2011). Actuellement, d autres propriétés sont largement étudiées par domaine médical, où on leur reconnaît des activités anti-virales, anti-radicalaires, anti-allergiques, anti-tumorales, antiinflammatoires et anti-cancéreuses. Les flavonoïdes ont pour effet d'inhiber l'activité d'une enzyme, la topoisomérase II, qui joue un rôle essentiel dans l'apparition du cancer. Ainsi, de nombreuses plantes sont maintenant classées dans la catégorie des protecteurs vasculaires: ginkgo, hamamélis, cyprès, noisetier, petit houx, marron d'inde, sarrasin, grâce à l'effet synergétique des flavonoïdes. Ils peuvent aussi prévenir la douleur musculaire en accélérant la réparation des tissus au niveau moléculaire. Outre leurs propriétés anti-inflammatoires et anti-obstructives, Ils accélèrent le processus de destruction des agents pathogènes en améliorant la capacité des macrophages à les neutraliser par transformation rapide des macrophages en antigènes (Messai, 2011) Alcaloïdes Ce sont des substances organiques azotées d origine végétale à caractère alcalin et présentant une structure moléculaire hétérocyclique complexe douées à faible dose de propriétés pharmacodynamiques marquées. Leurs noms se terminent toujours par «ine». 14

37 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Généralement, les alcaloïdes sont produits dans les tissus en croissance : jeunes feuilles, jeunes racines puis, ils gagnent ensuite des lieux différents et, lors de ces transferts, ils peuvent subir des modifications. Chez de nombreuses plantes, les alcaloïdes se localisent dans les pièces florales, les fruits ou les graines, ces substances sont trouvées concentrées dans les vacuoles. Ce sont des composés relativement stables qui sont stockés dans les plantes en tant que produits de différentes voies biosynthétiques (Mauro, 2006). Le plus souvent, la synthèse de ces alcaloïdes s effectue au niveau de sites précis (racine en croissance, cellules spécialisées de laticifères, chloroplastes); ils sont ensuite transportés dans leur site de stockage (Rakotonanahary, 2012). Les alcaloïdes sont caractérisés par une solubilité faible dans l eau, facilement solubles dans l alcool et peuvent donner des colorations spécifiques avec certains réactifs (réactifs de Mayer, de Dragendorf, de Wasicky, de Bouchardat). Les alcaloïdes tout d abord, ont des effets bénéfiques sur la plante synthétisante: lls régulent la croissance et le métabolisme interne végétaux, ils désintoxiquent et transforment les substances nocives au végétal, ils protègent la plante contre les rayons ultraviolets comme ils ont des effets contre les herbivores (Mauro, 2006). Ils sont utilisés dans plusieurs médicaments, ils affectent chez l être humain le système nerveux particulièrement les transmetteurs chimiques tels que l acétyl choline, norepinephrine, l acide γ-aminobutyrique (GABA), dopamine et la sérotonine. Les alcaloides exercent de puissantes actions pharmacologiques qui sont généralement variées et dépendent de leurs composantes chimiques telles que l effet analgésique (cocaïne), anti-cholinergique (atropine), anti-malaria (quinine), anti-hypertensive (réserpine), antitussive (codéine), stimulant centrale (caféine), dépressant cardiaque et diurétique narcotique (morphine), anti-tumeur et sympathomimétique (éphédrine) (Badiaga, 2011) Terpenoîdes et Stéroides Ils constituent le plus vaste ensemble connu des métabolites secondaires des végétaux. Tous les terpènes et stéroïdes peuvent être considérés comme formés par l assemblage d un nombre entier d unités pentacarbonés ramifiés du 2-méthylbutadiène. Leur intérêt thérapeutique et leur emploi industriel (parfumerie) font de ce groupe de métabolites secondaires un groupe d intérêt (Kansole, 2009). Les terpènes sont les constituants majeurs de l'he. Cependant si l'on peut connaître les effets de monoterpènes ou de sesquiterpènes isolés, il est difficile de savoir les effets 15

38 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes synergiques des huiles des terpènes qui sont composés par des essences et de mélanges complexes et variées. Beaucoup de drogues doivent leurs propriétés aromatiques aux composés terpéniques des essences. Les terpènes non cycliques sont en grande partie responsables de l'odeur suave des plantes et des fleurs et dont quelques-unes sont employées en parfumerie. Ces substances possèdent aussi des propriétés pharmacodynamiques très variées, en relation avec les différentes fonctions liées au squelette terpénique. La classification des terpenoïdes est basée sur le nombre de répétitions de l unité de base isoprène en donnant des hémiterpènes (C5), monoterpènes (C10), sesquiterpènes (C15), diterpènes (C20), sesterpènes (C25), triterpènes (C30), tetraterpènes (C40) et polyterpènes (Mebarki, 2010). Les types les plus importants seront cités ci-après: Monotepènes Les monoterpènes sont les plus simples constituants des terpènes dont la majorité est rencontrée dans les huiles essentielles. Ce sont des molécules légères, très odorantes, la plupart ont des activités biologiques reconnues et sont caractéristiques des plantes d où elles sont originaires. Plus de 900 monoterpènes connus se trouvent principalement dans trois catégories structurelles: les monoterpènes linéaires (acycliques), les monoterpènes avec un cycle unique (monocycliques) et ceux avec deux cycles (bicycliques) et tricycliques Sesquiterpènes Les sesquiterpènes, molécules en 15 atomes de carbones, se trouvent sous forme d hydrocarbures, ou sous forme d hydrocarbures oxygénés comme: les alcools, les cétones, les aldéhydes, les acides et les lactones dans la nature. Les sesquiterpènes et les monoterpènes sont souvent en mélange dans les huiles essentielles des plantes, On peut également rencontrer dans les plantes des sesquiterpènes lactones. Ils peuvent être acycliques, monocycliques, bicycliques, tricycliques ou polycycliques. On les trouve surtout chez les plantes supérieures, mais également chez les invertébrés. Ils sont les plus diversifiés des terpènes puisqu ils contiennent plus de 3000 molécules (Benaissa, 2011). 16

39 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Diterpènes Ces composés en C20 sont particulièrement abondants chez les Lamiacées et les Astéracées même si certains, telles les gibberellines, à rôle d hormone de croissance, sont universels. On peut les trouver encore dans les résines et les gommes naturelles. Ils peuvent être acycliques comme le phytol; dont il est le représentant le plus connu dans la chlorophylle ou dans les vitamines K et E, cependant après divers réarrangements, ils peuvent être monocycliques comme la vitamine A, bicycliques comme le sclaréol ou tricycliques comme l acide abiétique. Les plus interessants sur le plan pharmacologique sont les diterpènes tricycliques issus de différentes espèces comme Taxus baccata L.; le taxol et docétaxel sont utilisés dans le traitement des tumeurs de l ovaire et dans celui des cancers du poumon et du sein Triterpènes et stéroïdes Les triterpènes sont des molécules à 30 atomes de carbone ayant comme précurseur le squalène. Il y a plus de 1700 triterpènes dans la nature dont la majorité est sous forme tétracyclique ou pentacyclique, la forme acyclique étant très rare. Les stéroïdes ne sont pas des terpènes mais des composés de biodégradation de triterpènes. Ils constituent une classe de composés abondamment présents dans la nature. Les stérols sont des constituants essentiels des membranes cellulaires. On les trouve aussi bien chez les animaux que dans les végétaux. Ce sont des métabolites secondaires dont l intêret thérapeutique et l emploi industriel est majeur. On peut en particulier noter l intêret des hétérosides cardiotoniques qui constituent les squelettes de base des contraceptifs, des anabolisants et des anti-inflammatoires. Mais il faut souligner les problèmes liés aux saponosides qui peuvent expliquer la toxicité de certaines plantes (Krief, 2003). Saponosides Ce sont des hétérosides de stérols et de triterpènes très répandus chez les végétaux.les saponosides sont caractérisés par leurs propriétés tensioactives (abaisse la tension superficielle). Ils se dissolvent dans l eau en formant une solution moussante (aphrogènes). Ils jouent un rôle de défense du végétal contre les pathogènes microbiens. Certaines drogues à saponosides sont utilisées pour leurs propriétés antitissuves, mais aussi anti-oedémateuses ou encore analgésiques (Bruneton, 2009). 17

40 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes cardiotoniques Ils sont présents notamment dans les familles des Asclepiadaceae et des Apocynaceae. L activité cardiotonique est liée à la génine. Elle se traduit par une augmentation de la contractilité, une diminution de la fréquence cardiaque et une diminution de la vitesse de conduction à la jonction auriculoventriculaire (Krief, 2003) Tétraterpènes Les tetraterpènes contiennent une longue chaîne de 40 atomes de carbones, à doubles liaisons conjuguées de configuration «trans» dont les extrémités sont des chaînes ouvertes ou des cycles. Les tétraterpènes les mieux connus sont les caroténoïdes. Ces derniers représentent un large groupe de pigments naturels de couleurs jaune, orange et rouge. Ils sont très répandus dans les plantes, les algues, et différents microorganismes. Actuellement environ 750 caroténoïdes ont été identifiés dans la nature. Les molécules de caroténoïdes les plus réputées sont: le β-carotène cyclique d'où sa couleur, qu'il donne aux carottes, Il joue un rôle essentiel dans la croissance et la vision, son oxydation provoque la formation de deux molécules d'un aldéhyde le Rétinal et sa réduction donne la vitamine A et le lycopène qui est entièrement acyclique, que l on trouve dans la tomate mure. Les caroténoïdes sont employés en industrie agro-alimentaire principalement pour leur pouvoir colorant (safran) mais ils sont préconisés en cas de photodermatose puisqu ils interfèrent avec les processus de photo-oxydation Autres metabolites secondaires des plantes Mucilages Les mucilages sont constitués de polysaccharides qui gonflent au contact de l eau. Ils sont classés selon leur facteur de gonflement dont la méthode de détermination est définie par la Pharmacopée. Les mucilages sont plus couramment utilisés comme adjuvants dans les préparations pharmaceutiques. Les mucilages végétaux sont pharmaceutiquement des polysaccharides importantes avec large gamme d'applications telles qu épaississant, désagrégation, suspension, émulsifiants, stabilisants et gélifiants. Ils ont été également utilisés comme matrices pour les médicaments à libération prolongée et contrôlée. Les mucilages naturellement disponibles sont préférés aux synthétiques matériaux en raison de leur nontoxicité, faible coût, émollientes et la nature non irritante (Malviya et al., 2011). 18

41 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Oses et holosides Les oses sont des sucres simples tandis que les holosides sont des associations d un même ose ou d oses différents. Ces composés représentent le groupe le plus important des éléments plastiques et énergétiques des végétaux et de leur substance de réserve (Paris et al, 1976) Hétérosides cyanogéniques Les Hétérosides cyanogéniques sont des hétérosides dont la génine est le nitrile alcool: ce sont des stimulants respiratoires à faible dose mais toxiques à dose élevée (Diallo, 2005). III. Les huiles essentielles 1. Définition Les huiles essentielles (HE) sont définies comme étant des extraits végétaux volatils et odorants, appelées également substances organiques aromatiques liquides, qu'on trouve naturellement dans diverses parties des arbres, des plantes et des épices, elles sont volatiles et sensibles à l'effet de la chaleur (Evans, 1998). Selon la pharmacopée française (4 ème édition 2000), les HE sont considérées comme des produits de composition généralement assez complexe contenant des principes volatils. 2. Propriétés physiques Les HE sont volatiles et liquides à température ambiante, ce qui les différencie des huiles fixes. Elles sont très rarement colorées et dotées d une odeur et saveur généralement fortes. Elles sont peu miscibles à l eau, par contre elles sont assez solubles dans les solvants organiques (Wichtl et al., 2003). 3. Composition chimique des huiles essentielles Ce sont des mélanges complexes et variables de constituants appartenant exclusivement à deux groupes caractérisés par des origines biogénétiques distinctes: le groupe des terpénoîdes d'une part se compose principalement de monoterpènes et de sesquiterpènes, et le groupe des composés aromatiques dérivés du phénylpropane beaucoup moins fréquent d'autre part. On retrouve également des composés en (C6-C1) comme la vanilline ou comme l'anthramilate de méthyle. Le poids moléculaire des composés est assez faible, généralement compris entre 150 et 200 (Bruneton, 2009). 19

42 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes 4. Contrôle qualité des huiles essentielles Vu l'importance industrielle des HE, leur qualité s'impose depuis le producteur, en passant par l'industriel jusqu'au consommateur. Cette exigence se traduit nécessairement par l'établissement de normes de qualité, élaborées pour des considérations de santé et de sécurité dans différents domaines d'applications des HE. Ces normes ont été définies par AFNOR et " Essential Oils Association" (EOA). Ainsi, l'analyse des HE porte sur les caractéristiques physico-chimiques et la composition chimique (AFNOR, 1999). A ces paramètres, on peut aussi ajouter les caractéristiques organoleptiques telles que l'aspect, la couleur et l'odeur. Les HE possèdent un indice de réfraction élevé et, le plus souvent, elles sont douées d'un pouvoir rotatoire. Leur densité est plus souvent inférieure à celle de l'eau. Elles sont solubles dans l'alcool, l'éther, les huiles fixes et la plupart de solvants organiques. Les indices d acide et d ester sont aussi des éléments physiques différenciant les HE. 5. Répartition et fonction des huiles essentielles dans la plante Les HE n'existent quasiment que chez les végétaux supérieurs, les genres, qui sont capables de les élaborer, sont regroupés dans un nombre restreint de familles comme les Lamiaceae, Lauraceae, Asteraceae, Rutaceae, Myrtaceae, Poaceae, Cupressaceae, Piperaceae (Bruneton, 2009). Généralement, elles sont présentées en très petite quantité: 1 à 2% de la matière sèche au maximum. Elles peuvent être stockées dans tous les organes végétaux mais leur composition peut varier selon leur localisation dans la plante. Différents facteurs font varier la composition des HE: Les facteurs intrinsèques: - Les différentes parties de la plante: les fleurs et les feuilles de juniperus phoenicia, par exemple, présentent une composition chimique différente (Mansouri et al., 2011) ainsi les feuilles de Tetraclinis sont plus riches en monoterpènes oxygénés et hydrocarbonés que les rameaux (Bourkhis, 2010). - Le cycle de la plante: la biosynthèse engendre une accumulation plus ou moins importante de certains constituants des chaînes métaboliques au cours des saisons, des mois, voire des journées. Le profil chimique de l'he de la menthe, par exemple, peut être différent au cours de la journée. Une menthe poivrée est riche en néomenthol et en menthone en début de floraison alors qu en fin de floraison cette huile est riche en menthol (Bruneton, 2009). Le chimiotype par exemple, la fenchone s'accumule dans l'he de fenouil amer, alors que le 20

43 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes fenouil doux offre deux chimiotypes différents: l'un à anethole, l'autre à estragol (Wichtl et al., 2003). les facteurs extrinsèques: Les facteurs externes qui peuvent influer sur la composition chimique des HE sont la méthode d extraction utilisée, les produits et les réactifs utilisés dans l'extraction, la nature du sol, la région d origine, la température, l'humidité, le degré de séchage, les conditions de séchage, le temps de séchage, et la présence de parasites, des virus et des mauvaises herbes (Figueredo, 2012). 6. Propriétés et utilisations des huiles essentielles Le domaine d'utilisations des huiles essentielles est diversifié. Outre l'emploi strictement médical des HE, celles-ci sont utilisées dans de nombreux domaines tels que la parfumerie, la cosmétologie, l'agro-alimentaire et l'industrie chimique (Nzeyumwami, 2004) En pharmacie Il y a sept huiles essentielles inscrites à la pharmacopée européenne en 1999: HE d'anis, d'eucalyptus, de clou de girofle, de fleur d'oranger amer, de lavande, de menthe poivrée et de thym. La pharmacopée permet de normaliser les complexes que peut entrainer l emploi d une huile et de contrôler sa qualité (Couderc, 2001). Les propriétés pharmacologiques des HE leurs confèrent une utilisation médicale. Elles ont un pouvoir antiseptique contre des bactéries variées ainsi que des champignons et levures. Citons les HE de thym, girofle, lavande et eucalyptus. Le thymol, constituant principal de l'he de thym, est 20 fois plus antiseptique que le phénol (Bruneton, 2009). On note également les HE de thymus vulgaris, thymus zygis et Origanum vulgare qui sont testées pour leurs propriétés antifongiques (Kaloustian et al., 2008) et l HE de thymus numidicus Poiret pour son pouvoir antiradicalaire (Djeddi et al., 2015). Les drogues à HE de la menthe et la verveine sont réputées dotées de propriétés spasmolytiques et sédatives ; elles sont efficaces contre les spasmes gastro-intestinaux (Couderc, 2001). L HE du géranium est utilisée pour ses propriétés antispasmodiques et celle de la menthe verte est utilisée dans les sirops. Certaines huiles peuvent être vendues comme telles en petits flacons ou sous forme de vaporisateurs, de pastilles, de bonbons,.etc; elles peuvent également être utilisées comme inhalants pour soulager les difficultés respiratoires ainsi pour rafraichir ou soulager la gorge (Grysole, 2005). 21

44 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes 6.2. En parfumerie L utilisation des HE comme base dans la fabrication de parfums constitue une pratique courante depuis des siècles dans la plupart des civilisations (Grysole, 2005). La parfumerie constitue le principal débouché des HE en plus de la cosmétologie et le secteur des produits d'hygiène qui sont également consommateurs (Couderc, 2001). Le secteur de l'industrie pharmaceutique connait la plus forte croissance annuelle, soit 15 à 20%. Elles sont rentrées dans les préparations des analgésiques pour la peau, les produits solaires ainsi que de nombreux produits d'ambiance comme les liquides pour pots-pourris. Elles sont integrées également dans des préparations pour bains relaxants avec possibilité d'absorption percutanée de ces constituants (Bruneton, 200). Le menthol par exemple est utilisé d une manière variée dans des produits tels que les dentifrices, les mousses nettoyantes, les aliments, les cigarettes et les préparations pharmaceutiques orales. L'HE de menthe poivrée est la troisième saveur mondiale, derrière les saveurs vanille et citron (Lawrence, 2007). Les HE sont utilisées d une manière contrôlée par les industriels dans diverses industries. Pourtant, il n'y a pas de contrôle par le public et les concentrations en principes actifs sont importantes ainsi la vente est libre et la procuration des HE s effectue directement chez un commerçant ou par Internet (Couderc, 2001) En domaine agro-alimentaire Certaines drogues sont utilisées à l état naturel comme les épices et les aromates, d'autres sous forme d'he. En effet, le secteur des boissons gazeuses s avère un gros consommateur d HE. Les fabricants d aliments préparés en servent davantage car le nombre de produits accroît et le comsommateur recherche des produits avec des ingrédients naturels. Elles sont intégrées dans les boissons non alcooliques, les confiseries, les produits laitiers, les soupes, les sauces, les snacks, les boulangeries, ainsi que la nutrition animale (Bruneton, 2009). 7. Marché des huiles essentielles La production et la commercialisation des HE sont caractérisées actuellement par une compétitivité des produits provenant de pays en voie de développement et les pays industrialisés. La production d HE est principalement réalisée dans les pays en développement. En effet, environ 55% de la valeur de la production mondiale en HE provient 22

45 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes de 25 pays en voie de développement dont les plus importants restent la chine, le Brésil, l Indonésie et l Inde (Grysole, 2005). Dans les vingt dernières années, il y a eu une augmentation significative des applications des HE dans les parfumeries et les industries cosmétiques. Près de 65 % de la production mondiale provient de l'extraction de la partie d'arbres ou arbustes cultivés ou présents à l'état sauvage dans la nature floristique. Les plantes non arbustives qui représentent le reste de la production de 35% sont en majorité cultivées. 64.7% des plantes cultivées sont utilisées pour l extraction des HE suivies des autres arbres (18.7%), des agrumes (14.8%) et des plantes sauvages (1.8%) (Nzeyumwami, 2004). Les HE de l orange, M. arvensis, citronnelle, menthe poivrée, citron, eucalyptus et de la menthe verte sont parmi les 20 plus importantes huiles dans le monde sur le plan commercial (Lawrence, 2007). Le marché des HE a plus que doublé en 20 années passant de tonnes à tonnes en L Amérique du Nord (Etats-Unis, Canada, Mexique) constitue le marché le plus important au monde. Il passait d un volume de 4,4 milliards de dollars à plus de 64 milliards de dollars américains par an actuellement. Plus de plantes sont utilisées dans des industries comme la pharmacie, la phytothérapie, l herboristerie, l hygiène (Krausz, 2014). De nombreux facteurs peuvent influer sur le marché des HE tels que les conditions climatiques dans les régions de production, les catastrophes naturelles, la variation des stocks, le nombre de producteurs qui fait augementer l offre plus rapidement que le marché et la qualité de l HE. 8. Toxicité des huiles essentielles Les HE, même si elles sont naturelles, ne sont pas des produits qui peuvent être utilisés sans risque. Cet aspect des HE est d'autant plus important que leur utilisation. Comme avec la plupart des médicaments, que ce soient synthétiques ou d origine naturelle, les composés présents dans les HE ont le pouvoir de créer des effets toxiques graves, voire mortelles, si ingérés en très grandes quantités (Guba, 2001). Nombreux cas toxicologiques ont été rapportés, dans la littérature, graves (non mortels) et fatales à cause de l'ingestion d'he à la fois par les enfants et les adultes. Ces cas sont généralement dus à l'ingestion accidentelle par des jeunes enfants, aux tentatives d'avortements au cours des dernières années et à l'utilisation des HE pour des tentatives de suicide (Bruneton, 2009). 23

46 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Certaines HE (riches en thymol ou en carvacrol) sont dangereuses lorsqu'elles sont appliquées sur la peau en raison de leur pouvoir irritant, allergènes telles que les huiles riches en cinnamaldéhyde ou phototoxiques (huiles de citrus contenant des furocoumarines) (Smith et al., 2000). D'autres HE ont un effet neurotoxique. Les cétones, comme l'α-thujone, sont particulièrement toxiques pour les tissus nerveux. L HE de M. pulegium L. est également fort suspectée d être hépatotoxique. Elle a été responsable d accidents mortels. La toxicité essentiellement hépatique est liée à la pulégone et à ses métabolites comme le menthofuran qui sont responsables de la nécrose des tissus (Bruneton, 2009). Cette huile est fréquemment citée comme étant dangereuse pendant la grossesse (Watt, 2006). La pulégone a été déclarée hépatotoxique en 1997 par le comité des experts sur les substances aromatisantes du conseil européen pourtant aux Etats Unis elle a été listée parmi les substances aromatisantes autorisées (Scientific Committee on Food, 2002). Il existe aussi quelques huiles essentielles dont certains composés, tels que les dérivés d'allylbenzènes ou de propénylbenzènes comme le safrole (Sassafras albidum), l'estragole (Artemisia dracunculus), la j3-asarone (Acorus calamus) et le méthyl-eugénol, sont capables de provoquer des cancers (Watt, 2006). Toutefois, ces résultats sont controversés car il existe des différences chez l'homme dans le processus de métabolisation de ces composés. Le safrole, par exemple, est métabolisé chez l'humain en dihydroxysafrole et trihydroxysafrole non cancérigènes. De plus, tout dépend de la dose administrée lors des tests et bien souvent la dose absorbée par l'animal est loin de correspondre à celle qu'un homme est susceptible d'ingérer par jour (Guba, 2001). 9. Techniques d extraction des huiles essentielles Les méthodes d extraction des HE obéissent à des normes comme celle de l AFNOR (NF T75-006) qui précise que seul l entrainement à la vapeur, les procédés mécaniques à partir de l épicarpe des Citrus et la distillation à sec peuvent produire une HE. La distillation est la technique la plus utilisée pour l extraction des HE et elle reste sans doute la plus rentable et efficace. La méthode est basée sur l'existence d'un azéotrope de température d'ébullition inférieure aux points d'ébullition des deux composés, l'he et l'eau, pris séparément. Ainsi, les composés volatils et l'eau distillent simultanément à une température inférieure à 100 C sous pression atmosphérique normale. En conséquence, les produits aromatiques sont entraînés par sa vapeur d'eau sans subir d'altérations majeures. Il existe précisément trois différents procédés utilisant ce principe: l'hydrodistillation, l'hydrodiffusion et l'entraînement à la vapeur d'eau (Franchomme et al., 1990). 24

47 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes 9.1. L hydrodistillation L'hydrodistillation est la méthode la plus simple et de ce fait la plus anciennement utilisée. En outre, c est la technique de référence dans l étude des composes volatiles d une plante dans le domaine de la recherche. Le matériel végétal est immergé directement dans un alambic rempli d'eau placé sur une source de chaleur. Le tout est ensuite porté à ébullition. Les vapeurs hétérogènes sont condensées dans un réfrigérant et l'he se sépare de l'hydrolat par simple différence de densité. L'HE étant plus légère que l'eau (sauf quelques rares exceptions), elle surnage au-dessus de l'hydrolat La vapo-hydrodistillation La distillation par entraînement à la vapeur d'eau (steam distillation). Dans ce type de distillation, le matériel végétal ne macère pas directement dans l'eau. Il est placé sur une grille perforée au travers de laquelle passe la vapeur d'eau. La vapeur endommage la structure des cellules végétales et libère ainsi les molécules volatiles quisont ensuite entraînées vers le réfrigérant. Cette méthode apporte une amélioration de la qualité de l'he en minimisant les altérations hydrolytiques: le matériel végétal ne baignant pas directement dans l'eau bouillante (Franchomme et al., 1990) L hydrodiffusion Cette technique relativement récente estparticulière. Elle consiste à faire passer, du haut vers le bas (per descendum) et à pression réduite, la vapeur d'eau au travers de la matrice végétale. L'avantage de cette méthode est d'être plusrapide donc moins dommageable pour les composés volatils. Cependant, l'he obtenue avec ce procédé contient des composés non volatils ce qui lui vaut une appellation spéciale: «essence de percolation» (Franchomme et al., 1990). 10. Méthodes d analyses des huiles essentielles Une fois l extrait le plus représentatif obtenu, l analyse permet d identifier et de quantifier les produits qui le composent. Les progrès des méthodes analytiques permettent d identifier rapidement un très grand nombre de constituants (Nzeyumwami, 2004). Cette analyse concerne l'identification qualitative et quantitative des différents constituants d'une huile essentielle. On peut utiliser les méthodes suivantes : CG, CG/SM, HPLC, RMN, IR, etc. La chromatographie en phase gazeuse est la méthode la plus utilisée dans le domaine des 25

48 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes huiles essentielles. C'est une méthode de séparation des composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans subir une décomposition dont voici le principe ci-après (El Kalamouni, 2010): Chromatographie en phase gazeuse La CPG est une méthode de séparation mais aussi d analyse. En effet, les temps de rétention peuvent donner une information sur la nature des molécules et les aires des pics fournissent une quantification relative. Depuis peu de temps, la quantification relative par CPG est remise en cause. Ainsi des méthodes de quantification réelle avec étalons interne et externe qui sont quasiment les seules utilisées aujourd hui et développées pour répondre aux exigences de la pharmacie, la cosmétique, l agro-alimentaire et surtout le domaine de la recherche scientifique (Bicchi et al., 2008). L'identification d'une substance peut être facilitée par la connaissance de son temps de rétention qui est une valeur caractéristique pour une phase stationnaire donnée. En effet, les temps de rétention de chaque compose dépendent des conditions expérimentales (nature et épaisseur de la phase stationnaire, programmation de la température, etat de la colonne, etc). Une meilleure information peut être obtenue grâce à l utilisation des indices de rétention, mesurés sur les colonnes apolaire et polaire, qui sont plus fiables que les temps de rétention. Ils sont calcules à partir d une gamme étalon d alcanes ou plus rarement d esters méthyliques linéaires. Le calcul peut se faire pour une expérimentation à température constante par interpolation logarithmique: indices de Kováts (IK) (1965), ou en programmation de température par interpolation linéaire indices de rétention ou indices de Van Den Dool et Kratz (Ir) (1963). Bien que dans la grande majorité des cas, chaque molécule possède des indices de rétention sur colonne apolaire et polaire qui lui sont propres, deux molécules peuvent fortuitement co-éluer et présenter des indices de rétention identiques. Par ailleurs, on observe fréquemment pour un même compose des écarts d indice de rétention pouvant atteindre 10 et même 20 unités, entre les données de la littérature et celles du laboratoire surtout sur colonne polaire et ce pour les molécules les plus polaires qui sont éluées en dernier. De meilleurs résultats sont obtenus quand les produits de référence et les mélanges naturels à analyser, sont traités rigoureusement dans les mêmes conditions expérimentales lorsque les indices des composés sont mesurés au laboratoire. 26

49 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes Couplage CPG/SM D un point de vue analytique, d importants progrès ont été réalisés en couplant la CPG avec un spectromètre de masse (SM). En effet, le couplage CPG-SM en mode impact électronique (IE), dit CPG-SM(IE), est la technique utilisée en routine pour l analyse dans le domaine des HE. Le principe de la spectrométrie de masse consiste à bombarder à l aide d électrons une molécule qui sera fragmentée; les différents fragments obtenus, charges positivement constituent le spectre de masse de la molécule. Cette technique permet d identifier un composé en comparant son spectre à ceux contenus dans des bibliothèques de spectres informatisées ou sous format papier construites au laboratoire ou commerciales (Adams, 2007). Dans la pratique, l utilisation conjointe de la spectrométrie de masse et des indices de rétention calculés sur deux colonnes de polarité différente en CPG, permet, en général l identification d un grand nombre de constituants dans les mélanges complexes tels que les HE. IV. Les hydrolats 1. Généralités Les HE et les hydrolats ont été datés comme étant utilisés en Egypte il y a plus de 6000 ans (Schorr, 2004). Lorsque les plantes sont distillées pour libérer leurs HE, un sous produit se forme à partir de l'eau ayant servi à l'extraction des molécules odorantes. Ce produit est l'hydrolat. Au cours de la distillation, la vapeur d'eau traverse la matière végétale puis se condense au contact des parois froides d'un réfrigérant. L'eau se dissocie alors spontanément de l'huile essentielle du fait de leur non miscibilité tout en conservant une petite portion des composés volatils de l'huile essentielle (Price et al, 2004; Schorr, 2004). Les composants de distillation forment un mélange azéotropique avec couches riches en essence et autres riches en eau. Typiquement, dans la production commerciale moderne, les HE qui relèvent la surface sont écumées et l'hydrolat est jeté comme un déchet ou recyclé (retourné à la solution source). Cependant, la partie légèrement hydrophile de l huile essentielle passe dans la phase aqueuse durant le processus de distillation donnant à l hydrolat son agréable arome (Rao et al., 2002). Les hydrolats sont des substances d'origine naturelle avec une infinie variété d'utilisations. Ces eaux d herbes médicinales sont distillées à partir d'un large éventail de fleurs, racines, feuilles, écorces, résines, ou à partir de fruits (entiers ou écorces) (Schorr, 27

50 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes 2004). Malgré cette faible concentration en principes actifs, les hydrolats présentent certaines activités pharmacologiques etbiologiques intéressantes qui leur rendent utiles pour l industrie alimentaire et cosmétique (Verma, 2012; Balchin et al., 2003; Sagdic et al., 2003). En outre, les hydrolats trouvent également leur application dans l agriculture afin de fertiliser les sols et contreles champignons, la moississure et les insectes (Paolini et al., 2008). Certains hydrolats sont utilisés depuis des siècles dans des préparations cosmétiques, thérapeutiques et culinaires: les hydrolats de rose, de fleur d'oranger, de lavande, de fleurs de bleuets sauvages d Hamamelis virginiano (L) en sont des exemples. Le principal marché des hydrolats se situe dans le domaine des cosmétiques et des arômes alimentaires. Cependant, avec le regain d'intérêt actuel pour les médecines alternatives telle que l'aromathérapie, les hydrolats sont aujourd'hui de plus en plus utilisés pour leurs vertus thérapeutiques (Catty, 2001). Malgré cet engouement, les chercheurs ne s'y intéressent que très peu. Il existe donc un réel manque de données scientifiques dans ce domaine. Pourtant, la faible toxicité et la nature chimique des hydrolats en font d eux un produit original, intéressant à étudier comme en témoignent les rares publications à leur sujet. Les études pharmacologiques réalisées présentent en effet des résultats très prometteurs. Dans la littérature scientifique anglophone, les hydrolats sont trouvés sous différentes appellations: hydrosol, floral water, aqueous distillate, aromatic water, etc. Le terme «hydrosol» est le plus communément utilisé mais ce mot est inapproprié puisqu'il s'agit d'un terme générique employé pour désigner une solution colloïdale dans l'eau (Piochon, 2008). L hydrosol est obtenu par macération prolongée d'huile essentielle dans de l'eau pure alors que l'hydrolat est obtenu par un procédé d'hydrodistillation. Le terme floral water ou eau florale est également inadéquat puisqu'il désigne uniquement les infusions obtenues par macération de fleurs dans l'eau. Pour mettre fin à cette confusion, les anglophones utilisent de plus en plus le terme français «hydrolat» (Price et al., 2004), mais les américains et les canadiens préfèrent le terme «hydrosol» (Dyer et al., 2008). 2. Composition chimique D après Rose (1999): «Le meilleur hydrolat» provient d'une distillation où c est l hydrolat qui s est produit plutôt que l'he. Les micro-particules en suspension de l HE donnent au distillat aromatique son parfum et elles vont se séparer quand l'hydrolat refroidit. Pendant la distillation, à la fois la composition chimique de l HE et celle de l'hydrolat sont en constante évolution. Tout comme il existe des chémotypes d'he, il y a donc en 28

51 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes parallèle ceux des hydrolats. L'hydrolat, l'he et les extraits de la plante peuvent tous avoir des propriétés différentes. Les hydrolats contiennent en petite quantité des composés volatils semblables à ceux présents dans l'huile essentielle ainsi que des composés solubles dans l'eau non retrouvés dans l'huile. Il y a environ 0,02% de l'he dans l hydrolat. La fraction de l HE présente dans l hydrolat est extrêmement aromatique et sa composition est souvent differente de l HE primaire (Rao et al., 2002; Verma et al., 2012). Mais, les constituants majoritaires sont généralement les mêmes présents dans la fraction oxygénée de l HE (Bosson et al., 2005; Price et al., 2004). La composition des hydrolats s'éloigne donc de celle des HE: les molécules oxygénées hydrophiles s'y trouvent en grandes quantités alors que les composés lipophiles comme les hydrocarbures terpéniques sont la plupart du temps quasi-absents (Bosson et al., 2005). Cepandant, certains hydrolats présentent une plus grande proportion de molécules lipophiles comme ceux de Mentha piperita ou Melissa officinalis (Price et al., 2004). De même, des différences entre la composition de l'he et celle de l'hydrolat d'origanum compactum ; l HE contient huit composés principalement le thymol et le carvacrol (>95%) mais pas de composés spécifiques dans l'hydrolat (Jeannot et al., 2003). L hydrolat d origanum vulgare L. contient des taux elevés en carvacrol différement à l HE qui est riche en monoterpènes hydrocarbonés et pauvre en carvacrol (Verma et al., 2012). Le profil chromatographique de l hydrolat de pelargonium graveolens (géranium rosat) a également révélé la présence des composés spécifiques qui appartiennent à la famille des alcools tels que le géraniol et le linalool et aucun monoterpène ou sequiterpène hydrocarboné n a été détécté (Rao, 2002; Boukhatem et al., 2010). Aussi, les HE de Carum carvi (L.) sont riches en limonène et en carvone pourtant les hydrolats contiernnent des taux très elevés de carvone et faibles pourcentages du limonène (Rivera et al., 2010). L hydrolat de M. suaveolens ssp. insularis de la Corse est caractérisé par la prédominance de cis-cis-p-menthenolide (67.3%) accompagné d autres constituants tels que la pulégone (14.8%) et le 1,8- cinéole (1.3%) tandis que son huile essentielle contient 44.4% de la pulégone et 27.3% du cis-cis-p-menthenolide; limonène, ocimène, α-pinène et β-pinène se touvent en quantités modérées mais absents dans l hydrolat ainsi les sesquiterpènes sont en traces ou absents (Sutour et al., 2010). Même résultat a été montré par Paolini et al. (2008), ils ont montré que les neuf hydrolats analysés sont caractérisés par l abondance des composés oxygénés comme le 1,8 cinéole (63.2% -85.7%), linalool (17.9%- 68.9%) et le terpinen-4-ol (4.4% %) et l absence des composés 29

52 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes hydrocarbonés. La composition chimique des hydrolats du M. piperita L. et du M. spicata L. étudiés par Verma et al. (2011) a révélé la richesse en menthol (48.28%), en terpinen-4-ol (4.28%) et en carvone (75.20%) respectivement et que les taux de ces composés sont relativement élevés par rapport aux HE des mêmes plantes. 3. Utilisations des hydrolats Les HE sont elles-mêmes des forces puissantes pour la santé, mais elles sont extrêmement concentrées. En de nombreux cas, l'he est trop forte pour l utiliser soit en interne ou directement sur la peau et peut être considérée comme un irritant. En revanche, les hydrolats sont presque exempts de composés irritants tels que les terpènes hydrocarbonés et certains hydrolats sont si doux qu'ils sont utilisés pour les traitements de l allergie des yeux. Ils peuvent être utilisés largement et sans crainte de surdosage. Les hydrolats agissent également comme guérison anti-inflammatoire douce et antiseptique. Ils peuvent être utilisés à l'extérieur comme produits de soins de la peau grace à leur propriété astringente, et à l'intérieur comme une douche, ou pris comme un tonique (Bosson et al., 2005). 4. Activités biologiques et pharmacologiques des hydrolats Les hydrolats sont délaissés par les scientifiques au détriment des HE qui sont beaucoup plus étudiées à travers le monde. Les quelques rares publications recensées dans la littérature à leur sujet datent d une dizaine d années ce qui montre un intérêt récent pour les hydrolats. De plus, les résultats obtenus concernant le potentiel pharmacologique de ces types d'extrait ont été très prometteurs Activité antibactérienne Sagdiç et al. (2003) se sont intéressés au potentiel antibactérien d'hydrolats issus d'épices abondamment utilisées en alimentation pour aromatiser ses préparations culinaires. Seize hydrolats d'épices de Turquie ont été testés tels que ceux de romarin (R. officinalis L), de basilic (O. basilicum L), d'origan (O. vulgare L.) ou encore d'anis (Pimpinella anisum L) sur des bactéries pathogènes (Escherchia coli, Salmonella enteritidis, Staphilococcus aureus, etc.). Les hydrolats d'origan et de sarriette ont montré une activité bactériostatique très intéressante. Les hydrolats de thym noir (Thymbra spicata L.), de cumin (Cuminum cyminum L.) puis d'anis (Pimpinella anisum L) ont également montré une activité intéressante contre certaines bactéries. La forte activité bactériostatique des hydrolats de sarriette et d'origan est due à la présence de carvacrol et de thymol, qui sont deux phénols monoterpéniques connus 30

53 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes pour leur activité antibactérienne (Farag et al., 1989). AL-Turki (2007), dans son travail, a indiqué que les hydrosols de thym, menthe poivrée, poivre noir et ail présentent des propriétés antibactériennes contre B. subtilis et S. enteritidis. Aussi Nascimento et al. (2000) ont étudié l'effet inhibiteur des extraits végétaux sur des bactéries résistantes aux antibiotiques et ont signalé que le thym (T. Vulgaris), clou de girofle (Caryophyllus aromaticus) et basilic (Ocimum basilicum) étaient efficaces contre P. aeruginosa. Par la suite, Hussein et al. (2011) ont étudié l effet antibactérien de certains hydrolats extraits à partir du basilic (O. basilicum), du thym (T. schimperi), de Cardamome (E. cardamon), du clou de girofle (S. aromaticum) et de cannelle (C. zeylacinum) ont prouvé leur efficacité pour inhiber certaines bactéries telles que S. aureus, E. coli et S. typhi. Ces résultats ouvrent une perspective intéressante dans le domaine de l'alimentaire, de la cosmétique et de la pharmaceutique dans la mesure où les agents de conservation chimiques pourraient être remplacés par des hydrolats tant que l'impact organoleptique de ceux-ci demeure acceptable. En outre, les hydrolats antibactériens, produits naturels issus de plantes aromatiques, ne présentant aucun danger pour la santé, pourraient être utilisés comme alternatives aux additifs synthétiques qui convertissent certains produits ingérés en substances toxiques ou carcinogéniques (Farag et al., 1989). La possibilité d'utiliser les hydrolats de thym et d'origan pour la préservation des denrées alimentaires serait fort intéressante (Sagdiç et al., 2003) Activité antifongique L activité antifongique des hydrolats de cinq épices (romarin, cumin, sarriette, echinophore et basilic) a été évaluée in-vitro sur des espèces de champignons phytopathogènes (Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f.sp tulipae, Botrytis cinerea et Alternaria citri) par Boyraz et al. (2005). L'hydrolat de sarriette (Satureja hortensis) a montré l'activité antifongique la plus intéressante sur l'ensemble deschampignons testés suivi de l'hydrolat d'echinophore (Echinophora tenuifolia) puis de cumin (Cuminum cyminum). Ces chercheurs, dans une seconde étude, se sont penchés plus précisément sur l'inhibitionde la croissance mycélienne des champignons pathogènes (Aiternaria mali Roberts et Botrytis cinerea) en présence de l'hydrolat de sarriette (Boyraz et al., 2006). Inouye et al. (2009) ont également étudié l'effet antifongique de plusieurs hydrolats contre les formes filamenteuses et les levures de C. albicans. Puis, Tornuk et al. (2011) ont montré que les hydrolats de thym, de cumin noir, de la sauge, du romarin et de la feuille de laurier pourraient être utilisés comme 31

54 Chapitre. I : Métabolites secondaires des Plantes des désinfectants pratiques pour les fruits fraîchement récoltés et les légumes. Récemment, l'utilisation de certains hydrolats comme agents naturels de lutte contre les champignons et de prévention de la détérioration des produits alimentaires ont été rapportés par Dinayarana et al. (2012) et Wojcik-stopczynska et al. (2012). Les hydrolats issus de fruits frais de C. aurantifolia, des feuilles séchées de C. citratus et des feuilles fraîches d O. gratissimum étaient capables d'inhiber les champignons de Candida albicans et Bacillus subtilis alors que celui extrait à partir des feuilles séchées d O. gratissimum ont été capables d'inhiber les organismes de Candida albicans et Enterococcus faecali (Acheampong et al., 2015). Ces études suggèrent que ces hydrolats pourraient être exploités dans certains secteurs comme l'agro-alimentaire ou la cosmétique comme agents antifongiques naturels Activité pharmacologique L activité pharmacologique des hydrolats a été étudiée pour la première fois par le Docteur Turque Suleyman Aydin. Son étude a porté sur l'hydrolat d'origan (Origanum onites L.) et son activité sur le système gastro-intestinal inhibiteur de l'acétylcholine. Il a été démontré que cet hydrolat inhibe les contractions avec différentes intensités en fonction de ladose employée. Le carvacrol, composé majoritaire de cet hydrolat, n'a montré aucune activité inhibitrice de l'acétylcholine. Aydin et al. (2004) suggèrent la présence d'autres principes actifs dans l'hydrolat. Selon eux, les menthanes diols sont possiblement les composés responsables de l'activité pharmacologique de l'hydrolat d'origanumonites car ceux-ci n'apparaissent pas dans l'huile essentielle qu elle ne présente aucune activité inhibitrice sur l'acétylcholine Activité antioxydante La capacité des hydrolats à empêcher l'oxydation a été vérifiée par certains chercheurs. Des hydrolats comme ceux de S. aromaticum, T. vulgaris et L. officinalis se sont montrés très efficaces en tant qu'antioxydants (Aazza et al., 2010). De même, les hydrolats issus de fleurs et de racines de Daucus muricatus L. ont révélé un fort potentiel antioxydant à de faibles concentrations (Dib et al., 2015). En revanche, Zimoch-Korzycka et al. (2016) ont trouvé que l hydrolat de L. angustifolia a présenté une faible activité antioxydante due à leur pauvreté en principes actifs. 32

55 Activités biologiques des plantes Chapitre. II

56 Chapitre II: Activités biologiques des plantes Les plantes aromatiques et médicinales ont beaucoup d intérêt comme source potentielle de molécules bioactives, elles ne cessent de prouver des activités biologiques intéressantes pour l homme et pour son environnement. Dans ce travail, nous allons rappeler l essentiel concernant certaines activités biologiques, il s agit des activités: antioxydante, antibactérienne et insecticide. I. Activité antioxydante des plantes Les domaines de l industrie alimentaire et cosmétique connaissent de vrais problèmes à cause de l utilisation des produits industrialisés qui protègent contre l oxydation. En ce qui concerne la protection et la préservation des aliments, différentes mesures pour contrôler et minimiser l oxydation de lipides sont recherchées. Ceci implique l ajout des antioxydants synthétiques dans la formulation des produits alimentaires qui peut prévenir ou ralentir le processus d oxydation. Les antioxydants synthétiques tels que hydroxyanisol butylé (BHA) et l hydroxytoluène butylé (BHT), sont assez volatils et se décomposent rapidement à des températures élevées en plus de sérieux problèmes dus à leur toxicité, tant au niveau de leur métabolisme que de leur accumulation dans les tissus de l organisme humain (Linderschmidt et al., 1986). La combustion de nutriments dans nos cellules corporelles est également un processus de décomposition de ces substances, nécessitant pour cela de l'oxygène et produisant de l'énergie (chaleur). Il s'agit ici d'une oxydation souhaitée. Par contre, l oxygène est responsable d un nombre de processus d oxydation suivi de mauvaises conséquences comme le stress oxydatif, la détérioration de la qualité des aliments ainsi que le désordre de la santé humaine qui est relié à l oxydation des molécules biologiques et à l'apparition des «radicaux libres» (Garcia- Plazaola et al., 1999). Il est alors recommandé de trouver des antioxydants naturels qui minimisent ces dégâts. 1. Radicaux libres Les radicaux libres sont des particules très petites, très actives et très agressives, pouvant causer beaucoup de dégâts. Ils apparaissent lors de chaque processus d'oxydation; aussi bien l'oxydation souhaitée que non souhaitée. La formation de radicaux libres dans notre corps peut également être la suite de notre division cellulaire normale, de notre système de défense et de notre système de détoxification ou aux effets extérieurs tels que la radiation, la 33

57 Chapitre II: Activités biologiques des plantes fumée de cigarettes, la pollution de l'air, la pollution alimentaire par les additifs synthétiques, le surmenage, le stress, les métaux lourds, etc (Ir Greet, 2004). Les radicaux libres sont des composés caractérisés par une structure électronique déséquilibrée qui leur confère une grande réactivité sur les constituants organiques et sur les structures cellulaires. Ils favorisent habituellement le bon fonctionnement de l'organisme et la santé des mammifères, mais leur excès peut être néfaste car en surnombre ils auront un effet visible sur le vieillissement de la peau, et seraient impliqués dans de nombreuses pathologies. L ensemble des radicaux libres et de leurs précurseurs est souvent appelé «espèces réactives de l oxygène» (EOR). Cette appellation inclut les radicaux libres et certains dérivés oxygénés réactifs non radicalaires dont la toxicité est importante tel le peroxyde d hydrogène (H 2O 2) et le peroxynitrite (ONOO-) (Favier, 2003). 2. Le stress oxydant Depuis quelques années, le monde des sciences biologiques et médicales est envahi par un nouveau concept, celui du «stress oxydant», c'est-à-dire d'une situation où la cellule ne contrôle plus la présence excessive de radicaux oxygénés toxiques, situation que les chercheurs impliquent dans la plupart des maladies humaines (Favier, 2003). Les molécules prooxydantes ou radicaux libres ou espèces réactives de l oxygène (ERO) produites quotidiennement dans l organisme sont contrôlées par les antioxydants. Un stress oxydatif survient lorsque l équilibre est rompu en faveur des radicaux libres. Toutefois, une production excessive de ces molécules réactives ou une insuffisance des mécanismes antioxydants peut déséquilibrer la balance oxydant/antioxydant (Figure 7) (Christophe et al., 2011). Figure 7: Stress oxydatif 34

58 Chapitre II: Activités biologiques des plantes Le stress oxydant provoque des lésions directes de molécules biologiques (oxydation de l ADN, des protéines, des lipides, des glucides), et aussi des lésions secondaires dues au caractère cytotoxique et mutagène des métabolites libérés notamment lors de l oxydation des lipides. L'organisme peut aussi réagir contre ces composés anormaux par production d'anticorps, qui malheureusement peuvent aussi être des auto-anticorps créant une troisième vague d'attaque chimique (Favier, 2003). Les conséquences pathologiques du stress oxydant sont aussi nombreuses que variées. Le seul facteur commun favorisant le stress oxydant est l âge, dans la mesure où le vieillissement affaiblit les réponses antioxydantes et perturbe la respiration mitochondriale. Il y a des maladies dont le stress oxydant est la cause principale comme les rhumatismes, l arthrite, l arthrose, la cataracte, le syndrome de détresse respiratoire aigu (SDRA), l œdème pulmonaire, le vieillissement accéléré de tissus comme la peau, le diabète, la maladie d Alzheimer, les cancers et les maladies cardiovasculaires (Sohal et al., 2002). Le corps humain se défend de deux manières contre un excès de radicaux libres. Il dispose d'une part des enzymes, produites par lui-même, qui neutralisent les radicaux libres. D'autre part, il peut disposer d'antioxydants, qui sont des substances que l'on trouve généralement dans notre alimentation pouvant prévenir l'oxydation non souhaitée, comme la vitamine A, le béta-carotène, la vitamine C, la vitamine E, la vitamine B6, le zinc, le sélénium et d'autres substances comme l'ail et certaines plantes. Les antioxydants sont alors un moyen de protéger les cellules du corps contre les dommages causés par les radicaux libres qui se sont produits par les mécanismes physiologiques et qui sont utiles pour l organisme à dose raisonnable. Nous allons citer ciaprès les différents antioxydants présents. 3. Les antioxydants Les antioxydants peuvent être définis comme toute substance qui, à faibles concentrations en présence du substrat oxydable, ralentit ou empêche significativement l oxydation des substrats matériels. Cette définition fonctionnelle s applique à un grand nombre de substances, comprenant des enzymes aux propriétés catalytiques spécifiques, mais aussi de petites molécules hydro- ou liposolubles. Cette grande variété physico-chimique autorise la présence d antioxydants dans tous les compartiments de l organisme, qu ils soient intracellulaires, membranaires ou extracellulaires (Cano et al., 2007). 35

59 Chapitre II: Activités biologiques des plantes La classification de tous les antioxydants connus est difficile, ils sont classés généralement par leur mécanisme d action ou par leur nature chimique Les antioxydants enzymatiques Les organismes développent des systèmes d action antioxydante, pour faire face aux ERO (Figure 8), qui visent à éliminer les espèces réactives de l oxygène et les catalyseurs de leur formation, à induire la synthèse des antioxydants et à augmenter l activité des systèmes de réparation et d élimination des molécules endommagées. Figure 8: Action des antioxydants au cours du métabolisme des dérivés d ERO Les principaux systèmes enzymatiques antioxydants les plus efficaces chez les mammifères ainsi que chez les plantes sont la superoxyde dismutase, la catalase et le glutathion peroxydase (Sharma et al., 2012) Les antioxydants non enzymatiques Ce sont des antioxydants naturels capables de prévenir les dommages oxydatifs. Ils peuvent se comporter comme des piégeurs des radicaux libres. Ce type d antioxydants possède un avantage considérable par rapport aux antioxydants enzymatiques. Du fait de leur petite taille, ils peuvent en effet pénétrer facilement au cœur des cellules et se localiser à proximité des cibles biologiques. Ce type d antioxydants regroupe un grand nombre de substances hydrophiles ou lipophiles et ils sont en partie produits par l'organisme au cours de processus biosynthétiques. Les antioxydants naturels de faible poids moléculaire les plus connus et les plus importants comprennent majoritairement les vitamines C et E, les caroténoïdes et des composés phénoliques (McCall et al., 1999). 36

60 Chapitre II: Activités biologiques des plantes Acide ascorbique (vitamine C) La vitamine C ou acide ascorbique (Figure 9) est une vitamine hydrosoluble, sensible à la chaleur, aux ultraviolets et à l oxygène qui, après ingestion, passe rapidement dans le sang puis diffuse de façon variable dans tous les tissus. C est un antioxydant puissant capable de piéger/neutraliser à des concentrations très faibles les ERO et un réducteur susceptible de limiter la peroxydation lipidique et intervient dans la régénération des autres antioxydants tels que l α-tocophérol. Elle se présente dans la plupart des fruits et légumes (non synthétisée par l Homme). Un apport quotidien minimal à base de fruits et de légumes frais est donc nécessaire (Greff, 2011). Figure 9: Acide ascorbique Tocophérols (dont la vitamine E) Les tocophérols sont des composés liposolubles, ils regroupent quatre substances dont l'α-tocophérol aussi appelé Vitamine E est l'antioxydant majeur, la plus active biologiquement (Figure 10). Ce sont de bons antioxydants alimentaires, mais surtout leur rôle physiologique chez l Homme comme protecteurs des structures membranaires et des lipoprotéines ou pour lutter contre le stress oxydant, est très important. La vitamine E joue un rôle important dans la suppression de la peroxydation des lipides et elle s'accumule sur ces sites au sein des cellules dans lesquelles la production des radicaux d'oxygène est plus grande (Wang et al., 2006). Figure 10 : Structure chimique des tocophérols 37

61 Chapitre II: Activités biologiques des plantes L α-tocophérol a été largement étudié comme complément alimentaire potentiellement préventif dans les maladies cardiovasculaires. Il joue un rôle dans l'atténuation du stress oxydatif, dans les symptômes des maladies neurodégénératives, et en particulier dans la maladie d'alzheimer qui a récemment reçu un grand intérêt. En conséquence, il entrave l'adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales, l'agrégation des plaquettes et la formation consécutive des plaques d'athérome (Annaházi et al., 2007) Caroténoïdes et composés phénoliques La plupart des caroténoïdes ont une propriété antioxydante. Les plus importants sont le bêta-carotène, l alpha-carotène, la lutéine, la zéaxanthine et le lycopène (Figure 11). Ce sont d'excellents piégeurs d'espèces radicalaires particulièrement vis-à-vis de la lipoperoxydation des phospholipides membranaires grâce à leurs structures (Causse, 2005). Figure 11: Deux exemples de caroténoïdes Les composés phénoliques particulièrement les flavonoïdes sont caractérisés par leur capacité antioxydante qui réside dans leur faculté à «terminer» les chaines radicalaires par des mécanismes de transfert d électrons et de protons (Figure 12), et à chélater les ions des métaux de transition capables de catalyser la peroxydation lipidique (Leopoldini et al., 2011). Figure 12: Mécanismes d action des antioxydants phénoliques (piégeage des radicaux libres) 3.3. Les antioxydants de synthèse Il existe de nombreux antioxydants synthétiques dont les squelettes sont souvent dérivés des antioxydants naturels. Pour une utilisation pratique, les antioxydants doivent être non toxiques, être capable de piéger directement et spécifiquement les radicaux libres, et interagir 38

62 Chapitre II: Activités biologiques des plantes avec d autres antioxydants. Cependant, il reste à les considérer comme des corps étrangers au système biologique (Bauer et al., 2010). 4. Méthodes d évaluation de l activité antioxydante Dans la littérature, plusieurs méthodes et techniques ont été trouvées pour évaluer l activité antioxydante. La plupart de ces méthodes mesure un paramètre particulier en fonction du temps, d autres méthodes enregistrent la vitesse d oxydation. Pour simplifier le protocole expérimental et pour faciliter les études théoriques, des systèmes modèles ont été élaborés comme le β-carotène bleaching test (Bocco et al., 1998). Quelques analyses permet de mesurer la quantité du produit intermédiaire ou final généré par une oxydation (diènes conjugués, Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS)). A cause de la propriété essentielle de l antioxydant (piégeur des radicaux libres), des méthodes ont été mises en place pour évaluer son efficacité à piéger des radicaux différents, comme les peroxydes ROO par les méthodes ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) et TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter); les ions ferriques par la méthode FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Parameter); ou les radicaux ABTS (sel d ammonium de l acide 2,2 -azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique), ainsi que la méthode utilisant le radical libre DPPH (diphényl-picrylhydrazyle). Compte tenu de la complexité des processus d oxydation et la nature diversifiée des antioxydants, avec des composants à la fois hydrophiles et hydrophobes, il n y a pas une méthode universelle par laquelle l activité antioxydante peut être mesurée quantitativement d une façon bien précise. Le plus souvent il faut combiner les réponses de tests différents et complémentaires pour avoir une indication sur la capacité antioxydante de l échantillon à tester (Tabart et al., 2009). II. Activité antibactérienne des plantes 1. Problème de résistance aux antibiotiques La résistance bactérienne aux agents antibiotiques est d importance croissante en pratique médicale. Actuellement, ce phénomène est connu pour toutes les familles d antibiotiques. Les bactéries deviennent résistantes par l'incorporation dans leurs gènes d'un "facteur résistant" qui rend les antibiotiques inefficaces. Cette résistance peut être transmise rapidement à d'autres bactéries, par l'intermédiaire de petits fragments de matériel génétique, d'une espèce à l'autre. Elle se traduit par une augmentation de la vitesse d'absorption dans la 39

63 Chapitre II: Activités biologiques des plantes cellule ou de décharge hors de la cellule, ce qui limite le temps de présence de l'antibiotique et sa concentration dans la cellule, ou la production d'enzymes qui rendent l'antibiotique inefficace (Barama, 2002). Les antibiotiques ont montré aussi d autres inconvénients et des limites d utilisation: les effets secondaires, toxicité des molécules antimicrobiennes pour l organisme traité et les difficultés rencontrées dans le traitement des maladies exigeant la destruction des germes pathogènes indépendamment des facultés de défense du malade d où l importance d orienter les recherches vers la découverte de nouvelles voies qui constituent une source d inspiration de nouveaux médicaments à base de plantes. Ces dernières qui ont prouvé leur l efficacité contre les micro-organismes pathogènes trouvent des applications pratiques dans divers domaines. Les HE constituent les extraits les plus largement exploitées. Elles ont un spectre d action très large puisqu elles inhibent aussi bien la croissance des bactéries que celles des moisissures et des levures (Chibani, 2013). Les HE les plus étudiées dans la littérature, pour leurs propriétés antibactériennes et antifongiques, appartiennent à la famille des Lamiacées: thym, origan, lavande, menthe, romarin, sauge, etc. 2. Activité antibactérienne des huiles essentielles des plantes L activité antibactérienne des HE a été la plus étudiée. Les HE peuvent exercer deux sortes d effets sur les microorganismes : un effet bactéricide exerçant une activité létale et un effet bactériostatique entraînant une inhibition de la croissance. L activité bactériostatique est souvent plus assimilable aux HE que l activité bactéricide. Cependant, il a été démontré que certains constituants chimiques des HE ont des propriétés bactéricides. En effet, des dommages au niveau des cellules de différents microorganismes ont été rapportés. Citons l effet bactéricide des HE riches en monoterpènes et en phénols sur S. aureus, ou encore celui de l O. compactum sur E. coli. Toutefois, cette action bactéricide des HE sur la cellule bactérienne demeure encore insuffisamment élucidée (Lakhdar et al., 2012). 40

64 Chapitre II: Activités biologiques des plantes 2.1. Description des bactéries étudiées Escherichia coli Escherichia coli est un bacille à gram négatif, de forme non sporulée, de type anaérobie facultative, généralement mobile grâce aux flagelles, sa longueur varie de 2 à 6 μm, alors que sa largeur est de 1,1 à 1,5 μm (Steven et al., 2004). Les bactéries appartenant à l espèce E. coli constituent la majeure partie de la flore microbienne aérobie du tube digestif de l homme et de nombreux animaux. Certaines souches sont virulentes, capables de déclencher spécifiquement chez l homme ou chez certaines espèces animales des infections spontanées des voies digestives ou urinaires ou bien encore des méningites néo-natales. D autres souches appartiennent à la flore commensale peuvent être responsables d infections opportunistes variées, surtout chez les sujets aux défenses immunitaires affaiblies (Patrick et al., 1988) Staphylococcus aureus Les espèces Staphylococcus aureus sont des cocci à Gram positif, de forme sphérique, avec un diamètre de 0,8 à 1 μm. Elles sont regroupées en diplocoques ou en petits amas. Ce type de bactéries sont immobiles, asporulés, habituellement sans capsule. De nombreuses souches de S. aureus produisent un pigment jaune doré. Elle représente la cause de méningite, d ostéomyélite et de la diarrhée (Steven et al., 2004) Pseudomonas aeruginosa Les espèces de Pseudomonas aeruginosa sont des bacilles à Gram négatif, ces bactéries fines sont de 1,5 à 3 μm de long et 0,5 à 0,8 μm de large. Elles sont mobiles grâce à une ciliature de type polaire monotriche, ce type de bactéries possède un aspect de «vol moucheron». P. aeruginosa ne forme ni spores ni sphéroplastes. Elle est responsable de 10 % de l ensemble des infections nosocomiales, occupant le 3ème rang après E. coli et S. aureus, mais le premier rang pour les infections pulmonaires basses et le 3ème rang pour les infections urinaires (Richard et al., 1995) Pseudomonas putida Pseudomonas putida est une bactérie à Gram négatif, en forme de bâtonnets. Les souches de Ps. putida se retrouvent généralement dans le sol et dans l'eau et les membres de 41

65 Chapitre II: Activités biologiques des plantes cette espèce ont une large versatilité métabolique, qui leur permet de s'adapter à différents habitats et environnements. La littérature a décrit un large éventail de conditions qui ont conduit à la bactériémie P. putida: pneumonie, cathétérisme lié à la circulation sanguine, cholécystite aiguë, Cholangite, amygdalite, thrombophlébite et infections de la peau et des tissus mous (Thomas et al., 2013) Proteus mirabilis Proteus mirabilis est une bactérie, plus précisément un bacille; elle se retrouve de façon normale dans la flore gastro-intestinale de l humain mais elle est susceptible de causer des infections quand elle quitte l intestin. Elle est ubiquiste dans l environnement, c est-à-dire qu on la trouve dans des milieux écologiques très différents. On la découvre chez les animaux, mais aussi dans le sol et l eau polluée. Elle est responsable de l immense majorité (90 %) des infections causées par les bactéries du genre Proteus. Les modes de transmission spécifiques ne sont pas connus, mais on note tout de même des cas de contamination par des cathéters, et notamment des sondes urinaires. Puisque P. mirabilis est une bactérie, c est la prise d antibiotiques qui permet de guérir les patients qu elle infecte, même si elle présente une grande résistance aux antibiotiques Modes d action des huiles essentielles contre les bactéries Il y a peu d études sur les mécanismes d action de l activité antimicrobienne. Jusqu à présent, il n existe pas d étude pouvant nous donner une idée claire et précise sur le mode d action des HE. Vu la complexité de leur composition chimique, tout laisse à penser que ce mode d action est assez complexe et difficile à cerner du point de vue moléculaire. Il est très probable que chacun des constituants des HE ait son propre mécanisme d action d une manière générale, leur action se déroule en trois phases (El Kalamouni, 2010): elles attaquent la paroi bactérienne en provoquant l augmentation de la perméabilité et la perte des constituants cellulaires, puis elles entrainent l acidification de l intérieur de la cellule, bloquant la production de l énergie cellulaire et la synthèse des composants de structure, et enfin, elles destruisent le matériel génétique, conduisant à la mort de la bactérie Méthodes de la détermination de l activité antibactérienne Technique en milieu solide: Méthode de diffusion Elle est appelée aussi technique de l aromatogramme. Dans cette méthode, on utilise des disques de papier filtre de 6; 7; 8 mm de diamètre, imprégnés d HE et déposés à la surface 42

66 Chapitre II: Activités biologiques des plantes d un milieu gélosé préalablement ensemencé en surface à l aide d une suspension bactérienne. Après incubation, la lecture des résultats se fait par la mesure du diamètre d inhibition en mm. La dilution des huiles essentielles se fait toujours dans un solvant tel que le tween 20, ou l éthanol. Le principe de cette méthode est toujours la migration de l HE par diffusion dans la gélose Technique en milieu liquide: Méthode de dilution La concentration minimale inhibitrice CMI est utilisée par plusieurs chercheurs pour prouver la performance antimicrobienne d une huile essentielle. La CMI est définie comme la plus petite concentration dont résulte la maintenance ou la réduction de l inoculum après 18-24h d incubation, elle consiste à disperser l agent antimicrobien en concentration variable de façon homogène et stable dans le milieu de culture du germe étudié. Cette technique, très fiable et reproductible pour les agents antimicrobiens hydrosolubles, pose un problème de diffusion et d homogénéité de dispersion avec les HE qui ont une très faible solubilité dans les milieux de culture aqueux. Ce problème a été résolu en partie par l utilisation d émulsions des HE dans des solutions de différents détergents comme le Tween 20 et le Tween 80 ou de solvant comme l éthanol (Kempf, 2011). La CMB est la plus petite concentration de l HE qui ne laisse que 0,01 % ou moins de survivants de l inoculum initial après 18h d incubation à une température de 37 C. III. Activité insecticide des plantes Pour la protection des denrées alimentaires ou des cultures, l homme a mis au point une multitude de méthodes même si celles-ci ne sont pas toujours rationnelles comme le ramassage et par la suite la pratique des cultures associées au sein d un même champ afin d éviter d offrir aux ravageurs la possibilité de pulluler (Boriky, 2005). Dans les pays en voie de développement, le stockage inadéquat des denrées alimentaires mène souvent à des pertes considérables. Il est donc utile et plus rentable d assurer une bonne conservation des récoltes que de compenser les pertes par une augmentation de la production. La bonne conservation consiste à mettre les grains à stocker hors d atteinte des intempéries, des déprédateurs et des parasites, pour des durées variables etde leur assurer un environnement abrité de diverses agressions qu ils puissent subir; ces agressions peuvent être dues aux chocs entrainant des fissures ou des brisures, à la dénaturation des protéines, la dégradation et la destruction des amidons, aux hydrolases qui dégradent les réserves 43

67 Chapitre II: Activités biologiques des plantes biochimiques du grain comme peuvent être dues aux êtres vivants (rongeurs, oiseaux, insectes, acariens et microorganismes). Ce sont les insectes et les acariens en particulier, qui causent le plus de dégâts aux denrées stockées. Au Maroc, les principales espèces ravageuses des denrées stockées appartiennent aux Coléoptères et aux Lépidoptères. Les principaux ravageurs de Coléoptères sont: Sitophilus oryzae (L.), Rhyzopertha dominica (Fab.) et Tribolium castaneum (Hbst.). Les insectes présentent comme effet direct sur le grain entreposé une perte de poids, de la valeur nutritive et du pouvoir germinatif. De plus, l humidité issue du métabolisme de leurs pullulations et les produits d excrétion azotée favorise l apparition de moisissures dans les lieux de stockage. Actuellement, pour pallier aux problèmes de pertes dues aux attaques des insectes, de nombreuses techniques sont mises au point pour lutter contre toutes formes d infestations possibles pour ces ravageurs. Nous présenterons tout d abord une description des espèces étudiées et nous passerons par la suite en revue à quelques données sur les différentes méthodes de lutte appliquées. 1. Aperçu biologique sur Sitophilus Oryzae (L.) 1.1. Les caractères généraux de la famille des Curculionidae La famille des Curculionidae, famille la plus importante du groupe des Rhynchophora, est composée d'insectes facilement identifiables à leurs têtes prolongées en un bec allongé en rostre à l'extrémité duquel se trouvent situés les organes buccaux broyeurs (Lepesme, 1944). Cette famille a été étudiée par Hoffman (1954), elle compte environ espèces; elle est divisée en 9 sous familles. Position systématique de Sitophilus oryzae Selon Lepesme (1944) (Figure 13): Embranchement: Arthropoda. Classe : Insecta. Ordre : Coleoptera. Sous ordre : Heterogastra. Famille : Curculionidae. Sous famille : Calandrinae. Genre : Sitophilus Espèce : Sitophilus oryzae (L.) 44

68 Chapitre II: Activités biologiques des plantes Figure 13: Différents états de S. oryzae. A: larve, B: nymphe, C: adulte Origine et répartition géographique du S. oryzae (L.) S. oryzae (L.) est une espèce rencontrée surtout dans les zones tropicales et subtropicales, bien que le pays d'origine de cette espèce soit la région indienne. Actuellement cet insecte est cosmopolite et leur répartition dans le monde entier à cause des échanges internationaux. En zone tropicale, S. oryzae (L.) est souvent confondu avec genre zeamaïs, espèce très voisine, mais de taille plus importante et qui déprécie plus particulièrement le maïs (Nardon et al., 1990) Importance économique et dégâts Les charançons du riz représentent des ravageurs de premier plan pour les céréales emmagasinées sur lesquelles ils provoquent des pertes pondérales, une détérioration de la qualité et permettent l'installation d'infections cryptogamiques. Les dégâts sont surtout causés par les larves qui se développent en consommant la moitié ou le tiers de l endosperme d un grain de blé. Ils sont extrêmement polyphages et sont très nuisibles aussi bien aux grains entreposés qu aux céréales en pleins champs et surtout le maïs (Nardon, 1990) Les ennemis naturels De nombreux parasites mettent un frein aux dommages causés par ces charançons, en s'attaquant à leurs larves et nymphes.les plus communs sont des Hyménoptères de la famille des pteromalides.chaetospila ellgane westwood, Aplastomorpha calandrae et surtout Lariophagus distinguendus Fostr (Lepesme, 1944). De même certains Bethylides tels que: Cephalonomia tarsalis ainsi qu'un acarien Pediculoides ventricosus Nemp. Qui est considéré comme un précieux auxiliaire. 45

69 Chapitre II: Activités biologiques des plantes 1.2. Méthodes de lutte contre les insectes des denrées stockées Lutte physique La lutte physique vise à détruire les insectes en portant les conditions d environnement au-delà des limites compatibles avec leur survie. Elle consiste en l utilisation des méthodes physiques contre les insectes telles que la chaleur et le froid, le stockage étanche ou sous atmosphère contrôlée et les radiations ionisantes. La lutte par le froid consiste à abaisser la température de stockage, ce qui entraîne un ralentissement du développement des insectes, freiné dès que la température est inférieure à 10 C (Evans, 1977) Lutte chimique La lutte chimique est actuellement la plus utilisée en raison de son efficacité, son action rapide, sa facilité d utilisation et de son coût de revient à priori acceptable. Depuis la venue des composés organiques de synthèse, on regroupe les insecticides eninsecticides organiques (les organochlorés, organophosphorés, carbamates et pyréthrinoïdes représentent la grande majorité des insecticides organiques de synthèse qui ont été employés ou sont utilisés actuellement), et inorganiques (généralement à base d arsenic ou de fluosilice, sont aujourd hui prohibés) (Regnault-Roger et al., 2005). Deux types de traitement sont généralement employés pour désinfecter et protéger les denrées : Les insecticides de contact Le traitement par ces insecticides entraine la mort desinsectes par contact. Ces produits, absorbés par la cuticule des insectes, provoquent la perturbation de certains processus biochimiques de leurs tissus. Ils sont généralement employés contre les insectes qui rompent ou qui volent à condition qu ils ne provoquent pas une toxicité pour l homme et les animaux, ni un changement de goût des denrées traitées, ni d odeur après leur application ou encore que les résidus soient négligeables et inférieurs aux normes autorisées (Bourarach, 1992). Les insecticides de fumigation La fumigation consiste à traiter les grains à l aide d un gaz toxique, qu on appelle fumigant. L intérêt majeur de la fumigation est de faciliter la pénétration des gaz à l intérieur du grain et donc de détruire les œufs, larves et nymphes qui s y développent (Wang et al., 2006). 46

70 Chapitre II: Activités biologiques des plantes Les insecticides de synthèse ont d ailleurs connu un grand succès commercial, avant que les effets néfastes ne soient constatés. Leur large utilisation conduit à la contamination de la biosphère. Les études consacrées à la dispersion des pesticides dans l environnement ont prouvé la présence de ces produits dans plusieurs points de la biosphère qui n ont subit aucun traitement. L utilisation de ces composés conduit également à un désordre écotoxicologique qui est accompagné d une augmentation spectaculaire du nombre d espèces devenues résistantes aux insecticides chimiques (Guèye, 2010). Ces différents inconvénients ont fini par orienter les scientifiques aujourd hui vers la recherche de nouvelles méthodes de luttes à caractère écologique ou la mise au point d insecticides alternatifs Lutte biologique La lutte biologique est en pleine utilisation dans les pays d Europe et d Amérique. Ce mode de lutte s articule dans la majeure partie des cas sur l utilisation des parasites ou des prédateurs des ravageurs en vue de diminuer leurs dégâts. Elle est pratiquée soit directement en introduisant dans les champs les ennemis du ravageur ou bien indirectement, en aménageant le milieu de culture de telle sorte qu il accueille le plus grand nombre possible d ennemis des principaux ravageurs des plantes cultivées. L emploi des bactéries, champignons, nématodes ou virus peut être aussi envisagé pour les insectes des denrées entreposées (Guèye et al. 2010). Ces méthodes bien que bénéfiques pour l homme et l environnement ne peuvent malheureusement limiter que partiellement les attaques des insectes et dans aucun cas la lutte n est pas définitive d où s orientent les efforts des industries agrochimiques vers l étude de produits naturels pour la recherche de nouveaux insecticides. Ainsi, la lutte par les insecticides botaniques est très recommandée, parmi les moyens mis en œuvre par les plantes pour se défendre contre leurs déprédateurs, les médiateurs chimiques jouent un rôle déterminant. L usage des plantes dans la conservation des récoltes a été pratiqué avant même l apparitiondes insecticides de synthèse. Les plantes sont utilisées contre les ravageurs pour leurs effets répulsifs, de contact ou fumigant. Les molécules actives peuvent varier d une famille à une autre et à l intérieur d une même famille et la sensibilité peut différer pour un insecte donné d un stade à un autre (Guèye et al., 2010). 47

71 Chapitre II: Activités biologiques des plantes L utilisation des substances naturelles des plantes en tant que bioinsecticides se présentent sous plusieurs formes: extraits aqueux, extraits organique, huiles végétales, huiles essentielles et poudres végétales (Aouinty et al., 2006). Les HE des plantes font partie ces dernières années des voies les plus explorées dans la régulation des ravageurs. Leur application dans la protection des stocks a fait l objet de nombreux travaux. Leur toxicité s exprime de différentes manières: activités ovicide, larvicide, antinutritionnelle et inhalatoire (Regnault-Roger, 2005). La famille de Lamiaceae est parmi les principales familles qui constituent une source importante de bioinsecticides. Ainsi, les HE de cette famille ont reçu une attention considérable dans la recherche des produits naturels pour lutter contre les ravageurs des denrées stockées (Benayad, 2008). 2. Aperçu biologique sur Toxoptera aurantii (Aphididés) 2.1. Les caractères généraux de la famille des Aphididés Les pucerons ou aphides appartiennent à l'ordre des Homoptères et au sous-ordre des Sternorrhynches, comme les psylles, les aleurodes et les cochenilles qui comptent également dans leurs rangs des ravageurs importants. Ils appartiennent à la super-famille des Aphidoidae qui comprend près de 4700 espèces ont été décrites dans le monde, réparties en dix familles, dont 900 se rencontrent en Europe avec 250 espèces sont des ravageurs (Evelyne et al., 2011). D après Luz (2011), les aphides sont classés comme suit: Règne : Animalia Embranchement : Arthropoda Classe : Insecta Ordre : Hemiptera Sous-ordre : Sternorrhyncha Super-famille : Aphidoidea Famille : Aphididae Les aphides appartiennent à la famille des aphididae, au genre Toxoptera et l espèce T. aurantii Origine et répartition géographique Les pucerons constituent un groupe d insectes extrêmement répandu dans le monde. C est dans les zones tempérées que l aphidofaune est plus diversifiée, alors que ces insectes sont rares dans les régions tropicales et subtropicales. Ils ont colonisé la plupart des plantes à fleurs mais aussi les résineux, quelques fougères et mousses (Evelyne et al., 2011). 48

72 Chapitre II: Activités biologiques des plantes Figure 14: (a) Puceron noir (b) Pucerons noirs de différents âges Régime alimentaire Les pucerons sont phytophages. Leur système buccal de type piqueur-suceur est composé de stylets perforants, longs et souples, coulissant dans un rostre. Le régime alimentaire varie selon les espèces, de la monophagie (exclusivement associé à une espèce de plante hôtes), à la polyphagie (associé à une vaste gamme de plantes hôtes appartenant à différentes familles botaniques) en passant par l'oligophagie (associé à quelques espèces de plantes) (Joséphine, 2012). Le succès des pucerons en tant que ravageurs des cultures est également lié à leur capacité à exploiter comme unique source alimentaire la sève élaborée des plantes. Or, la sève circulant dans les vaisseaux du phloème, les pucerons ont développé toute une série d'adaptations anatomiques et morphologiques, parmi lesquelles des pièces buccales hautement modifiées, leur permettant d'exploiter cette ressource trophique difficilement accessible (Rabatel, 2011) Ennemis naturels Les pucerons font partie de réseaux trophiques complexes et vivent au contact de nombreux organismes en plus de leur plante hôte. Ils sont la proie de nombreux prédateurs comme les coccinelles (Coccinellidae), les larves de sirphes (Syrphidae), les Aphidoletes, les Chrysopidae, les araignées-crabes (Thomisidae). Ils sont aussi la cible de champignons entomopathogènes, principalement de l'ordre des Entomophtorales et des Hypocreales. En plus d'être de simples proies, les pucerons ont établi des relations complexes avec certains organismes au cours de l'évolution, comme l'association parasitique puceron-guêpe parasitoïde (Joséphine, 2012). 49

73 Chapitre II: Activités biologiques des plantes Importance économique et dégâts Ce puceron polyphage est un ravageur de diverses cultures tropicales, telle que théiers (Camellia sinensis), agrumes (Citrus), caféiers (Coffea), manguiers (Mangifera indica), cacaoyers (Theobroma cacao), etc. On le rencontre également dans les cultures en serres dans les régions tempérées. Il s attaque de préférence aux jeunes pousses tendres. Il forme des colonies en grappe le long des tiges, ou se réfugie sur la face inférieure des feuilles. Les symptômes sont le plus souvent des feuilles gaufrées, déformées, ou encore enroulées sur elles-mêmes. Les tiges et les feuilles sont collantes à cause du miellat sécrété par cet insecte et suivi de la formation de fumagine. Sa nuisibilité vient principalement de sa capacité à se reproduire rapidement, et en très grand nombre. C'est en outre un vecteur de phytovirus, comme le virus de la tristeza des agrumesce qui provoque des maladies incurables. La plante meurt rarement d une attaque de pucerons, mais elle est très affaiblie: arrêt de la croissance, plus de fleur ni de fruit (Joséphine, 2012; Berger, 2011) Méthodes de lutte contre les pucerons La lutte contre les pucerons a été et reste le souci majeur des agriculteurs. La gravité des dégâts infligés aux plantes cultivées, a conduit à la mise en place de nombreuses études et au développement de moyens de lutte contre les pucerons (traitements insecticides, vaporisation d'huiles, lutte biologique, utilisation de répulsifs, plantes résistantes, etc.) (Joséphine, 2012) Lutte préventive La lutte préventive se base sur les différentes pratiques culturales pouvant réduire les dégâts tels que la détermination d une date de semis et de récolte adéquate, la rotation des cultures avec une plante qui serait attrayante pour les pucerons, les associations culturales et la suppression des mauvaises herbes ou résidus de cultures qui pourraient héberger des pucerons. L association d une plante hôte avec une plante compagne émettant des composés volatils différents va permettre de masquer ou d altérer l odeur de la plante hôte, ce qui va perturber sa localisation par les pucerons (Jaloux, 2010). L utilisation des pièges à succions, pièges collantes, pièges jaunes (Le puceron aime le jaune, cette attirance est mise à profit par les aphidologues qui disposent sur le terrain des pièges de cette couleur pour détecter les attaques de pucerons, c'est une méthode habituelle de surveillance des populations (Alain, 2006). 50

74 Chapitre II: Activités biologiques des plantes Il est recommandé de ne pas trop fertiliser les plantes et d'éviter les fertilisants chimiques à action rapide, spécialement ceux qui sont riches en azote et qui favorisent la croissance rapide des pousses, qui attirant les pucerons (MDDEPQ, 2009) Contrôle chimique En dernier recours, quand toutes les autres méthodes ne suffisent pas pour régler le problème, l utilisation des pesticides autorisés, lesquels sont homologués pour contrôler ce ravageur, est recommandée (ARLA, 1999). On peut traiter les infestations de pucerons avec des insecticides. Les insecticides utilisés sont les organophosphorés, les carbamates et les pyréthrinoïdes de synthèse et il est apparu une nouvelle famille de produits, les chloronicotiniles qui présentent la particularité d être très fortement systémiques. Cependant, les insecticides présentent des inconvénients: ils coûtent chers, nuisent à l écosystème et à l environnement et tuent les insectes auxiliaires, de plus, les pucerons peuvent développer des résistances aux différentes molécules chimiques utilisées (Dogimont et al., 2010) Contrôle physique L utilisation d un jet d'eau puissant en s attardant sur la face inférieure des feuilles, et en répétant régulièrement l'opération pour déloger les pucerons. Dans le cas d'une petite plante, il est recommandé d écraser la colonie à la main ou tailler la plante pour enlever la colonie. Dans certains cas, cela permet de lutter efficacement contre le problème. La taille et la destruction des feuilles ou des parties infestées peut aussi aider à prévenir la propagation des maladies et à réduire le développement de nouvelles colonies (ARLA, 1999) Contrôle biologique La lutte biologique repose sur l'utilisation des ennemis naturels ou auxiliaires des cultures, pour réduire les populations de pucerons. Ces derniers sont communément attaqués par de nombreux ennemis naturels comme des prédateurs, des insectes parasitoïdes et des champignons pathogènes d'insectes. Les prédateurs des pucerons tuent leurs proies pour s'en nourrir. Chacun d'entre eux a besoin de plusieurs proies pour effectuer son développement. On y compte quelques oiseaux, des araignées et surtout des insectes, notamment les coccinelles dont les larves et les adultes 51

75 Chapitre II: Activités biologiques des plantes se nourrissent de pucerons, mais aussi les syrphes et les chrysopes, dont seules les larves sont prédatrices de pucerons. Les parasitoïdes de pucerons comme les guêpes ou les fourmis. Certaines espèces de champignons microscopiques peuvent infecter les pucerons. Une fois les pucerons tués par ces champignons, leurs cadavres sporulent sous l'action combinée de l'humidité et de la température (Evelyne et al., 2011) Mode d action des huiles essentielles sur les insectes Le mode d action des HE et leurs constituants en tant qu insecticides n est pas clairement connu. Cependant, les effets répulsifs et anti-appétants observés montrent que les HE affectent la physiologie des insectes par différentes voies (Kumar et al., 2011). Les HE interfèrent avec les fonctions métaboliques, biochimiques, physiologiques et comportementales des insectes qui les inhalent, ingèrent ou absorbent. Les HE peuvent agir comme fumigants (Benayad, 2008), des insecticides de contact (Tang et al., 2007), des répulsifs (Islam et al., 2009) et des anti-appétants (Gonzalez-Coloma et al., 2006) et peuvent également affecter certains paramètres biologiques tels que le taux de croissance (Nathan et al., 2008), la durée de vie et la reproduction (Isikber et al., 2006). Des extraits de plantes ont été étudiés pour leur potentiel larvicide, adulticide et répulsif. De nombreuses variétés des terpénoïdes à bas poids moléculaire, qui se trouvent dans les huiles, grâce à leur nature lipophile peuvent être solubles dans l'hémolymphe qui, chez les Arthropodes, fonctionne comme le sang et dans quelques autres fonctions des invertébrés comme la lymphe (Khater, 2012). Selon Priestley et al., (2006), la plupart des insecticides se lient aux protéines réceptrices dans l insecte et, font interrompre la neurotransmission normale, qui conduit à la paralysie et, par la suite, à la mort. Des données récentes suggèrent que les terpènes à bas poids moléculaire peuvent également se lier à des sites cibles sur des récepteurs comme «octopamine» ou l acide de gamma-aminobutyrique (GABA) qui modulent l'activité du système nerveux (Khater, 2011). L utilisation des HE en formulation poudreuse conduit à une protection des stocks durant trois mois sans diminuer le pouvoir de germination des graines. Leur effet peut aussi être anti-appétant, anti-reproducteur ou retardateur de la reproduction et de la longévité des insectes (Regnault-Roger, 2005). La sélectivité et la spécificité permettent aux molécules végétales d agir à des moments déterminés sur les espèces ciblées. Les monoterpènes ont prouvé leur neurotoxicité contre les 52

76 Chapitre II: Activités biologiques des plantes mouches domestiques et les cafards. Ils peuvent agir comme des phéromones dans les insectes qui rendent leur interaction avec les plantes compliquée (Franzios et al., 1997). Ils inhibent la reproduction des insectes (N gamo et al., 2007). Le limonène agit contre différents ravageurs, alors que le même composé présente une activité d attraction pour les prédateurs et offre donc des perspectives intéressantes en luttebiologique. L'HE de thym et les monoterpènes, y compris le thymol, l anéthole, l eugénol et le citronellal ont été brevetés pour leur activité insecticide contre les blattes et les pucerons verts de la pêche (Bessette et al., 2008). De même, le citronellal, le citronellol, le citronellyl ou un mélange de ces composés ont été brevetés comme composition du traitement contre les poux humains (Ping, 2007). Le safrole et l eugénol ont des fortes activités insecticides sur T. castaneum ainsi que sur le bruche d haricot (Regnault-Roger et al., 2005). Les constituants majeurs des HE ont des efficacités insecticides soit singulières ou lorsqu elles sont mises ensemble. Il n y a pas forcément de synergie lorsque tous ces composés sont conditionnés ensemble, de même les efficacités ne sont pas les mêmes pour tous les insectes. Il existe une grande variation dans la sensibilité des espèces pour une même HE ou même pour un même composé. Une même molécule allélochimique n exerce pas forcément la même activité aux différents stades du cycle biologique d un insecte (Regnault- Roger et al., 2005). 53

77 Chapitre. III Monographie des espèces végétales étudiées

78 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées I. Genre Mentha 1. Présentation botanique du genre Mentha La famille des Lamiacées est une vaste et importante famille très typique du monde végétal (Sutour, 2010). Elle compte plus de trois mille cinq cents espèces, quelques deux cents genres, répartis en huit sous-familles (Ajugoideae, Chloranthoideae, Lamioideae, Nepetoideae, Pogostemonoideae, Scutellarioideae, Teucrioideae et Viticoideae). La forme de la fleur et la présence d HE marquent cette famille (Kaufmann et al., 1994). Près de la moitié (47%) des Lamiacées sont regroupés dans la sous-famille Nepetoideae. Cette famille de plantes angiospermes dicotylédones à fleurs gamopétales irrégulières qui regroupe surtout des plantes herbacées et sous-arbustives réparties dans le monde entier. Les Lamiacées herbacées, annuelles ou vivaces, sont très nombreuses et très répandues au Maroc; les Menthes, les Thyms, les Lavandes, les Romarins sont surtout abondants dans les régions méditerranéennes. Au sein de la famille des Nepetoideae, le genre Mentha, qui regroupe toutes les menthes, est représenté par 18 espèces et environ 11 hybrides (Lawrence, 2007). Les possibilités d'hybridation sont très nombreuses entre les espèces, ce qui rend celles-ci particulièrement difficiles à individualiser. La menthe est une plante herbacée vivace, dicotylédone et gamétopétale, susceptible de se reproduire par des rhizomes, par marcottage ou par bouturage. Elle apprécie les situations fraîches, moyennement éclairées, des sols riches en éléments nutritifs, affectionnant un ph plutôt neutre (Bruneton, 2009). Il existe de très nombreuses variétés dont la «menthe verte» et la «menthe poivrée» sont les plus connues. La plupart des menthes sont originaires de l'europe et de l'asie. Cependant, en suivant les flux de migration, les menthes sont présentes sur la quasi-totalité des continents (Figure 15). Figure 15 : Aires de répartition des menthes dans le monde La systématique du genre Mentha est très complexe et l'identification des espèces basée uniquement sur les aspects anatomiques et morphologiques, s'avère insuffisante. La 54

79 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées caractérisation chimique des espèces parait la plus sûre. Elle fait appel à la composition des HE extraites à partir de ces plantes et l'identification des composants majoritaires. Cette méthode donne lieu à des chimiotypes ou chémotypes. Cette notion fera la valeur commerciale finale de la plante cueillie ou cultivée. La production mondiale de menthe est modeste mais sa valorisation en termes d'exploitation des HE extraites est l'une des plus importantes parmi les produits agricoles. Plusieurs industries sont dépendantes des produits extraits à partir de la menthe telles que l'industrie du parfum et de la chimie fine (El Fadl et al., 2010). Si les menthes sont connues et appréciées pour leurs qualités aromatiques depuis l'antiquité, certaines ont acquis une grande valeur économique depuis quelques décennies. Des dix-huit espèces de menthes actuellement acceptées, seulement trois (M. aquatica, M. canadensis, M. spicata) et leurs hybrides (M. x gracilis, M. x piperita, M. x villosonervata) dominent le marché mondial pour la production d'he (Lawrence, 2007). L HE de la menthe est la seconde plus importante derrière celles du genre Citrus avec environ t/ an d HE de menthe poivrée et 2000 t/an de menthe verte. Il faut rajouter à cette production t/an d HE du M. arvensis resérvée à la production du menthol naturel (Moja et al., 2014). Dû à l importance du marché, de nombreux pays se sont orientés vers la production et la valorisation de la menthe. Néanmoins, la répartition des cultures de menthe dans le monde est soumise avant tout à des impératifs pédoclimatiques; d'autres facteurs, notamment humains, sociaux et économiques, interviennent pour déterminer la localisation des zones de productions. Certains pays sont spécialisés dans la production. Les Etats-Unis sont parmi les plus importants producteurs des HE du M. spicata ( à ha), et assurent plus de 90% de la production mondiale (2.000 T environ). Le reste de la production est récolté en Chine, au Japon et en Russie. Le Maroc est considéré comme étant un important producteur de la menthe verte. Les Etats-Unis dominent également la production mondiale de M. piperita (menthe poivrée); l'europe de l'est fournit certains tonnages, à côté d'autres pays producteurs tels que l'italie, la France et l'afrique du sud. La menthe du Brésil (Mentha arvensis), dû aux conditions idéales au Brésil pour la culture de la menthe qui assurent une rentabilité d'exploitation exceptionnelle; elle en occupe plus de hectares dont 90% dans la région de Panama. Le Paraguay produit également cette menthe en plus de la Chine, Taiwan et de la Corée. L Espagne est un grand producteur de la menthe pouliot mais la production marocaine 55

80 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées était jadis importante et provenait essentiellement de la cueillette dans les bords de champ (El Fadl et al., 2010). Au Maroc, il y a des espèces de menthe cultivées: M. spicata L. (M.viridis L.), M. piperita (L.) Huds. et d autres spontanées : M. aquatica (L.), M. cervina (L.), M. gattefossei Maire, M. longifolia (L.), M. niliaca (Jacq.), M. pulegium (L.), et M. suaveolens (Ehrh.) (Tanji, 2008). Le genre Mentha est représenté au Maroc par cinq espèces principales: M. pulegium (L.), M. aquatiqua (L.), M. longifolia (L.), M. arvensis (L.) et M. suaveolens (Ehrh.) (El Fadl et al., 2010). 2. Utilisations des menthes dans la pharmacopée traditionnelle Mentha est l'une des herbes les plus communes, connue par ses propriétés médicinales et aromothérapeutiques depuis les temps anciens. Son usage remonte aux égyptiens qui l utilisaient comme parfum et aromate culinaire. Plus tard, les romains l introduisaient dans l hygiène dentaire. À la fin du 12ème siècle, M. piperita a été reconnue comme une espèce distincte, dont le plus ancien spécimen de menthe poivrée était trouvé en En 1721, M. piperita (L.) a été admise dans le «London Pharmacopeia» comme M. piperitis sapore en reconnaissance de ses propriétés médicinales. En Europe, elle est entrée en usage général comme médicament contre les nausées, le vomissement et les troubles gastro-intestinaux au milieu du 18 ème siècle (Moja et al., 2014). Elle a été utilisée depuis fort longtemps en nature et pour son HE. Elle est réputée pour ses propriétés aromatiques (toniques, fortifiantes) et digestives (utilisée pour combattre les lourdeurs, les ballonnements, les gaz). Les menthes doivent leurs odeurs et leurs activités à leurs HE qui ont une place particulière dans l ensemble des produits aromatiques d origine végétale; grâce à certaines propriétés spécifiques, les besoins en produits de la menthe sont multiples, tant pour leur flaveur (aromatisation) que pour leurs odeurs (parfumerie), leur pouvoir rafraîchissant ou leurs propriétés médicinales. Leurs qualités sont strictement choisies en fonction de ces usages. Mais, les plus gros tonnages sont consommés en aromatisation (El Fadl et al., 2010). Les Anglais et les Arabes sont considérés parmi les plus grands consommateurs au monde de la menthe. Pour les marocains, le thé à la menthe est pratiquement «une boisson nationale». Au Moyen-Orient et en Afrique, elle parfume le thé, les salades, les grillades, les yagourts et les légumineuses, les pâtisseries à base de fromage frais. Quant à leurs utilisations en pharmacopée traditionnelle, l usage de la menthe diffère en fonction des espèces. Mais les 56

81 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées propriétés thérapeutiques qu elle possède sont communes car elle stimule la sécrétion des sucs digestifs, limite les ballonnements et les diarrhées et stimule la sécrétion biliaire, elle est aussi efficace en cas d inappétence et recommandée en cas de troubles gastriques et de crampes. II. Mentha pulegium L. Mentha pulegium (L.) est une plante vivace herbacée qui pousse spontanément dans les lieux humides des plaines et des montagnes. Au Maroc, M. pulegium (L.) est connue sous le nom vernaculaire français "menthe pouliot" et arabe "fliyou". Le nom de «pouliot» vient du latin pulegium, qui dérive de pulex : la puce; la plante ayant la propriété d'éloigner les puces. Malgré son utilisation ancestrale pour aromatiser les sauces, les desserts et les boissons, son intérêt économique demeure limité (Sutour, 2010). 1. Aspect botanique Les feuilles de la menthe pouliot sont généralement petites, ovales, légèrement dentelées, légèrement poilues, et opposées et munies d un court pétiole (Figure 16). Les fleurs, qui apparaissent l'été, à partir de Juillet à la fin de Septembre, sont roses lilas, parfois blanches echelonnées le long de la tige. Les fruits sont des akènes et la graine est brune claire très petite et ovale. M. pulegium (L.) est une espèce spontanée dans l'ensemble de l'europe, a trouvé dans des sols humides autour de la Méditerranée et à l'ouest de l'asie (de Chypre au Turkménistan) et le nord de l'afrique (du Maroc à l'egypte) (Zargari, 1990). Figure 16: M. pulegium (L.) ( 57

82 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées 2. Constituants chimiques La menthe pouliot comprend des métabolites secondaires tels que les flavonoïdes (Zaidi et al., 1998). Elle constitue une source importante d HE. La composition chimique de l HE de la menthe pouliot a été décrite par plusieurs chercheurs (Boughdad et al., 2011; Derwich et al., 2010; Hajlaoui et al., 2009; Benayad, 2008; Mahboubi et al., 2008; Mkaddem et al., 2007; El Ghorab, 2006; Stoyanova et al., 2005; Lorenzo et al., 2002; Chalchat, 2000). Elle est caractérisée par la prépondérance de la pulégone (70-90%) accompagnée d autres cétones monoterpéniques telles que la menthone, l isomenthone et la pipériténone (Bruneton, 2009). En effet, les compositions décrites de la menthe pouliot dans différents pays ont montré la prédominance de la pulegone. La menthe pouliot marocaine est également caractérisée par la dominance de ce constituant: 85.4% (Chebli et al., 2003), 80.28% (Hmiri et al., 2011), 78.07% (Sbayou et al., 2016), 69.8% (Ait-Ouazzou et al., 2011). En égypte la menthe pouliot contient la pulégone (43,5%); en Inde 65,9-83,1% (Agnihotri et al., 2005); en Uruguay 73,4% (Lorenzo et al., 2002); en Algérie 43,3 à 87,3% (Bghidja et al., 2007). Il y en a d autres qui sont dominées par la pipériténone 83,7-97,2% en Grèce (Kokkini et al., 2002) ou encore la pipéritone 70% en Autriche (Zwaving et al., 1971). L association pipéritone (38% et 35,56%)/ pipériténone (33% et 21,18%) respectivement (Mahboubi et al., 2008; Derwich et al., 2010). Les autres compositions chimiques résultent de l association de la pulégone avec: la pipériténone au Portugal 35,1/ 27,4% (Mata et al., 2007), en Bulgarie 27,2-49,7/ 19,4-57,7% (Stoyanova et al., 2005) et en Grèce 32,8-75,8/5,1-35,0% (Cook et al., 2000); l isomenthone en Suisse 20,0-34,6/ 18,9-42,1% (Sticher et al., 1968), en Grèce 32,8-75,8/ 4,3-28,6% (Kokkini et al., 2004), en Turquie 32,1-43,8%/ 41,7-52,0% (Başer et al.,1999), en Tunisie 73,4-12,9% (Hajlaoui et al., 2012), et en Uruguay 61,11-17,02% (Lorenzo et al., 2002); la menthone en Iran 37,8-20,3% (Aghel et al., 2004), en Turquie 26,6-57,3/ 25,1-59,1% (Başer et al., 1999), au Japon 50,5/ 26,4% (Fujita et al., 1967). En revanche, Sutour (2010) a révélé dans les HE de la France une association qui n a jamais été décrite dans la littérature dont la pulégone (50.5% - 90%) se trouve à la fois avec la menthone (1-16.9%) et l isomenthone ( %). 3. Usages thérapeutiques Dans les applications thérapeutiques, cette plante et leurs préparations ont traditionnellement été utilisées pour leur effet antispasmodique, carminatif, diaphorétique, 58

83 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées sédatif, stimulant, diurétique, antitussif, tonique, cholagogue, expectorant, antiseptique et digestif (Mkaddem et al., 2007; Zargari, 1990). Elle a été utilisée encore pour promouvoir la menstruation, guérir les maux de tête, soigner la bronchite, soulager les piqûres des scorpions et des serpents et aider à lutter contre les vomissements et les affections rénales (Salhi et al., 2010; Zargari, 1990). Elle a servi également d insectifuge contre les puces et d'autres insectes (El Fadl et al., 2010; Mkaddem et al., 2007). Elle a été efficace dans le soulagement des acnés et d'autres affections dermatologiques. Cette plante a été employée aussi comme épice et aromatisant dans différents aliments, en particulier les desserts (Mkaddem et al., 2007; Zargari, 1990), comme parfum en cosmétique (Mkaddem et al. 2007) et inhibiteur de la corrosion de l'acier dans l'industrie chimique (Bouyanzer et al., 2006). Au nourisson souffrant d aérophage, une compresse impregnée d essence de menthe est déposée sur le nombril, cette compresse en massage du front soulage la migraine. Enfin, les feuilles séchées et roulées en cigarette passent pour soulager l asthme. L infusion des feuilles et des branches fleuries est antispasmodique, antiseptique, cholagogue et insecticide ainsi les branches fleuries sont utilisées comme expectorant et désinfectant (Boukef, 1986). III. Mentha suaveolens Ehrh. Mentha suaveolens (Ehrh.) ou menthe pomme, auparavant nommée Mentha rotundifolia (L) Hudson (Nagell et al., 1974). Il existe des sous-espèces différentes dont chacune inclue plusieurs variétés. La population de M. suaveolens (Ehrh.) au Maroc et subdivisée en deux sous-espèces : M. suaveolens (Ehrh.) et M. timijja COSS. La première est la plus fréquente (Idrissi et al., 1989). Elle est connue au Maroc sous le nom vernaculaire de Timijja, en arabe Mersita et en Français on l appelle: Menthe à feuilles rondes. Dans la littérature, M. suaveolens ssp. suaveolens (L.) Huds. et M. rotundifolia (L.) sont parfois synonymes, cependant cette dernière est considérée aujourd hui comme un hybride M. longifolia x M. suaveolens (Lawrence, 2007). M. suaveolens (Ehrh.) est présente en Europe, en Afrique du nord, en Amérique et au Japon. C est une espèce des bordures des eaux de la plaine et des montagnes. La floraison s'étale de juillet à septembre (Kumar et al., 2011). 1. Aspect botanique Plante de 10 à 80 cm de hauteur, la menthe à feuilles rondes est une hémicryptophyte, stolonifère (Figure 17). Toute la plante dégage une forte odeur de menthe caractéristique. Elle 59

84 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées est presque glauque et couverte de poils crépus, mous et ondulés. La tige dressée ou ascendante, à section carrée, est ramifiée pyramidalement. Les feuilles opposées médianes sont sessiles. Le limbe est à nervation réticulée, fortement saillante sur la face inférieure, donnant un aspect gaufré, bosselé typique. La face inférieure, recouverte de poils mous et ramifiés, donne un aspect blanchâtre. Les fleurs sont plutôt violettes. Les fruits sont des akènes en 4 parties lisses à la surface et ovoïdes (Hyppa, 2015). Figure 17: M. suaveolens Ehrh. ( 2. Constituants chimiques Dans la litterature sur la phytochimie de la menthe à feuilles rondes, les flavonoïdes sont les majeurs constituants isolés de cette espèce (El-Khasoury et al., 2014; Zaidi et al., 1998). Elle contient également des terpénoïdes. Les HE extraites à partir des feuilles ont fait l objet de nombreuses recherches. La composition chimique de ces huiles est très variable. De nombreux composés, ainsi que leurs associations sont à l origine d une grande diversité de compositions chimiques décrites dans la littérature. Les travaux antérieurs sur la composition chimique des HE du M. suaveolens (Ehrh.) montrent que dans la majorité des cas, les constituants largement majoritaires sont des monoterpènes oxygénés tels que la pulégone 50% (Ouzmil et al., 2002); 85.47% à Béni- Mellal (El Arch et al., 2003), la carvone (62,3%) en Finlande (Galambosi et al., 1998), (43%) en Argentine (De la Torre et al.,1977), la cis-dihydrocarvone (43,2%) (Lawrence, 2007);le menthol (48,32%) en Argentine (Velasco-Negueruela, 1996), 40.50% au Maroc (Boulemane) (Derwich et al., 2010), le pipéritol (57,6%) en Espagne (Perez-Raya, 1990), le néo-isopulégol (52,3%) au Japon ;l oxyde de pipériténone (87,3%) au Japon (Lawrence, 2007),au Maroc: 34% à Meknès (Boughdad et al., 2011), au Nord 41.84% (Moussaoui et al., 2013), 56% 60

85 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées (Oumzil et al., 2002) et à Lokkous et Azrou ( %) (Amzouar et al., 2016); 80.8% et 62.4% en Uruguay et à la Grèce respectivement (Lorenzo et al., 2002; Koulipoulos et al., 2010); l oxyde de trans-pipéritone (40.5% en Italie; 45,8-50,8% origine non-définie) (Avato et al., 1995; Lawrence, 2007) et des acétates comme l acétate de 1,2-époxynéomenthyle (66,5%) (Lawrence, 2007); la pipériténone 33.03% à Oulmès (Benayad, 2008) et 54.91% en Algérie (Brada et al., 2007) et le linalol 35.32% en Egypte (Eman et al., 2010). D autres compositions décrites résultent majoritairement de la combinaison à des teneurs voisines de monoterpènes oxygénés cités au dessus. Nous citerons à titre d exemple la présencede l oxyde de pipériténone (25%) et l oxyde de cis pipéritone (26%) (Ouzmil et al., 2002), de l'oxyde de pipéritenone (29,36-27,79%) et l'oxyde de pipéritone (19,72-31,4%) (Brada et al., 2007), de l oxyde de pipériténone (56,0%) et du p-cymèn-8-ol (20,6%) (Ouzmil et al., 2002), de l oxyde de cis pipéritone (21,4%) et l oxyde de trans pipéritone (20,8%), de l oxyde de trans pipéritone (22,3%) et l oxyde de pipériténone (23,0%) (Umemoto et al., 1994), de l oxyde de pipériténone (41.84%) et isopulegol (11.95%), de la pipériténone (33.03%) et la pulégone (17.61%) (Benayad, 2008), du menthol (48.32%) et la pulégone (20.27%) (Velasco-Negueruela, 1996). Certaines compositions se démarquent des autres par la présence de composés peu communs comme les acétates d 1,2-époxynéomenthyle, 1,2-époxyisomenthyle et 1,2- époxynéoisomenthyle (néo 66,4/ 26,4 /22,5%, iso 10,2%, néoiso 27,8%/ 10,1%) au Japon (Lawrence, 2007) ou le 2,4(8),6-p-menthatrièn-2,3-diol (14,5%) à Cuba (Pino et al., 1999). La présence du germacrène D à une teneur de 12,4% confère à cette HE de Cuba une certaine originalité. L HE, étudiée par Ouzmil et al. (2002), possède une teneur en constituants oléfiniques appréciable avec la présence du β-caryophyllène (9,8%). En effet, les terpènes oléfiniques ne représentent qu un pourcentage faible dans la grande majorité des cas (<10%) avec une teneur individuelle en constituants inférieure à 3% (Sutour, 2010). 3. Usages thérapeutiques Par sa plasticité écologique et ses usages multiples, M. suaveolens (Ehrh.) est la plus utilisée et la plus commune de toute la famille des Lamiacées, elle est employée comme plante médicinale, culinaire et en association avec d autres plantes dans la conservation et l aromatisation des aliments (El Arch et al., 2003). Elle est utilisée comme condiment et en médecine traditionnelle pour ses propriétés: tonique, stimulante, digestive, carminative, 61

86 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées analgésique, cholérique, antispasmodique, anti-inflammatoire, sédative et hypotensive (Tripathi et al., 2004; Moreno et al., 2002). Les feuilles du M. suaveolens (Ehrh.), dans la région du Gharb, sont utilisées sous forme d infusion en combinaison avec d autres plantes contre les douleurs d estomac, la fièvre, la toux et comme décoction pour l hygiène intime en cas d infection urogénitale (Salhi et al., 2010); elles sont également employées en cosmétique, en préparations culinaires et en parfumerie (El Fadl et al., 2010; Brada et al., 2007; Sutour et al., 2007). Les femmes l utilisent en fumigation contre la stérilité alors qu en infusion dans l eau non sucrée est utilisée par les hommes pour ses propriétés aphrodisiaques. L infusion dans le lait ou le thé est, comme d autres menthes, prise comme laxatif et reposant. La fumigation est également utilisée contre la stérilité chez la vache et pour une bonne production de lait. La plante non encore fleurie est employée pour agrémenter et aniser le couscous. En l associant à l olive, elle sert à conserver le beurre. Seule et en nature elle est vermifuge (El Arch, 2003). Cette menthe est aussi utilisée en usage externe. Absès et furonculoses sont traités par les feuilles écrasées ou bien par la décotion des feuilles. Ce dernier mode de préparation ferait en friction baisser la fièvre et en bain de bouche supprimerait les algies dentaires (Boukef, 1986). Une immense activité inhibitrice du neuromédiateur acetylcholinesterase a été démontrée en utilisant M. suaveolens (Ehrh.) en décoction (Ferreira et al., 2006). Son HE s est montrée douée d une activité anticandidale importante; Pietrella et al. (2011) ont prouvé que cette huile n est pas seulement inhibitrice de la croissance du candida mais susceptible de tuer les larves. L oxyde de pipériténone possède des effets biologiques très intéressants. Il présente des effets cardiovasculaires (activité hypotensive, vasodilatateur, bradycardie), une activité sur les centres nerveux sympathiques (relaxant, stimulant, dépressant), des propriétés antibactériennes et antifongiques, et agit aussi comme agent retardant de la reproduction du vecteur de malaria A. stephensis (Tripathi et al., 2004; Dorman et al., 2003). Lʼoxyde de pipériténone est également intéressant pour la synthèse des hétérocycles, de pyrazoles, de pyrazolines et dʼalcoolsallyliques (Ghoulami et al., 2001). IV. Mentha spicata L. Mentha spicata L. (Mentha viridis L.) est connue sous le nom de la menthe verte, la menthe douce ou la menthe marocaine (El Hassani et al., 2010); appelée en arabe Naânaa 62

87 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées ou Liqama et en anglais mint. C est une plante très consommée au Maroc. Son usage quasi-quotidien dans l'aromatisation du thé est associé aux coutumes des marocains et symbolise même la culture du pays et la générosité de son peuple (Tanji, 2008). Sa culture est traditionnellement pratiquée dans les ceintures vertes entourant les grandes villes du pays. Elle occupe une superficie globale de l'ordre de ha et fournit une production estimée à tonnes. La culture de la menthe est localisée dans les ceintures vertes des villes qui donnent aux cultivars leur nom vernaculaire : «Menthe Brouj», «Menthe Tamaris», «Menthe Ziani», «Menthe Abdi», «Menthe Meknassi», «Menthe Tiznit» etc. C'est la zone de Settat qui abrite la plus forte concentration des parcelles de menthe, avec un total de superficies qui approche les 800 ha et une production qui dépasse les tonnes, soit 48% de la production nationale (El Fadl et al., 2010). Le Maroc est considéré comme étant un important producteur, au point qu'en France, le label «menthe verte» est souvent associé au Maroc. Les superficies et les productions de la menthe ont connu une croissance continue, entre 1994 et 2003; l année a connu un maximum de superficie (4000 ha) et un pic de production ( tonnes). A partir de cette date, une régression a été amorcée, aussi bien en superficie qu'en production, pour s'établir, en à 2550 ha de surface et moins de tonnes de production. 1. Aspect botanique M. spicata (L.) est une plante herbacée très courante dans les jardins, glabre, d une odeur agréable, pouvant atteindre 1 mètre de hauteur. Elle est pourvue de rhizomes et de stolons qui assurent sa multiplication végétative, ce qui peut la rendre envahissante. Le feuillage est habituellement vert profond mais les jeunes feuilles sont généralement plus claires. Les feuilles sont gaufrées, subsessiles, lancéolées, dentées, vertes sur les deux faces (Figure 18); elles portent des glandes sécretant une essence, le menthol, dans une bonne proportion. Les fleurs généralement rosées voire blanches sont groupées en épis et apparaissent en été (Fernandez, 2003). 63

88 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées Figure 18: Feuilles du M. spicata (L.) ( Par froissement, cette plante développe une odeur aromatique caractéristique de saveur agréable. Les États-Unis est un gros producteur de menthe au niveau mondial, mais il s'en produit aussi en Chine, à l Inde, en Australie, enfrance, en Italie et au Canada (Lachance, 2001). En Afrique du Nord (Maroc, Algérie,...), l'espèce est retrouvée dans beaucoup de jardins et en culture pour des buts culinaires. 2. Constituants chimiques M. spicata (L.) contient des métabolites secondaires tels que les HE, les resines, les tanins, les flavonoïdes et les alcaloîdes (Ullah et al., 2011). Beaucoup de composés phénoliques, flavonoïdes et terpénoîdes ont été identifiés à partir de différents extraits de la menthe verte (Bimakr et al., 2011; Zheng et al., 2003). L'HE de la menthe verte riche surtout en L-carvone (40 à 80%), l'acétate de dihydrocuminyle (10 à 12%), ces deux constituants majeurs étant responsables de l'odeur de la plante) et le limonène (5 à 15%); ils sont accompagnés de la dihydrocarvone, du dihydrocarvéol, d'acétate de carvyle et de l α-caryophyllène. dans d'autre espèces chimiques, la carvone est accompagnée du composé 1,8-cinéole (jusqu'à 20%), de la pulégone ( jusqu'à 50 %) ou du 4-terpinéol ( jusqu'à 18%) (Avato et al., 1995). Les analyses chimiques des HE de la menthe verte au Maroc ont révélé la présence de la carvone (50 à 70%) et du limonène (11 à 21%) comme constituants majeurs (El Fadl et al., 2010). Sa concentration dans les HE varie selon la structure génétique, les facteurs climatiques, les pratiques agricoles et la région d origine (Edris et al., 2003; Telci et al., 2006). Autre chémotype caractérisant l HE du M. spicata (L.) est l époxyde de pipériténone qui atteint 80% au profit de la carvone (1-2%) (Misra et al., 1989). 64

89 Chapitre III : Monographie des espèces étudiées 3. Usages thérapeutiques M. spicata (L.) est utilisée dans de nombreux traitements et cela depuis la nuit des temps. Ses vertus sont multiples et ses modes d utilisation en font une des plantes médicinales les plus connues. Elle est réputée pour soigner de nombreux troubles tels que les affections dermatologiques, troubles digestifs variés, spasmes du colon, colites, troubles fonctionnels digestifs d'origine hépatique, rhume, nez bouché, affections de la bouche et de l'oropharynx. Elle est également connue par sa capacité à améliorer la mémoire (Adsersen et al., 2006). L'extrait de feuilles bouillies est utilisé pour soulager le hoquet, les flatulences, les vertiges et de remédier l'inflammation, la bronchite, et pour contrôler les vomissements pendant la grossesse (Kumar et al., 2011). Elle aide à la digestion, de manière à ce qu elle décompose les graisses; elle est également recommandée pour traiter l obésité (Abbaszadeh et al., 2009). De plus, la menthe a de nombreuses vertus médicinales, elle est préconisée comme hépatostimulante, vasoconstricteure, tonique, antispasmodique, analgésique, antiinflammatoire, calmante; cholagogue, cholérétique, cicatrisante, bactéricide et fébrifuge. L HE de la menthe est d'une importance économique; elle est largement utilisée dans l'industrie pharmaceutique, cosmétique, alimentaire, confiserie et dans l industrie des boissons. Elle présente un effet expectorant en cas de bronchite ou de grippe, elle est à la fois rafraîchissante et analgésique. Elle est employée également dans l aromatisation des crèmes, des dentifrices, des chewing-gums, des boissons rafraîchissantes, etc. Néanmoins, la menthe présente dans certains cas des effets indésirables: abortive, elle est généralement déconseillée aux femmes enceintes, elle est par contre recommandée en cas de retard menstruel (Kanatt et al., 2007; Choudhury et al., 2006). 65

90 PARTIE EXPERIMENTALE

91 Chapitre. I Etude phytochimique des HE et des extraits des M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh., et M. spicata L.

92 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits I. Introduction L étude biochimique des métabolites secondaires des plantes, particulièrement pour des raisons économiques, a fait l objet d intenses efforts, contribuant au développement de plusieurs pans entiers de la phytochimie ayant des rapports étroits avec la pharmacie et l industrie des colorants. Les constituants phytochimiques bioactifs que renferment les plantes leur confèrent la valeur médicinale en produisant des actions physiologiques précises sur le corps humain. La connaissance de ces constituants est donc importante, non seulement pour la découverte d'agents thérapeutiques, mais aussi parce que cette information peut être utile dans la divulgation de nouvelles sources de ces matières économiques comme les tanins, les huiles, les gommes, les précurseurs pour la synthèse de substances chimiques complexes...etc (Gravot, 2009). Plusieurs enquêtes phytochimiques ont été publiées. Les principales substances chimiques d'intérêt dans ces enquêtes ont été les alcaloïdes et les saponosides. D'autres groupes de composés phytochimiques naturels tels que les flavonoïdes, les tanins, les stérols, les triterpénoïdes, les HE, etc., ont aussi été signalés (Ullah et al., 2012). L extraction de ces principes actifs à haute valeur et particulièrement des polyphénols est une étape très importante dans l'isolement aussi bien que dans l'identification des composés phénoliques. En conséquence, certains chercheurs se sont interessés à l étude de l'influence de différentes conditions d extraction sur les rendements d extraction de composés phénoliques de source végétale (Bonnaillie et al., 2010). D'autres ont visé l'identification des composés spécifiques d'he pour leur valeur économique et leur utilisation dans l'industrie pharmaceutique, cosmétique, alimentaire, de confiserie, et dans les industries de boissons (Kanatt et al., 2007). Dans ce premier chapitre, nous nous sommes interessés, d une part à la détermination de la composition chimique des HE et des hydrolats de trois espèces de menthes qui proviennent de différentes régions du Moyen-Atlas, et d autre part à la détection de diverses classes de métabolites secondaires qui permettront d expliquer l aspect thérapeutique de ces espèces largement utilisées par la population locale. Nous avons procédé par la suite à l extraction des polyphénols et des flavonoîdes et au dosage de leurs teneurs dans les extraits de menthes avec la recherche de la meilleure technique d extraction en testant et en modifiant les méthodes et les solvants d extraction. 66

93 II. Matériels et Méthodes Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits 1. Matériels végétaux Le materiel végétal utilisé pour l extraction des HE et des hydrolats est composé de la partie aérienne (feuilles et fleurs) du M. pulegium (L.), du M. suaveolens (Ehrh.) et du M. spicata (L.) récoltées dans quatre sites du Moyen-Atlas (Figure 19). Le climat est semihumide avec une forte influence continentale et une température annuelle moyenne de 20 C. L identification botanique de ces échantillons a été effectuée par le Professeur M. Ibn Tattou à l institut scientifique de Rabat. Ainsi, les données relatives à la récolte de ces espèces sont regroupées dans le Tableau 2. Fleur du M. suaveolens Feuilles du M. suaveolens M. pulegium M. spicata spontanée M. spicata cultivée Figure 19 : Espèces des menthes étudiées de différentes régions du Moyen-Atlas 67

94 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Tableau 2: Lieux et périodes de récolte des espèces étudiées Lieu de récolte Espèce étudiée Période de récolte Géographie Azrou M rirt M. Pulegium L. Juin 1278m d altitude M. suaveolens Ehrh Nord, Juillet M. spicata L. (spontanée) Ouest M. Pulegium L. 1113m d altitude Juillet Nord, M. suaveolens Ehrh Ouest Khénifra M. Pulegium L. Aout Meknès M. Pulegium L. M. suaveolens Ehrh. M. spicata L. (cultivée) Mai Juillet 860m d altitude Nord, Ouest 552 m d altitude Nord, Ouest 2. Méthodes d extraction et d analyse des composés volatils 2.1. Extraction des HE de trois menthes 100 g de feuilles et/ou de fleurs ont été séchées à l'air à la température ambiante par hydrodistillation à l aide d un appareil de type Clevenger pendant trois heures. Les HE ont été séchées avec du sulfate de sodium anhydre et stockées dans un réfrigérateur à 4 C jusqu'à utilisation. Pour le calcul de rendements en HE, trois répétitions ont été réalisées pour chaque matière végétale. Les valeurs des rendements (exprimées en ml par 100 g de matière sèche), sont évaluées à partir d échantillons séchés dans une étuve réglée à 105 C jusqu au poids constant et calculés selon la formule suivante : où Rdt = (V 10 4 ) / (m0 (100 %H)) V : Volume d'huile récupéré (ml), mo : Prise d'essai initiale du matériel végétal (g) % H: Pourcentage d humidité Rdt: Rendement en HE (Volume d'he en ml par 100 g de matière sèche). Le taux d humidité de la matière végétale a consisté à introduire 5 g d échantillon broyés et placés dans une coupelle tarée, elle-même positionnée dans une étuve réglée à 105 ± 2 C. Les échantillons sont ensuite pesés avec précision, toutes les 6 heures, après avoir été refroidis à température ambiante dans un dessiccateur, et ce jusqu à l obtention d un poids constant. 68

95 Le taux d'humidité est calculé selon la formule ci-dessous : où % H= (m0 m) / (m0 100) mo : Masse de l'échantillon avant l'étuvage, m : Masse de l'échantillon après l'étuvage %H : Pourcentage d'humidité Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits 2.2. Extraction des hydrolats de trois menthes L hydrolat a été séparé de l HE par décantation, récupéré dans des récipients hermétiques et conservé au réfrigérateur. L essence aromatique contenue dans l hydrolat a été récupérée par extraction liquide-liquide en utilisant l éther comme solvant organique ((Rao, 2002; Boukhatem et al., 2010). L extrait éthéré a été mis à l évaporation par rotavapeur sous vide afin de récupérer l HE dissoute destinée à l analyse chromatographique Analyse des HE et des hydrolats par CG/MS Les analyses chromatographiques ont été effectuées au moyen d un chromatographe en phase gazeuse de type Hewlett Packard (série HP 6890), équipé d une colonne capillaire HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm épaisseur de film), d un détecteur FID réglé à 250 C et alimenté par un mélange de gaz H2/air. Le mode d injection est en split, le gaz vecteur utilisé est l azote avec un débit de 1,7 ml/ min. La température de la colonne est programmée à raison d une monté de 4 C/ min de 50 à 200 C pendant 5 min. L appareil est piloté par un système informatique de type «HP Chemstation» gérant le fonctionnement de l appareil et permettant de suivre l évolution des analyses chromatographiques. La CG/SM a été réalisée à l aide d un chromatographe Hewlett Packard (HP 6890) couplé à un spectromètre de masse (série HP 5973). La fragmentation est effectuée par impact électronique à 70 ev. La colonne utilisée est une capillaire de type HP-5SM (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). La température de la colonne est programmée à raison d une monté de 4 C/min de 50 à 200 C pendant 5 min. Le gaz vecteur utilisé est l hélium dont le débit est fixé à 1,7 ml/min. Le mode d injection est de type split. L identification des constituants des HE et des hydrolats étudiés a été assurée à la fois par, la méthode d identification par indice de Kovàts IK (1965) et Adams (2007): les indices de rétention sont calculés à partir des temps d une série d alcanes de C7 à C40, et à partir de la base des données des spectres de masse. Les spectres de masse obtenus sont comparés à ceux des bibliothèques informatisées NIST/EPA/NIH MASS SPECTRAL LIBRARY Version 2 (2002). 69

96 3. Criblage phytochimique Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits L étude phytochimique a nécessité tout d abord la préparation du matériel végétal. Les parties végétales des trois espèces de menthes ont été séchées à l air libre, pulvérisées à l aide d un broyeur électrique et utilisées pour la préparation des extraits, des infusés et des décoctés. Nous avons obtenu des poudres de couleur verdâtre foncée et claire très fines. Des extractions sélectives des broyats ont été effectuées spécifiquement pour chaque famille des composés étudiés. Les extraits nécessaires ont été obtenus par extraction avec des solvants tels que l éther de pétrole, le méthanol, l éthanol, le chloroforme et l eau distillée. Par la suite, les extraits sont soumis à des tests de caractérisation au moyen des réactions de coloration selon le protocole de N Ghessan et al. (2009), Bruneton (2009), Judith (2005) et Harborne (1998) Test des Alcaloïdes Les alcaloïdes ont été caractérisés par le réactif de Dragendorff. Dans deux tubes à essai, nous avons mis 1ml de filtrat (extrait issu de l agitation et de la macération de l acide sulfurique avec la poudre végétale séchée et filtré). L apparition d un précipité ou coloration orangée indiquerait la présence des alcaloïdes par ajout de 5 gouttes de réactif de Dragendorff Test des Tanins 1ml de solution aqueuse de chlorure ferrique a été ajouté à 5 ml de l extrait aqueux. La présence des tanins est indiquée par une coloration verdâtre ou bleu-noirâtre. Les tanins catéchiques ont été détectés par la formation d un précipité rouge soluble dans l alcool isoamylique à partir de l ébullition pendant 15 mn d un mélange de 5ml de l extrait aqueux et 5 ml de l acide chlorhydrique. Les tanins galliques ont été recherchés au moyen de réactif de Stiasny. 15 ml de ce réactif a été ajouté à 30 ml de l extrait aqueux. Le mélange a été chauffé au bain-marie à 90 C pendant 15mn après filtration, le filtrat a été saturé par 5 g d acétate de sodium. L addition de quelques gouttes de FeCl3 provoquerait l apparition d une coloration bleu-noir intense, signe de la présence de tanins galliques Test des flavonoïdes La recherche des flavonoïdes a été réalisée par la réaction à la cyanidine. Un volume de 5 ml de l extrait aqueux (5%) a été repris dans 5 ml d alcool chlorhydrique. Une coloration rose orangée ou violacée apparait en ajoutant 2 à 3 copeaux de magnésium. L addition de 1 ml d alcool isoamylique a intensifié cette coloration qui a confirmé la présence de flavonoïdes. 70

97 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits L apparition d une coloration rose orangée (flavones) ou rose violacée (flavonones) ou rouge (flavonols, flavononols) rassemblée dans la couche surnageante d alcool iso-amylique indique la présence d un flavonoïde libre (génines). Les colorations sont moins intenses avec les hétérosides flavoniques. La réaction à la cyanidine est négative avec les chalcones, les dihydrochalcones, les aurones, les catéchines et les isoflavones. Pour la détection des leucoanthocyanes, nous avons effectué la réaction à la cyanidine sans ajouter les copeaux de magnésium. En présence de leucoanthocyanes, il se développe une coloration rouge cerise ou violacée Test des Saponosides Dans une série de 10 tubes à essai numérotés de 1 à 10, nous avons réparti successivement 1 ml à 10 ml du décocté et ajusté le volume dans chaque tube à 10 ml avec de l eau distillée. Chaque tube a été agité pendant 15 s puis laissé au repos durant 15 min. L indice de mousse =1000/Numéro du tube (dont la hauteur de mousse persistante atteint 1 cm). La présence des saponines dans la plante est confirmée avec un indice de mousse supérieur à 100 (Dohou et al., 2003) Test des Stérols et Triterpènes Les stérols et les triterpenes ont été recherchés par la réaction de Liebermann. L extrait éthéré a été évaporé à sec. Le résidu est dissout à chaud dans 1 ml d anhydride acétique ; nous avons ajouté 1 ml d acide sulfurique concentré. L apparition, à l interphase, d un anneau pourpre ou violet, virant au bleu puis au vert, a indiqué une réaction positive Test des Anthraquinones Pour la détection des anthraquinones libres, 1ml de l ammoniaque dilué a été ajouté à l extrait chloroformique obtenu. La réaction est positive avec une coloration plus ou moins rouge. L acide chlorhydrique concentré, l ammoniaque diluée et le chloroforme ont permis de rechercher les anthraquinones combinées Test des Mucilages La présence des mucilages a été indiquée par l obtention d un précipité floconneux à partir d un mélange de 1 ml de l extrait aqueux et 5 ml d éthanol absolu. 71

98 3.8. Test des Oses et Holosides Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Nous avons procédé à l évaporation au bain-marie à sec de 5 ml de l extrait aqueux. 2 à 3 gouttes de l acide sulfurique concentré ont été additionnées au résidu. Après 5 mn, nous avons ajouté 3 à 4 gouttes d éthanol saturé avec du thymol. Le développement d une coloration rouge a révélé la présence des oses et des holosides Test des Composés Réducteurs Les composés réducteurs ont été détectés à l aide du réactif de Fehling. 5 ml de l extrait aqueux a été évaporé à sec au bain-marie. L obtention d un précipité rouge-brique par ajout d 1 ml du réactif de Fehling au résidu indique la présence des composés réducteurs. 4. Méthodes d extraction et du dosage des polyphénols 4.1. Extraction des polyphénols Les différents extraits de la menthe pouliot, la menthe odorante et de la menthe verte ont été obtenus par extraction liquide-liquide en se basant sur le degré de solubilité des polyphénols dans des solvants organiques tels que le méthanol, le chloroforme, l acétate d éthyle et le n-butanol. L objectif de cette extraction est de libérer les polyphénols présents dans les broyats du M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.) et M. spicata (L.). L extraction des composés phénoliques s est effectuée par deux méthodes: la macération et soxhlet Extraction par macération Après séchage dans un endroit sec et aéré, à l abri de la lumière du soleil, les plantes sont broyées entièrement, puis pesées (M= 30 g). La matière végétale obtenue est mise à macération dans un mélange hydroalcoolique (Méthanol/eau; 70/30; V/V), pendant 48 heures. Le mélange est filtré, le solvant est éliminé par l évaporateur rotatif. Le résidu est pesé pour calculer le rendement. Après filtration et concentration sous vide, l extrait méthanolique est dilué avec de l eau distillée à raison de 50 ml pour 100 g de matière sèche, la solution est laissée au repos pendant une nuit puis filtrée. Après filtration, la solution a subi des extractions successives de type liquide-liquide en utilisant des solvants de polarité croissante. Nous avons commencé par le chloroforme puis l acétate d éthyle et enfin avec le n-butanol. Chaque extraction est répétée trois fois pour calculer le rendement moyen des extraits obtenus. 72

99 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Les phases ainsi obtenues (phase chloroformique, d acétate d éthyle, n-butanolique et la phase résiduelle) sont concentrées à sec sous pression réduite, pesées, puis les phases sont reprises avec du méthanol et abandonnées à l air libre pour évaporation Extraction par soxhlet La matière végétale (30 g), sèche et broyée, est mise en contact avec le mélange méthanol/eau (70/30) (v/v) et portée sous reflux pendant trois heures. Dans un appareil soxhlet, après refroidissement à température ambiante, l extrait méthanolique est filtré puis évaporé sous pression réduite à sec (T = 60 C) par un évaporateur rotatif. Ensuite le même protocole (que celui de la macération) a été suivi pour le fractionnement des polyphénols. Calcul du rendement d extraction Le rendement est calculé par la relation suivante : R(%) = Masse de l extrait résiduel Masse de la poudre végétale sèche 100 Analyse quantitative des composés phénoliques Cette analyse va permettre d avoir une estimation sur la teneur en phénols totaux des extraits. Le dosage des phénols totaux a été effectué par une méthode adaptée de Singleton et Rossi en utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu (Singleton et al., 1965). Tandis que la teneur en flavonoïdes totaux dans les échantillons est évaluée par la méthode du trichlorure d aluminium (AlCl3) d après une méthode adaptée de Djeridane et al. (2006) Dosage des phénols totaux des trois menthes Dosage des polyphénols (Réactif de Folin-Ciocalteu) Le dosage est réalisé au moyen du réactif de Folin-Ciocalteu selon la méthode décrite par Dehpour et al. (2009) légèrement modifiée. Cette méthode est basée sur la réduction du réactif de Folin-Ciocalteu, constitué d acides phosphotungstique et phosphomolybdique, en milieu légèrement alcalin, par les ions phénolates. Les produits de réduction (tungstène et molybdène) présentent une coloration bleue et absorbent à 760 nm. Cette coloration reflète généralement la quantité de phénols exprimés en équivalent d acide gallique. Une gamme de concentration, allant de 0,08; 0,04; 0,16; 0,32; 0,48; 0,6; 0,96 et 1,28 µg/ml, a été réalisée, dans des fioles jaugées, à partir de 50 mg/l d acide gallique en ajoutant à chaque solution, un volume de 1,5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu à 10%. Le 73

100 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits mélange a été agité et laissé en repos pendant 6 min avant l addition de 1,5 ml de solution de Na2CO3 à 7,5%. Les solutions, ajustées avec de l eau distillée pour obtenir un volume final de 100 ml, ont été secouées immédiatement et maintenues dans l obscurité pendant 2 h à une température ambiante. L absorbance de chaque solution a été déterminée à 765 nm avec un spectrophotomètre Shimadzu UV-MINI Cette technique à double faisceau nous a aidés à éliminer l absorbance du blanc et donner directement la densité optique de l échantillon. L analyse quantitative des phénols totaux des extraits phénoliques de nos échantillons a été réalisée en adaptant la même procédure utilisée pour l établissement de la courbe d étalonnage, en remplaçant l acide gallique par un volume d extrait jusqu'à une concentration appropriée. Les concentrations des polyphénols totaux de chaque extrait a été calculée à partir de l équation de régression de la gamme d étalonnage établie avec l acide gallique (y = 0,095x + 0,003) (Annexe 4). Les résultats sont exprimés en milligramme d équivalent d acide gallique par un gramme de la matière sèche (mg EAG/ g de plante). Ces résultats ont permis de donner des estimations sur les teneurs en polyphénols totaux contenus dans les parties aériennes des M. pulegium (L.), M. spicata (L.), et M. suaveolens (Ehrh.). La teneur en phénols totaux est calculée selon la formule suivante : T = C V m matière sèche D C : Concentration évaluée selon la courbe d étalonnage. V : Volume de l extrait global. D : Facteur de dilution Dosage des flavonoïdes Le trichlorure d aluminium (AlCl3) forme un complexe très stable avec les groupements hydroxydes OH des phénols. Ce complexe jaune absorbe la lumière visible à une longueur d onde de 433 nm. Les flavonoïdes sont estimés par une spectroscopie UV, dont la Quercétine est utilisée comme un standard à une longueur d onde λ =433 nm (Annexe 4). La teneur en flavonoïdes est estimée par la méthode d AlCl3, selon le protocole suivant : 0,1 ml de l extrait de la plante est mélangé avec 0,1 ml de chlorure aluminium 10%, suivie de 20 ml d eau distillée et complété avec le méthanol absolu à 50 ml, puis laissé deux heures dans l obscurité. L absorbance de chaque solution a été déterminée à 433 nm. Dans les mêmes conditions, la solution standard de la quercétine est préparée avec une concentration de 0,1 mg/ml (25 mg/ 250 ml). 74

101 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Les concentrations des flavonoïdes de chaque extrait ont été calculées à partir de l équation de régression de la gamme d étalonnage établie avec la quercétine (y = 0,073x - 0,081) (Annexe 4). T = C V m matière sèche D C : Concentration évaluée selon la courbe d étalonnage. V : Volume de l extrait global. D : Facteur de dilution. III. Résultats et discussion 1. Composition chimique des huiles essentielles de menthes 1.1. Rendements et composition chimique des HE du M. pulegium L. Les rendements, calculés à partir des matières végétales sèches, varient d'un échantillon à l autre. L'HE du M. pulegium L. de Meknès présente le rendement le plus élevé (6,9%) suivie de celles de Khénifra (6,2%), d Azrou (5,9%) puis celle de M rirt (5,29%). Ces teneurs en HE sont plus élevées que celles déjà obtenues par Boughdad et al. (2011) (4,77%), Benayad (2008) (2,33%) et Derwich et al. (2010) (1,66%). L'analyse chromatographique des HE ont permis d identifier 26 composés qui représentent environ 99,10% pour M. pulegium d'azrou, 13 composés (99,87%) du M. pulegium (L.) de M'rirt contre 16 composés pour l'échantillon de Khénifra (89,10%). Les monoterpènes oxygénés sont la classe la plus abondante des composés identifiés dans les trois HE. Cependant, les sesquiterpènes se trouvent avec des petites quantités dans les HE d Azrou et de Khénifra et quasi-absents dans celle de M'rirt (Tableau 3). Tableau 3: Composition chimique des HE du M. pulegium (L.) du Moyen-Atlas Composé IK Area % Azrou M rirt Khénifra α-pinène 939 0,17 0,14 0,23 β-pinène 979 0,15 0,13 0,22 Meta-mentha-1(7), 8-diene , O-cymène , Limonène , ,8- cinéole ,10 0,10 Para-mentha-3,8-diène , Trans-p-menth-2-en-1-ol ,57 0,28 - Isopulegol ,55 Isopulegol (iso) ,38 Benzylacetate , Chrysanthenol(Cis) ,03 0,80 - α -Terpineol ,17 0,10-75

102 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Tableau 3 (suite) : Composition chimique des HE du M. pulegium (L.) du Moyen- Atlas Trans-pulegol ,19 0,06 0,07 Coahuilensol methyl ether , Cis-pulegol ,04 Pulégone ,86 71,97 81,46 Piperitone , Perilla-aldehyde , Thymol ,01 0,04 - Carvacrol , p-vinyl-guaiacol , Piperitenone ,81 26,04 - Z-Caryophyllène , E-Caryophyllène ,04-1,70 α -Guaiène ,08 0,06 - α -Humulène ,89 Trans-4,10-epoxy-amorphane ,09 4-epi-cis-dihydroagarofurane , epi-cubebol ,51 Cis-Sesquisabinène hydrate ,17 Germacrène D-4-ol , Trans-Sesquisabinène hydrate ,57 Caryophyllène oxyde , Allo-cedrol ,07 Cedrol ,05 Himachalol , Himachal-4-en-1- β-ol (11- α H) ,06 - Monoterpènes oxygénés 87,12 99,39 82,6 Monoterpènes hydrocarbonnés 1,32 0,27 0,45 Sesquiterpènes oxygénés 0,23 0,06 1,46 Sesquiterpènes hydrocarbonnés 0,23 0,06 4,59 Autres 0, Total % 99,10 99,78 89,10 L'HE d Azrou est dominée par la pulégone (68,86%) et la pipériténone (24,79%). D'autres composés ont été identifiés mais à des pourcentages relativement faibles, tels que chrysanthenol (1,03%), le thymol (1,01%), le limonène (0,9%) et le menth-2-ène-1-ol (0,57%). Deux constituants caractérisent également l'he de M'rirt mais leurs pourcentages sont plus élevés que ceux d'azrou, soient la pulégone (71,97%) et la pipériténone (26,04%) accompagnées de chrysanthenol (0,80%), menth-2-en-1-ol (0,28%), α-pinène (0,14%) et β- pinène (0,13%). Cependant, l'he de Khénifra est principalement composée de la pulégone avec un taux plus important que les deux autres régions (81,46%). D'autres composés ont été également identifiés, mais à des taux bas tels que l'α-humelène (2,89%), l E-caryophyllène (1,70%), l isopulégol (0,55%), le 10-epicubelol (0,51%), l α-pinène (0,23%) et le β-pinène (0,22%). 76

103 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Des différences dans la composition chimique des trois huiles ont été constatées. En effet, le limonène (0,9%), le périlla-aldéhyde (0,21%) et l'éther de méthyle coahuilensol (0,16%) sont spécifiques à l'huile d'azrou. En outre, la pipériténone, deuxième chémotype de l HE d'azrou (24,81%), est absente dans celle de Khénifra. Cette dernière contient également des composés spécifiques tels que l α-humelène (2,89%), l E-caryophyllène (1,70%), le transsabinène hydrate (0,57%), l isopulégol (0,55%) et le 10-épi-Cubébol (0,51%). D'autre part, le 1,8-cinéole (0,10%) est présent seulement dans l huile de Khénifra. La menthe pouliot peut être considérée comme une source importante de la pulégone. Cette cétone présente environ les 3/4 de la composition chimique globale des huiles étudiées. Elle est généralement utilisée dans la fabrication de produits industriels et cosmétiques car elle peut être transformée en menthol par semi-synthèse qui est très demandée pour aromatiser les aliments, dans les produits cosmétiques et l'industrie pharmaceutique. La composition chimique des HE étudiées est similaire à celle rapportée par plusieurs études déjà réalisées au Maroc. L'HE du M. pulegium du Maroc se caractérise par un taux élevé de pulégone. Le meilleur taux a été enregistré pour l'he étudiée par Chebli et al. (2003) 85,4% de Sud du Maroc. Celle d Asilah (Nord-Est) contient un taux de la pulégone très attractif (80,28%) (Hmiri et al., 2011) légèrement élevé que celle originaire de Taourirt (78,07%) (Sbayou et al., 2014). Quant à l HE de la même région (Taourirt) présente un taux moins important 69,8% (Ait-Ouazzou et al., 2011). La teneur en pulégone dans la menthe pouliot de Meknès est d'environ 65% (Boughdad et al., 2011); dans la région de Rabat (Ain Aouda), elle est d'environ 73,33% (Benayad, 2008). De même, les HE de la menthe pouliot de différentes zones algériennes sont caractérisées par la prédominance de pulégone avec des proportions différentes variant de 43,3 à 87,3% (Bghidja et al., 2007). Des résultats similaires ont été obtenus à partir de l essence provenant de l'uruguay (Lorenzo et al., 2002) et de la Tunisie (Hajlaoui et al., 2012), les principaux composés sont respectivement la pulégone (73,4% et 61,11%) et l isomenthone (12,9% et 17,02%). En Egypte, cette huile est riche en pulégone (43,5%) et en pipéritone (12,2%) (El Ghorab, 2006). En revanche, les espèces de l'iran (Mahboubi et al., 2009) et de Skoura (Maroc) (Derwich et al., 2010) contiennent deux chemotypes particuliers: la pipéritone (38% et 35,56%) et la pipériténone (33% et 21,12%) tandis que les taux de la pulégone ne dépassent pas 2,3% et 6,42% respectivement. De même, les essences du Portugal (Teixeira et al., 2012) et de la Yougoslavie (Chalchat et al., 2000) se caractérisent par une composition chimique différente dont les composés principaux sont la menthone (35,9% et 30,9%) et la pulégone (23,2% et 14,1%) respectivement. 77

104 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits 1.2. Rendements et Composition chimique des HE de M. suaveolens L HE du M. suaveolens de Meknès a marqué un rendement énormement élevé (5,68%) que celui d Azrou (1,8%) et de M'rirt (1,55%). Ce dernier taux est presque similaire à celui trouvé par Amzouar et al. (2016) dans la région de Loukkos (1,6%). Le meilleur rendement a été obtenu également par l HE d Oulmès avec un taux de 4.33% (Benayad, 2008). Quant aux HE extraites des échantillons de Meknès 0,73% (Boughdad et al., 2011), d Azrou 0,6% (Amzouar et al., 2016) et de Boulmane 0,53% (Derwich et al., 2010) ont donné des rendements relativement inférieurs aux nôtres. L'analyse chromatographique de deux HE a permis d'identifier 47 composés constituant 99,61% de la composition chimique totale de l HE du M. suaveolens d Azrou tandis que celle de M'rirt contient 34 composés représentant 99,52% (Tableau 4). Les deux HE du M. suaveolens sont riches en monoterpènes oxygénés mais la plus grande teneur a été observée pour M'rirt (94,5%) contre 82,83% d Azrou. Inversement, les sesquiterpènes dans l'huile d Azrou atteint 13,23% contre 3,11% pour M'rirt. Les monoterpènes et les sesquiterpènes exercent de larges actions biologiques qui sont importantes dans la chimie des aliments et l'industrie pharmaceutique (Abdelgaleil et al, 2009; Buchbauer et al., 2013). L'oxyde de piperitenone est le constituant majoritaire d'he d Azrou (74,67%), suivi avec des faibles pourcentages de muurolène (5,53%), de la pulégone (2,34%), du limonène (1,85%), de <4a, 7-β-α, α-7a > nepetalactone (1,81%), de β-caryophyllène (1,68%) et de la piperiténone (1,17%). Deux chemotypes dominent l'he de M'rirt avec des taux plus importants qu Azrou, principalement l'oxyde pipériténone (81,69%) et la pipériténone (10,14%). D'autres composants ont été également identifiés avec des quantités relativement faibles: β- caryophyllène (0,91%), le limonène (0,56%), le terpinène-4-ol (0,52%) et la pulégone (0,47%). L α-pinène (0,36%), le β-pinène (0,65%) et le bornéol (0,29%) existent à peu près à parts égales dans les deux huiles. Des différences entre les deux huiles ont été signalées. Il existe des composés qui sont spécifiques à l HE d Azrou tels que trans-calamenène (0,77%), khusimène (0,68%) et longifolène (0,27%). En revanche, lédol (0,23%), géranial (0,2%) et l'acétate d'isobornyle (0,1%) sont présents uniquement dans l HE de M'rirt. 78

105 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Tableau 4 : Composition chimique des HE du M. suaveolens (Ehrh.) du Moyen-Atlas Composé IK Aire % Azrou M rirt α-pinène 939 0,36 0,36 Camphène ,03 β-pinène 979 0,65 0,65 Meta-mentha-1(7),8-diène ,18 0,02 α-terpinène ,07 -- p-cimène ,13 -- Limonène ,85 0,56 γ -terpinène ,13 -- Cis-sabinène hydrate ,53 0,06 Trans-sabinène hydrate , octen-3-yl-acétate ,13 0,16 Dehydro-sabina cétone , acetyl-1-methyl cyclohexene ,08 -- Nopinone ,05 0,05 Bornéol ,27 0,29 Terpinen-4-ol , p-cymen-8-ol ,12 -- α-terpinéol ,25 0,34 methyl ether Coahuilensol ,14 -- Pulégone ,34 0,47 Oxyde de Cis-carvone ,44 0,19 Geranial ,2 Perilla aldehyde ,17 0,04 Isobornylacétate ,1 Acetophenonone<3'methoxy ,14 Piperitenone ,17 10,14 Oxyde de piperitenone , Daucène ,11 -- β-elemène ,16 -- <4a-α,7-β,7a-α> nepetalactone ,81 0,42 Longifolène ,27 -- β-caryophyllène ,68 0,91 Cis-muurola-3,5-diène ,09 -- Spirolepechinène ,16 0,09 Khusimène ,68 -- cis-cadina-1(6),4-diène ,81 0,29 γ -Muurolène ,53 0,5 γ -Amorphène ,30 0,04 Aciphyllène ,10 -- γ -cadinène ,11 0,1 Trans-calamenène ,77 -- α-cadinène ,09 0,05 Spathulenol ,60 0,25 Oxyde de Caryophellène ,26 0,21 Globulol ,23 0,06 Ledol ,23 79

106 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Tableau 4 (suite): Composition chimique des HE du M. suaveolens (Ehrh.) du Moyen-Atlas 1,10-di-epi-Cubénol ,43 0,25 10-epi-α-cadinol ,28 0,04 Torreyol ,05 -- α-cadinol ,35 0,09 Germacra-4 (15), 5,10(14) trien-1-α-ol ,07 -- Shyobunol ,10 -- Monoterpènes oxygénés 82,83 94,5 Monoterpènes hydrocarbonés 3,37 1,62 Sesquiterpènes oxygénés 2,37 1,13 Sesquiterpènes hydrocarbonés 10,86 1,98 Autres 0,18 0,29 Total % 99,61 99,52 La composition chimique des HE étudiées est conforme à celle rapportée par des recherches antérieures. L HE du M. suaveolens issue également d Azrou est caractérisée par la prédominace de l oxyde de pipériténone avec une teneur inférieure à celle de notre échantillon (54,51%) mais le pourcentage du limonène est légèrement élevé (5,61%) (Amzouar et al., 2016). L HE du M. suaveolens de Meknès est caractérisée par la prédominance de l'oxyde de pipériténone (34%) (Boughdad et al., 2011). De même, les échantillons provenaient de l'uruguay et de la Grèce ont montré une prépondérance de l'oxyde de pipériténone qui atteint 80,8% (Lorenzo et al., 2002) et 62,4% (Koulipoulos et al., 2010) respectivement. Cependant, les mêmes espèces dans le nord de l'algérie (Brada et al., 2007) contiennent trois compositions chimiques variables: le premier chimiotype est caractérisé par la prédominance de l'oxyde de piperitenone (29,36%) et de l'oxyde de pipéritone (19,72%). Inversement, le second est prédominé par l'oxyde de pipéritone (31,4%) suivi par de l'oxyde de piperitenone (27,79%); le troisième chemotype algérien contient la pipériténone comme constituant majeur (54,91%). Le même composé (33,03%) est accompagné de la pulégone (17,61%) dans la région d'oulmès (Benayad, 2008). L'étude réalisée par Sutour et al. (2010), sur deux huiles du corse, a révélé deux constituants majeurs différents: la pipériténone (73,5%) et l'oxyde de pipériténone (72%). Cependant, les compositions chimiques de l essence de Béni-Mellal (El Arch et al., 2003) et celle de Boulmane (Derwich et al., 2010) sont totalement différentes de nos échantillons, la pulégone (85,5%) et le menthol (40,50%) sont les principaux composés respectivement. En outre, Eman et al. (2010) ont rapporté que l espèce issue de Beheira (Egypte) est dominée par le linalol (35,32%) et p-menth-1-en-8-ol (11,08%). 80

107 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits 1.3. Rendements et Composition chimique des HE de M. spicata L. Le rendement moyen en HE de la menthe verte spontanée d Azrou est plus élevé (2,4%) par rapport à celle cultivée de Meknès (1,54%). De même, les rendements moyens en HE, provenant de 4 régions Turques, sont également compris entre 2,41 et 2,74% (Telci et al., 2010). En outre, Edris et al. (2003) ont constaté que la menthe verte de Siwa (Egypte), cultivée dans d autres régions, a donné des rendements très intéressants qui s échelonnent entre 1,59 et 3,90%. Ces taux sont considérés comme élevés par rapport à ceux rapportés dans la littérature (Kokkini et al., 1995); ils s accordent avec celui obtenu par l HE extraite de la menthe verte du Caire qui ne dépasse pas 1,30% (Edris et al., 2003) et celui de l essence de la menthe indienne (0,65%) (Verma et al., 2011). 32 composés ont été identifiés dans les deux HE qui représentent 97,65% du total de la composition chimique de l HE de Meknès et 96,07% de celle d Azrou. Les monoterpènes sont plus abondants dans les deux essences que les sesquiterpènes mais c est l HE de Meknès qui contient le taux le plus élevé en monoterpènes (93,42%) par rapport à celle d Azrou (88,75%). Inversement, cette dernière renferme 4,81% de sesquiterpènes contre 4,05% dans l essence de Meknès. D une manière générale, nous constatons une légère modification de la composition chimique des deux HE du M. spicata L. (Tableau 5). Cette modification est remarquable au niveau des composés majeurs (Carvone et Limonène). Les taux de carvone et du limonène sont de l ordre de 74,91 et 13,17% pour l HE de Meknès est de 71,56% et 10,50% pour celle d Azrou. D autres composés sont présents dans les deux essences mais avec des teneurs plus élevées dans l HE d Azrou: Trans-4-caranone (2,74-1,04%), iso-dihydrocarvéol acétate (2,07-0,10%) et α-bourbonène (1,04-0,89%). En outre, les composés tels que Cis-Muurola-4(14), 5- diène (0,11%) et trans-sesquisabinène hydrate (0,13%) sont présents uniquement dans l HE d Azrou. Tableau 5: Composition chimique des HE du M. spicata L. du Moyen-Atlas Composé IK calculé Aire % Meknès Azrou α-pinène 933 0,51 0,37 β-pinène 975 0,79 0,58 p-mentha-1(7), 8-diène 994 0, Limonène ,17 10,50 Ocimène (E)-ß , p-mentha-3,8-diène ,01 0,79 Terpinolène ,08 0,10 Bornéol ,41 0,78 81

108 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Tableau 5 (suite): Composition chimique des HE du M. spicata L. du Moyen-Atlas terpinen-4-ol ,38 0,65 α-terpinéol ,16 0,12 trans-4-caranone ,01 2,74 trans-carvéol ,16 0,22 Cis-carvéol , Pulegone ,46 0,16 Carvone ,91 71,56 p-cymen-7-ol ,07 0,08 ɣ-terpinen-7-al ,09 0,10 Iso-dihydrocarveol acétate ,10 2,07 cis-carvyl acétate ,08 0,44 α-yalengène ,08 β-bourbonène ,89 1,04 β-elemène ,06 0,09 β-caryophyllène ,76 0,76 β-coparène ,13 0,16 6,9-Guaiadiène ,13 0,15 Spirolepechinène ,10 0,12 Cis-Cadina-1(6),4-diène ,25 0,15 Cis-Muurola-4(14),5-diène ,11 Germacrène D ,87 0,61 Trans-calamenène ,24 0,33 Spathulénol ,08 0,14 Trans-Sesquisabinènehydrate ,13 Globulol ,14 0,23 1,10-di-epi-Cubénol ,11 0,17 Hinésol ,17 0,30 α-cadinol ,12 0,24 Monoterpènes oxygénés 77,71 76,41 Monoterpènes hydrocarbonés 15,71 12,34 Sesquiterpènes oxygénés 0,62 1,21 Sesquiterpènes hydrocarbonés 3,43 3,6 Total % 97,65 96,07 La composition chimique des huiles de M. spicata L. étudiées est conforme à celle rapportée par certaines recherches menées précédemment. L'HE de la menthe verte obtenue, originaire de la vallée Saïs (Maroc), était riche en carvone (73.01%), limonène (8,54%) et en 1,8-cinéole (6,70%) (El Hassani et al., 2010), mais celle de la Grèce a été caractérisée par la prédominance de la carvone (71,8%) suivie du 1,8-cinéole (9%), mais dépourvue du limonène. La carvone (29,00%) est le composé principal de l'he de la menthe verte d Errachidia (sud-est du Maroc) suivie par le trans-carvéol (14,00%) (Znini et al., 2011). L'huile, extraite de la Tunisie, est également dominée par la carvone et le limonène avec des taux moins importants en carvone (40,8%) et plus élevés en limonène (20,8%) que nos plantes, suivis par le 1,8-cinéole (17%) (Verma et al., 2011). Par ailleurs, Chauhan et al. 82

109 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits (2010) ont rapporté que les constituants principaux de l HE de la menthe verte étaient la carvone (76,65%), le limonène (9,57%), le cis-dihydrocarvone (2,04%) et le 1,8-cinéole (1,93%). Dernièrement, Padalia et al. (2013) ont étudié la composition chimique de 16 cultivars de la menthe verte de la région de l'himalaya occidentale (Chine) et ont constaté que la carvone (51,3% - 65,1%), le limonène (15,1% - 25,2%), le β-pinène (1,3% - 3,2%), et le 1,8-cinéole ( 0.1% %) sont les principaux constituants de cinq cultivars. En outre, l'he extraite à partir de feuilles de la menthe verte algérienne, a été caractérisée par la prédominance de la carvone (59,40%), tandis que le limonène présente un pourcentage de l ordre de 6,12% (Boukhebti et al., 2011). De même, dans l étude de Sokovic et al. (2009), la carvone (49,5%) est aussi le constituant principal de l HE, suivie de la menthone (21,9%) et du limonène (5,8%). Dans les plaines du Nord indien, la teneur en carvone varie entre 45,9% et 77,1% (Bahl et al., 2015). Les quantités de carvone varient aussi dans les HE de la menthe verte en croissance dans différents pays, tels que le Canada (59% - 74%) (Zheljazkov et al., 2010), l'egypte (46,4% - 68,55%) (Abdel-Wahab, 2009; Foda et al., 2010), la Turquie (78,35% - 82,2%) (Telci et al., 2004; Telci et al., 2005), la Chine (55,45% -74,6% (Hua et al., 2011), Bangladesh (73,2%) (Chaudhary et al., 2007), et récemment, Zhao et al. (2013) (46,7% - 65,41%). Bien que, les teneurs inférieures en carvone ont été signalées dans l'he de la menthe verte de l'iran (22,4%) (Hadjiakhoondi et al., 2000); Rasooli et al. (2008) ont identifié une composition chimique différente de l'he de menthe verte, dans d'autres régions d'iran, qui l α-terpinène (19,7%), l'oxyde de pipéritone (19,3%), l isomenthone (10,3%), et le β-caryophyllène (7,6%) étaient les principaux constituants. Même espèce de la Turquie a été signalée riche en linalol (82,8%) (Baser et al., 1999), alors que l essence de Serbie a été dominée par la menthone (21,9%), la carvone (49,5%), le limonène (5.7%), le 1,8-cinéole (3%) et le β-mycrene (2,3%) (Sokovic et al., 2009). Dans la région de Zagazig (Egypte), Omar et al. (2009) dans leurs études ont également rapporté que la menthone (32,43%), le 1,8-cinéole (18,79%), la cis-isopulégone (16,65%), la pulégone (10,01%) ont été les principaux composés de l HE. alors que celle de Sfax (sud de la Tunisie) a montré un profil chimique différent dont les principaux composés ont été identifiés comme étant la menthone (32,74%), la pulégone (26,67%), le 1,8-cinéole (11,16%), et le menthol (11,42%) (Dhifi et al., 2013). Les HE, les plus riches en carvone, sont largement utilisées dans les industries de la parfumerie et des arômes en Europe. La carvone peut également être utilisée dans les arômes alimentaires, les additifs pour aliments, les produits de soins personnels et en médecine vétérinaire (Rasooli et al., 2008). En effet, le limonène est également utilisé dans la 83

110 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits préparation des médicaments, pour favoriser la perte de poids, dans le traitement du cancer et de la bronchite. Dans les aliments, les boissons et les chewing-gums, le limonène est utilisé aussi comme une substance aromatisante. Dans le secteur pharmaceutique, il est ajouté aux crèmes pour aider à la pénétration dans la peau. Dans le secteur industriel, il est utilisé comme un parfum et comme ingrédient dans le nettoyage des mains. 2. Composition chimique des hydrolats de trois menthes du Moyen-Atlas Les hydrolats extraits de menthes étudiées ci-dessus présentent des profils chimiques différents. 25 composés représentent environ 70,43% pour l hydrolat de M. pulegium, 17 composés pour l hydrolat du M. Suaveolens Ehrh (73,93%) tandis que celui de M. spicata L., il contient 19 composés qui représentent 58,28% de la composition totale. Les monoterpènes et les sesquiterpènes hydrocarbonés se présentent en faibles taux dans l hydrolat de la menthe pouliot et celui de la menthe verte tandis qu ils sont totalement absents dans celui de la menthe à feuilles rondes (Tableau 6). Composé Tableau 6: Composition chimique des hydrolats des menthes étudiées IK calculé M. suaveolens M. pulegium L. M. spicata L. HE Hyd HE Hyd HE Hyd Tricyclène ,20 α-thujène , α-pinène 939 0, ,17 0,52 0,37 5,88 α-fenchène , ,59 β-pinène 979 0, ,15 0,18 0,58 2,25 Meta-mentha-1(7),8-diène , , α-terpinène , , α-cymène , p-cymène , O-Cymène , ,8-Cinéole , ,85 Limonène , , , γ Terpinène , , ,27 Cis-sabinène hydrate , p-mentha 3,8, diène , , Trans-sabinene hydrate , Terpinolène , Cis-thujone , octen-3-yl-acetate , Trans-thujone , Dehydro-sabina ketone , acetyl-1-methyl cyclohexene , Nopinone ,

111 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Tableau 6(suite): Composition chimique des hydrolats des menthes étudiées Camphre , ,53 Trans-p-menth-2-en-1-ol , Isopulegol<neo> , Benzylacétate , Cis-Chrysanthenol , Bornéol ,27 0, ,59 0,78 3,14 Terpinen-4-ol ,71 0, ,65 0,22 p-cymen-8-ol , α-terpinéol , , ,12 0,10 Dihydrocarveol néo ,23 Trans-4-caranone , Myrténal , Trans-pulégol , Coahuilensol, methyl ether , , Cis-p-mentha-1(7),8-dien-2-ol ,28 Pulegone , ,86 2,32 0, Carvone ,56 0,24 Piperitone , Trans-myrtanol , Cis-carvone oxide , Perilla aldehyde , , Bornyl acetate ,40 Thujanol acetate neo iso , p-cymen-7-ol , Thymol ,01 1, α-terpinen-7-al , Camphorquinone , Carvacrol ,04 39, ,56 p-vinyl-guaiacol , Citraldimethoxy , Iso-dihydrocarveol acetate , Methylo anisate ,65 Peperitenone ,17 0,10 24,81 10, Acetophenone-4 -methoxy , Cis-carvyl-acetate , Piperitenone oxide ,69 69, α-yalengene , Daucene , β-bourbonene , β-elemene , , Nepetalactone <4a-α,7-β,7a-α> ,81 0, Nepetalactone <4aα,7α,7aβ> , Z-Caryophyllene , Longifolene , β-caryophyllene , ,04 0,58 0,76 0,47 β-coparene , α-guaine , ,9-Guaiaene , Citronellylpropanate ,

112 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Tableau 6 (suite): Composition chimique des hydrolats des menthes étudiées Cis-muurola-3,5-diene , Spirolepechinene , , Khusimene , Cis-cadina-1(6),4-diene , , Cis-Muurola-1(14),5-diene , Bakerol , ,03 γ -Muurolene , Germacrene D , γ -Amorphene , epi-cis-dihydroagrofurane , Aciphyllene , γ -cadinene , butylatedhydroxytoluene , , Trans-calamenene , , α-cadinene , Germacrene D-4-ol , Spathulenol , , Trans-sesquisabinene hydrate , Caryophyllene oxide , , Presilphiperfiolan-8-ol , ,28 Globulol , , ,10-di-epi-Cubenol , epi-α-cadinol , Hinesol , Torreyol , Himachalol , α-cadinol , , Germacra-4 (15), 5,10(14) trien-1-α-ol , Shyobunol , Caryophyllene 14-hydroxy 4,5-dihydro ,14 Monoterpènes oxygénés 82,83 62,05 87,12 72,77 76,41 45,55 Monoterpènes hydrocarbonés 3,37 2,17 1, ,34 11,19 Sésquiterpènes oxygénés 2,37 1,35 0,23 0,20 3,6 0,42 Sesquiterpènes hydrocarbonés 10,86 0,58 0,23 0 1,21 0,65 Autres 0,18 0,13 0,2 0,96 2,51 0,47 Total % 99,61 73,93 99,10 70,34 96,07 58,28 L'hydrolat de la menthe pouliot a montré une composition chimique différente de celle de l HE de la même plante. Il est caractérisé par la prédominance du carvacrol (39,37%) et de la pipéritenone (10,05%) alors que la pulégone se trouve en petit taux (2,32%) et le thymol a atteint 1,65%. Certains constituants ont été trouvés dans l hydrolat mais ils sont absents dans l'huile, tels que le 1,8-cinéole (4,75%), l α-cymène (4,43%), le camphre (1,88%), le transthuyone (1,03%), l α-terpinène (0,86%), le bornéol (0,59%), l α-thujène (0,16%) et l αfenchène (0,15%). 86

113 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits L oxyde de pipéritenone est le principal composé de l hydrolat de la menthe à feuilles rondes (69,32%). Cependant, celui de la France a été dominé par d'autres constituants: cis-cisp-menthenolide (67,3%) et la pulégone (14,8%) (Sutour et al., 2010). Le composé principal de l HE de la menthe à feuilles rondes est également l'oxyde pipéritenone mais avec un taux plus élevé que celui de l hydrolat (74,69%), suivi par la pulégone (2,34%). D'autres composés sont absents dans l hydrolatcomme le limonène (1,85%), le β-pinène (0,65%), le cis-sabinène hydrate (0,53%) et l α-pinène (0,36%), tandis que le camphoquinone (1,74%), trans-myrtenal (0,32%), citral diméthoxy (0,29%), myrténal (0,26%), isopulégol néo> (0,12%) sont présents seulement dans l'hydrolat. Quant à l hydrolat de la menthe verte, il présente une composition chimique intéressante dont les composés majoritaires sont le 1,8-cinéole (22,85%) et le camphre (13,53%). Des constituants ont été identifiés avec des taux plus élevés que l HE comme l α- pinène (5,88%), le carvacrol (3,65%), le bornéol (3,14%), l α-fenchène (2,59%) et le β-pinène (2,25%), tandis que la carvone présente un faible taux de 0,24%. La composition chimique des hydrolats étudiés semble très différente par rapport aux HE extraites des mêmes espèces. Des travaux antérieurs ont rapporté des résultats similaires; les hydrolats étudiés par Rao et al. (2002), Piochon (2008), Boukhatem et al. (2010) et Sutour et al. (2010) ont également montré l'abondance des composés oxygénés et hydrophiles. Cette richesse est due à leur capacité d'être soluble dans l'eau. Cependant, l'abondance des hydrocarbures dans les HE est due à leur faible solubilité dans l'eau de distillation (Rivera et al., 2010). Lors de la distillation d'une plante, l huile essentielle se dissout dans l'eau de condensation, des composés oxygénés tels que les alcools, les esters, les aldéhydes et les cétones sont plus solubles dans l'eau de condensation (Fleisher, 1991; Schorr, 2004; Rivera et al, 2010). Par conséquent, les molécules oxygénées se produisent en grandes quantités alors que les composés lipophiles sont pratiquement absents pour la plupart du temps (Boukhatem et al., 2010; Sutour et al., 2010). La variation des rendements et de la composition chimique des huiles essentielles et des hydrolats dépend de nombreux facteurs tels que la méthode utilisée, les parties de la plante utilisée, les produits et les réactifs utilisés dans l'extraction, l'environnement, le génotype de la plante, l'origine géographique, la période de récolte de la plante, le degré de séchage, les conditions du séchage, la température et le temps de séchage et la présence de parasites, des virus et des mauvaises herbes (Figueredo, 2012). 87

114 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits 3. Criblage phytochimique des parties aeriennes des menthes Le criblage phytochimique au moyen des tests de coloration a permis de mettre en évidence les familles chimiques que renferment les espèces étudiées (Tableau 7). La coloration bleu-violacée, qui prouve la présence des anthocyanes, n est obtenue que pour M. suaveolens de Meknès. La coloration rose orangée obtenue par réaction à la cyanidine confirme que M. spicata (L.) et M. suaveolens (Ehrh.) contiennent les flavones tandis que la coloration était rose moins intense pour M. pulegium (L.) ce qui indique peut-être la présence des hétérosides flavoniques. La réaction était positive pour détecter les leucoanthocyanes; la coloration rouge cerise était bien marquée pour M. pulegium (L.) quant aux menthes à feuilles rondes et verte, ils ont manifesté une teinte brun-rouge indiquant la présence des catéchols. L absence du précipité rouge soluble dans l alcool iso-amylique indique que les trois espèces sont dépourvues des tanins catéchiques à l exception de la menthe odorante de Meknès par rapport à celles d Azrou et de M rirt. Pourtant, la coloration bleu-noire bien marquée a prouvé la richesse de toutes les espèces en tanins galliques. L apparition du précipité, au moyen du réactif de draggendroff, indique l existence des alcaloîdes dans la menthe pouliot, moins importants dans la menthe à feuilles rondes et presque très peu abondants dans les menthes vertes. Tableau 7: Résultats du screening phytochimique des menthes au moyen des réactions Colorées Groupe chimique Observations M. pulegium L. M. suaveolens Ehrh M. spicata L. Azrou Meknès Azrou M rirt Meknès Azrou Meknès Tanins galliques ± + Tanins catéchiques Anthocyanes Flavonoïdes flavones ± leucoanthocyanes + + ± Alcaloïdes + + ± ± - ± ± Saponines (Indice de mousse) (125) (120) (105,5) (115) (112) Anthraquinones libres Anthraquinones combinés Oses et holosides Stérols et triterpenes Composés réducteurs Mucilages Glycosides cyanogéniques (+): Présence (++): Abondance (-): Absence 88

115 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits La menthe pouliot des deux régions semblent riches en saponosides que les autres menthes alors que la menthe verte d Azrou est dépourvue de ces composés. Les mucilages et, les stérols et les triterpènes sont signalés abondants dans les trois menthes tandis que les anthraquinones et les glucosides cyanogéniques ne sont pas détéctés. Les composés réducteurs existent dans la menthe pouliot et absents chez les deux autres espèces. La présence effective de certains groupes chimiques et l absence d autres n exclut pas les propriétés thérapeutiques de ces plantes (Kabran et al., 2011). Ces composés sont connus pour leurs propriétés bioactives. Les flavonoïdes sont des antioxydants très efficaces et non toxiques; ils sont antiulcéreux, antispasmodiques, anti-sécrétoires, anti-diarrhéiques, antiallergiques, anti-inflammatoires et ils protègent contre le cancer et la cataracte (Bruneton, 2009; Bimakr et al, 2011). Les alcaloïdes ont des activités pharmacologiques telles que le renforcement de l'activité cardiaque, l'excitation du système nerveux central et des nerfs symptomatiques et la stimulation de la circulation sanguine (Kabran et al., 2011). La présence d'alcaloïdes peut également justifier l'utilisation de ces plantes dans le traitement de certaines maladies (N'Ghessan et al., 2009). Les tanins montrent les propriétés de la vitamine D, ils pourraient être utilisés pour renforcer les vaisseaux sanguins et contribuer à l'accumulation de la vitamine C dans le corps (Kabran et al., 2011). Les saponosides sont rapportés avoir des propriétés hypocholestérolémiants et antidiabétiques (Ali et al., 2008) comme ils peuvent être responsables de l activité antibactérienne (N Ghessan et al., 2009; Kabran et al., 2011), et les stérols et les triterpènes possèdent des propriétés bactéricides, analgésiques et anticancéreuses (Ali et al., 2008; N'Ghessan et al., 2009). Peu nombreux les travaux qui ont été réalisés sur l étude phytochimique de ces menthes. Des différences ont été observées dans cette étude par rapport à d autres travaux antérieurs. Ullah et al. (2011) ont trouvé que la menthe verte, provenant de quatre régions du Pakistan, contient des tanins, des alcaloïdes, flavonoïdes, stéroîdes, coumarines, stérols et triterpènes alors que les saponosides et les anthraquinones n'ont pas été détectés. L extrait éthanolique des feuilles du M. spicata de l Iraq est riche également en ces familles chimiques à l exception des terpènes (Khudhair, 2016). De même, l étude menée par Naidu et al. (2012) a permis de révéler la présence des alcaloïdes, des flavonoïdes et des glucosides dans l extrait brut de cette espèce. Pourtant, celle étudiée par Prasad (2014) est dépourvue des phénols, saponosides, flavonoïdes, glucosides cardiotoniques et des terpènes. Récemment, une étude phytochimique marocaine a été effectuée sur l extrait hydrométhanolique de la menthe pouliot dont les résultats sont presque similaires aux nôtres; El-Akhal et al. (2016) ont montré 89

116 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits la présence des tanins galliques, des flavonoïdes, des mucilages, et des stérols et triterpènes. Quant aux tanins catéchiques et coumarines, ils n ont pas été trouvés. Zaidi et al. (2015) se sont interessés à chercher ces composés dans la menthe verte; ils ont conclu qu à l exception des anthraquinones et des tanins, toutes les familles chimiques étaient presque présentes. La présence d une famille chimique ou son absence au sein de la même espèce ou dans les différentes menthes étudiées, est peut-être due à l influence de plusieurs facteurs comme la variation de la constitution génétique, les conditions météorologiques et l'emplacement géographique des plantes, la procédure d'extraction utilisée, la partie de la plante étudiée ou leurs produits phytochimiques (Malik et al., 2012; Sujana et al., 2013; Akhtar et al., 2015). Les propriétés susmentionnées ont été corrélées aux classes des métabolites secondaires identifiés dans les espèces de menthes sélectionnées. Par conséquent, ces menthes présentent des effets thérapeutiques importants. Ces résultats ont justifié leur large utilisation dans la médecine traditionnelle par la population du Moyen-Atlas. 4. Résultats du Dosage des composés phénoliques 4.1. Rendements d extraction des polyphénols Les rendements de différents extraits obtenus de chaque menthe ont été regroupés dans le Tableau (8). Tableau 8: Rendements d extraction des polyphénols totaux dans les trois menthes Rendement % Extrait M. pulegium M. suaveolens M. spicata Mac Sox Mac Sox Mac Sox Extrait brut 13 26,37 27,17 39,13 9,4 23,07 Extrait chloroformique 0,36 0,8 3,23 3,63 0,33 1,6 Extrait d acétate d éthyle 1,7 1,8 5,6 7,63 0,87 1,47 Extrait butanolique 1,26 2,83 3,53 2,97 2,2 7,1 Extrait aqueux 3,8 8,3 6,1 10,37 4,9 34,9 Rendement d extraction par soxhlet: Il ressort à travers l observation des rendements d extraction (Figure 20), que l extrait hydrométhanolique donne le meilleur rendement d extraction: 26,37% et 39,13% pour M. pulegium et M. suaveolens respectivement tandis que le meilleur rendement a été enregistré chez M. spicata L. (34,9%) par l extrait aqueux suivi de l extrait brut (23,07%). En revanche, le chloroforme donne le plus faible rendement (0,8%) pour M. pulegium L., le n-butanol (2,97%) pour M. suaveolens Ehrh., et l acétate d éthyle (1,47%) pour M. spicata L. 90

117 Rendement % Rendement % Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Soxhlet Extrait brut Extrait chloroformique Extrait d'acétate d'éthyle Extrait butanolique Extrait aqueux 0 MP MO MV Figure 20 : Rendements en polyphénols des extraits de menthes obtenus par soxhlet Rendement d extraction par macération: les résultats des rendements donnés par macération (Figure 21) montrent que le meilleur rendement a été obtenu également par l extrait hydrométhanolique suivi de l extrait aqueux pour M. Pulegium (13-3,8%), M. suaveolens (27,17 6,1%) et M. spicata L. (9,4 4,9%) respectivement alors que les extraits chloroformiques des trois menthes manifestent les plus faibles rendements. 30 Macération Extrait brut Extrait chloroformique Extrait d'acétate d'éthyle Extrait butanolique Extrait aqueux 0 MP MO MV Figure 21 : Rendements en polyphénols des extraits de menthes obtenus par macération Rendement d extraction par espèce végétale: c est la menthe à feuilles rondes qui présente les rendements les plus importants par rapport aux autres espèces à la fois par macération et soxhlet; les extraits bruts (27,17 39,19%), aqueux (6,1 10,37%) et d acétate d éthyle (5,6-7,63%) qui ont donné le meilleur rendement, venu par la suite les extraits chloroformique et butanolique. Quant à la menthe pouliot, l extrait brut, issu de la macération et du soxhlet, a également donné le rendement le plus élevé (13-26,37%) suivi des extraits aqueux (3,8 8,3%) et butanolique (1,26 2,83%) respectivement. Ces résultats sont presque 91

118 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits similaires à ceux cités par Bencheikh (2012) et Khennouf et al. (2013), les extraits brut et aqueux de la menthe pouliot algérienne, obtenus par macération, ont également enregistré les meilleurs rendements (14,4-13,87%) respectivement. Pourtant, les extraits de la menthe verte par macération présentent généralement les rendements les plus bas par rapport à ceux du M. pulegium L. et du M. suaveolens; quant à l extrait aqueux de la même menthe, obtenu par soxhlet, renferme le rendement le plus fort (34,9%) par comparaison à tous les extraits obtenus, suivi des extraits brut (23,07%) et butanolique (7,1%). De même, Barchan et al. (2014) ont trouvé des résultats similaires dont l extrait aqueux du M. spicata L., originaire du Nord, manifeste le rendement le plus fort (29,4%) par rapport à celui du M. pulegium L. (6,42%). Les rendements d extraction obtenus varient donc en fonction de la technique d extraction et de l espèce testée. Les meilleurs rendements d extraction, des deux méthodes utilisées pour les trois espèces, sont enregistrés par soxhlet et particulièrement chez M. suaveolens Ehrh. Les extractions par des solvants sont les procédures les plus couramment utilisées pour préparer les extraits de matières végétales en raison de leur facilité d'utilisation, leur efficacité et leur large applicabilité. De nombreux travaux ont rapporté que le rendement en extraction chimique dépend du type de solvant avec différentes polarités, du temps d'extraction, de la température, du rapport échantillon/solvant ainsi que de la composition chimique et des caractéristiques physiques des échantillons (Costa et al, 2012). Barchan et al. (2014) ont constaté que les meilleurs rendements reviennent aux extraits obtenus par l eau et le méthanol à l opposé de l hexane et le dichlorométhane. En revanche, Stankovic et al. (2011) ont déduit que le meilleur rendement a été obtenu par le méthanol, suivi de l eau et de l acétate d éthyle. Pour l'extraction de substances phénoliques des Lamiacées, le solvant le plus largement utilisé est le méthanol. Dall Acqua et al. (2008) ont constaté que l extraction par le méthanol a donné de meilleurs rendements pour M. pulegium (8,3%) et d autres plantes étudiées. L extrait méthanolique de M. pulegium L., récoltée au Nord-Ouest algérien, a atteint une teneur d environ 25,12% (Khalid-Khodja et al., 2014). En outre, Çakir et al. (2006) dans leur étude sur les composés phénoliques du L.Teucrium (Lamiacées), ont rapporté que le méthanol donne un rendement d'extraction plus élevé que l'acétone, le chloroforme et l éther de pétrole. L'utilisation du méthanol, de l'eau, de l'éther de pétrole et du chloroforme par Sharififar et al. (2009) pour l'extraction de polyphénols à partir du T. polium, a montré que le méthanol donne le rendement d'extraction le plus élevé. De même, Tay et al. (2014) ont constaté que les concentrations testées du solvant (éthanol), utilisé pour l extraction des polyphénols, et le 92

119 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits rapport échantillon/ solvant ont eu un effet significatif sur les rendements. De même, Mata et al. (2007) ont également trouvé que les extraits aqueux de la menthe pouliot et la menthe verte du Portugal sont plus riches en polyphénols que les extraits éthanoliques mais l extrait éthanolique de la menthe pouliot qui présente le contenu le plus élevé tandis que l extrait aqueux de la menthe verte renferme une teneur plus importante (75,8 g/ 100g) que celle de la menthe pouliot. Selon Franco et al. (2008), les rendements les plus élevés sont généralement obtenus avec de l'éthanol et le méthanol et leurs mélanges avec l'eau, bien que d'autres solvants aient été largement utilisés dans l extraction de polyphénols de plantes, comme l'acétate d'éthyle ou l'acétone. L'eau et l'éthanol sont les plus largement utilisés en raison de leur faible toxicité et du rendement élevé d'extraction, avec l'avantage de moduler la polarité du solvant en utilisant des mélanges éthanol/eau à des rapports différents. Le principal inconvénient de l'extraction aqueuse est la faible solubilité des antioxydants liposolubles non ou peu polaires comme, par exemple, les caroténoïdes qui donnent des rendements trop faibles. La solubilité des polyphénols dépend principalement des groupes hydroxyles, de la taille moléculaire et de la longueur de la chaîne carbonée Teneurs en polyphénols totaux En se basant sur les valeurs de l'absorbance des diverses solutions des extraits, ayant réagi avec le réactif de Folin-Ciocalteu et comparées à la solution étalon en équivalence d acide gallique comme décrit ci-dessus, les résultats de l'analyse colorimétrique des composés phénoliques totaux des trois menthes étudiées sont présentés dans le Tableau 9. Ils montrent que les extraits bruts présentent généralement les teneurs les plus élevées en phénols totaux que ce soit par macération ou par soxhlet et pour les trois menthes testées. Viennent en second lieu l extrait d acétate d éthyle du M. spicata L. (16,11 mg EAG/g MS) et les extraits butanoliques obtenus par soxhlet pour M. suaveolens (11,48 mg EAG/g MS) et M. pulegium (11,88. mg EAG/g MS). Par macération, c est la fraction d acétate d éthyle du M. pulegium qui montre le contenu en polyphénols le plus intéressant (9,70 mg EAG/g MS) suivi de la fraction brute (7,23 mg EAG/g MS). Ces résultats sont confirmés par Seddik et al. (2013); ils ont constaté que la teneur en polyphénols dans les différentes fractions de la menthe pouliot algérienne décroit comme suit: la fraction d acétate d éthyle (191,99 ± 0,016 μg EAG/g d extrait) > la fraction brute (183,45 ± 0,125 μg EAG/g d extrait) > la fraction chloroformique (119,73 ± 0,036 μg EAG/g d extrait) > la fraction aqueuse (88,84 ± 0,112 μg EAG/g d extrait). 93

120 Teneur en polyphénols mg EAG/g MS Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Tableau 9 : Teneurs en polyphénols de différentes fractions des menthes Extrait Teneur en polyphénols (mg EAG/g MS) M. spicata M. suaveolens M. pulegium Mac Sox Mac Sox Mac Sox Extrait brut 5,98 15,44 15,56 24,89 7,23 14,24 Extraitchloroformique 1,03 2,43 5,66 6,80 3,38 7,22 Extrait d acétate d éthyle 0,52 16,11 7,22 7,19 9,70 9,66 Extrait butanolique 4,38 7,11 5,18 11,48 4,88 11,88 Extrait aqueux 4,17 1,55 5,81 5,99 3,67 1,36 Les fractions obtenues par la technique du soxhlet marquent les plus fortes teneurs par rapport à celles issues de la macération pour toutes les menthes testées. D un autre côté, les valeurs les plus importantes dans les différentes fractions ont été enregistrées pour la menthe à feuilles rondes (Figure 22) suivie du M. pulegium (Figure 23) et M. spicata L. (Figure 24) respectivement. En revanche, Les extraits bruts et les fractions les plus polaires présentaient le grand contenu en polyphénols. Senevirathne et al. (2006) ont étudié le potentiel antioxydant des différentes fractions de l'extrait méthanolique de l espèce Ecklonia cava et ont rapporté que parmi les fractions organiques, la fraction d'acétate d'éthyle a présenté le plus haut niveau de phénols totaux. La fraction chloroformique et l extrait méthanolique ont également montré une teneur élevée en composés phénoliques. Pourtant, nos résultats ont montré que les extraits chloroformiques des trois espèces renferment les basses teneurs en polyphénols totaux M. suaveolens Ehrh Mac Sox E.brut E.CHCl3 Ext.Ac Eth Ext.but Ext. Aq Figure 22 : Teneurs en polyphénols des extraits du M. suaveolens Ehrh. 94

121 Teneur en polyphénols mg EAG/g MS Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits M. pulegium L Mac Sox E.brut E.CHCl3 Ext.Ac Eth Ext.but Ext. Aq Figure 23 : Teneurs en polyphénols des extraits du M. pulegium L.. M. spicata L. Teneur en polyphénols mg EAG/g MS E.brut E.CHCl3 Ext.Ac Eth Ext.but Ext. Aq Mac Sox Figure 24 : Teneurs en polyphénols des extraits du M.spicata L. La variabilité des teneurs en polyphénols chez ces espèces végétales est dû probablement à la composition phénolique des extraits (Hayouni et al., 2007), les conditions biotiques (espèce, organe et l étape physiologique) et abiotiques: la nature du sol et le type de bioclimat et aussi les étages bioclimatiques où poussent ces plantes (Atmani et al., 2009). L étude de la teneur en polyphénols dans les plantes a fait l objet de nombreuses recherches; les teneurs en polyphénols des différents extraits du M. suaveolens, étudiés par Bichra et al. (2012), varient entre 0,25 et 2,65 mg EAG/g de la matière sèche (MS). Alors que les extraits préparés à partir des tiges et des feuilles de M. suaveolens d Algérie, au moyen du méthanol et de l eau, ont révélé des teneurs en polyphénols importantes pour l extrait aqueux des feuilles (20,75 mg AGE/ g MS) (Seladji et al., 2014). Bencheikh (2012) a trouvé 95

122 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits également que c est l extrait d acétate d éthyle du M. pulegium L. qui a enregistré la teneur la plus importante en polyphénols (191,99µg EAG/g d extrait) suivi des extraits méthanolique (183,45 µg EAG/g d extrait) et chloroformique (119,99 µg EAG/g d extrait). De même, Khaled-Khodja et al. (2014) ont déduit que l extrait méthanolique du M. pulegium était le plus riche en polyphénols parmi quatre plantes étudiées (72,84 mg EAG/g d extrait). La teneur en polyphénols de l extrait méthanolique de la menthe pouliot de la Grèce atteint une valeur, proche de la nôtre, de l ordre de 13,4 ±0.2mg EAG/g MS (Proestos et al., 2013). Tandis que l extrait aqueux de la menthe pouliot de la Grèce est plus riche en polyphénols (188 mg EAG/g MS) que l extrait méthanolique (138 mg EAG/g MS) (Stagos et al., 2012). Cependant, Derakhshani et al. (2012), dans leur étude sur quelques lamiacées d Iran, ont constaté que l extrait méthanolique de la menthe verte comprend la teneur la plus élevée en polyphénols (22,43±1,13 mg EAG/g MS) que celui de la menthe pouliot (15,95±0,52 mg EAG/g MS). La teneur en composés phénoliques totaux de l'extrait aqueux de la menthe verte indienne a été jugée de 25,62 ± 3,14 mg EAG/g de poids humide de l'échantillon. Dorman et al. (2003) ont rapporté une teneur totale en phénols dans la gamme de mg EAG/g d'extrait de différentes espèces du Mentha. Triantaphyllou et al. (2001) ont indiqué que les extraits des espèces de Mentha comprennent des acides phénoliques et des flavonoïdes. Les principaux acides phénoliques rapportés dans les extraits hydrosolubles du M. spicata sont l eriocitrine, le glucoside lutéoline, l'acide rosmarinique et l'acide caféique (Dorman et al., 2003). En effet, les teneurs en phénols totaux obtenues indiquent qu elles dépendent donc du solvant utilisé, de la technique d extraction et de l espèce étudiée. Outre ces facteurs, s ajoutent le rapport eau/solvant, le rapport échantillon/solvant, le nombre et les conditions d extraction (Telli et al., 2010; Samuagam et al., 2012; Zlotek et al., 2015). Il est clair que les différents solvants permettent d'extraire les différents types de composés phénoliques. Ainsi, les fractions les plus polaires devraient contenir une plus grande quantité de phénols hydrophiles tandis que les extraits chloroformiques, qui manifestent les faibles contenus en polyphénols, peuvent comprendre les composés phénoliques hydrophobes de bas poids moléculaire. En revanche, les extraits bruts auraient dus être riches en composés phénoliques des deux types (Garcia-Perez, 2008) Teneurs en flavonoïdes La principale raison pour laquelle nous avons choisi cette classe de polyphénols, réside dans le fait que les flavonoïdes constituent la classe polyphénolique la plus importante; avec plus de 5000 composés déjà décrits (Gomez-Caravaca et al., 2008). 96

123 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Selon les valeurs d'absorbance des diverses solutions d'extraits, comparées à la solution étalon en équivalent de la quercétine, les résultats de l'analyse colorimétrique en flavonoïdes totaux sont donnés dans le Tableau (10). La quantité de flavonoïdes totaux aurait varié de 0 à 9,91 (M. pulegium/ Macération) et de 1,14 à 14,85 mg d équivalent de Quercétine (EQ)/ g MS (M. pulegium /Soxhlet) (Figure 25). Quant à M. suaveolens, le contenu en flavonoïdes oscille entre 3,99 et 11,22 mg d EQ/g MS (macération) et entre 0,87 et 26,56 mg d EQ/g MS (soxhlet) (Figure 26). De même, ce contenu a enregistré des valeurs comprises entre 0 et 7,53mg d EQ/g MS (macération) et entre 1,37 et 20,53 mg d EQ/g MS pour M. spicata (L.) (Figure 27). Tableau 10 : Les teneurs en flavonoïdes des différentes fractions de trois menthes Extrait M. spicata L. M. suaveolens M. pulegium Mac Sox Mac Sox Mac Sox Extrait brut 3,54 9,1 11,22 26,56 3,21 14,12 Extraitchloroformique 0 11,61 5,53 0,87 0 1,37 Extrait d acétate d éthyle 0,01 14,85 3,57 5,72 7,53 20,53 Extrait n-butanolique 9,91 5,01 10,19 19,80 4,63 12,50 Extrait aqueux 6,31 1,14 7,99 9,96 2,65 6,15 Les fortes teneurs en flavonoïdes ont été observées chez les extraits obtenus par les solvants polaires (acétate d éthyle et n-butanol) pour toutes les plantes testées et particulièrement avec les extraits bruts, à la fois par macération et par soxhlet, de M. suaveolens Ehrh. Cependant, l extrait chloroformique du M. spicata L. a atteint une teneur importante par la technique du soxhlet de l ordre de 11,61 mg EQ/g MS. En effet, Meziti (2009) et Hossain et al. (2011) ont obtenu des résultats comparables dont l extrait chloroformique renferme plus de polyphénols et de flavonoïdes que les autres extraits testés. En revanche, les extraits chloroformiques issus de la macération pour M. spicata et M. pulegium sont très pauvres en flavonoïdes. Alors que les extraits d acétate d éthyle du M. pulegium par macération et par soxhlet (7,53-20,53 mg EQ/g MS respectivement) qui ont enregistré les plus hautes valeurs par rapport aux autres extraits. Des résultats similaires ont été rapportés par Bencheikh (2012) dont l extrait d acétate d éthyle de la menthe pouliot algérienne était le plus riche en flavonoïdes que les autres extraits avec une teneur de 110,03 ± 0,023 µg EQ/ g d extrait. 97

124 Teneur en flavonoides mg d EQ/ g MS Teneur en flavonoides mg d EQ/ g MS Teneur en flavonoides mg d EQ/ g MS Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits M. pulegium L Mac Sox E.brut E.CHCl3 Ext.Ac Eth Ext.but Ext. Aq Figure 25: Teneurs en flavonoïdes des extraits du M.pulegium L. M. suaveolens Ehrh E.brut E.CHCl3 Ext.Ac Eth Ext.but Ext. Aq Mac Sox Figure 26: Teneurs en flavonoïdes des extraits du M.suaveolens Ehrh M. spicata L E.brut E.CHCl3 Ext.Ac Eth Ext.but Mac Sox Ext. Aq Figure 27: Teneurs en flavonoïdes des extraits du M.spicata L. 98

125 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits Les teneurs en flavonoïdes dans les trois menthes, comme celles des polyphénols, dépendent également de la technique d extraction, de l espèce testée ainsi du solvant utilisé. Ceci concorde avec des résultats trouvés dans de nombreux travaux (Mahmoudi et al., 2016; Do et al., 2013; Franco et al., 2008). Comme nous l avons déjà signalé, c est la menthe à feuilles rondes qui prédomine les autres plantes testées que ce soit au niveau des rendements, des teneurs en polyphénols ou encore celles en flavonoïdes. Cependant, la menthe pouliot a enregistré des teneurs en flavonoïdes généralement inférieures à celles du M. spicata à l opposé des valeurs de rendements et de celles des polyphénols totaux. De nombreux travaux ont été intéressés à l extraction des plantes par différents solvants et à la détermination des teneurs en polyphénols et en flavonoïdes par diverses techniques mais ceux concernant les menthes s avèrent peu nombreux. A ce propos, les solvants utilisés pour l extraction des polyphénols et des flavonoïdes des différentes espèces de menthes, qui ont fait l objet de recherches antérieures, étaient souvent le méthanol, l eau ou l éthanol. L extrait méthanolique préparé à partir des feuilles de M. suaveolens d Algérie a révélé un contenu de 2,19 mg Equivalent de catéchine (EC)/g MS par rapport à l extrait aqueux du même organe et aux extraits méthanolique et aqueux des feuilles et des tiges (Seladji et al., 2014). Quant à l extrait méthanolique de M. pulegium (L.), étudié par Khaled-Khodja et al. (2014), a atteint environ 13,82 mg EC/g d extrait en flavonoïdes. La teneur en flavonoïdes de l extrait aqueux de M. spicata (L.) indienne était de 13,5 ± 1,38 mg EC/g de l'échantillon (Kanatt et al., 2005). On note que le contenu en flavonoïdes dans quelques extraits des trois plantes étudiées est supérieur à celui des polyphénols. Ceci pourrait être expliqué par le fait que tous les composés phénoliques ne pouvaient être estimés par extraction unique ou par une méthode unique en raison de la complexité des composés. Alors que la majorité des flavonoïdes sont des composés phénoliques qui signifient qu'ils contiennent au moins un unique groupe phénolique. Il est évident que la teneur en composés phénoliques totaux mesurée par la procédure de Folin-Ciocalteu ne donne pas une image complète de la qualité ou de la quantité des constituants phénoliques dans les extraits (Wojdylo et al., 2007). Malgré sa grande sensibilité, la méthode de Folin-Ciocalteu peut présenter des problèmes d interférence. En effet le réactif de Folin-Ciocalteu peut réagir avec les acides aminés et les sucres réducteurs comme le glucose et le fructose (Boizot et al., 2006). Talbi et al. (2015) ont constaté que la teneur en flavonoïdes est supérieure à celle des polyphénols dans les extraits méthanolique et aqueux de Nigella sativa; ainsi pour les extraits aqueux, hydroéthanolique et éthanolique de Cucumero 99

126 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits psisedulis et Garcinia kola (Pélagie et al., 2015). De même, Settaraksa et al. (2012), dans leur étude sur l effet du solvant sur le contenu en flavonoïdes et l activité antioxydante, ont montré que la pâte de curry engendrait la teneur la plus élevée 81,62 ± 0,03 mg EC/100 g d'échantillon tandis que celle de polyphénols avoisinait 34,02 ± 0,03. Ainsi les extraits hydrométhanolique et chloroformique de leonorus cardiaca (L.) possèdent des teneurs intéressantes en flavonoïdes 50,21 ± 0,65 et 27,25 ± 0,670 mg Equivalent hyperoside/g alors que les polyphénols ont enregistré des contenus de l ordre de 42,95 ± 3,55 et 4,90 ± 0,98 mg EAG/g respectivement (Jafari et al., 2010). En outre, les extraits aqueux et éthanoliques de plusieurs espèces parmi 44 testées originaires de l Australie ont manifesté des teneurs en flavonoïdes plus importantes que celles de polyphénols (Ravipati et al., 2012). On peut conclure que les flavonoïdes dans les extraits des trois espèces sont beaucoup plus polaires qu'apolaires voire que les rendements élevés sont enregistrés pour les extraits bruts et aqueux alors que les flavonoïdes apolaires sont moins présents du fait que les faibles rendements et les teneurs en flavonoïdes sont obtenus avec l'extrait chloroformique. En outre, l'ajout du chloroforme provoque la séparation des flavonoïdes en fractions glycosylées et aglycones, on constate donc que les flavonoïdes glycolysés sont plus abondants que les flavonoïdes aglycones car l'extrait chloroformique, dans lequel ils sont solubles, possède le plus faible rendement. La variation des rendements, et des teneurs en polyphénols totaux et en flavonoîdes résultent de l'effet d'un certain nombre de facteurs dont les principaux sont: les facteurs climatiques et environnementaux tels que la lumière, les précipitations, la topographie, la saison et le type de sols; la période de récolte, le patrimoine génétique: la concentration des polyphénols est très variable d'une espèce à une autre et finalement la méthode d extraction et la méthode de quantification (Lee et al., 2003). IV. Conclusion Cette partie a été consacrée au criblage phytochimique des feuilles et/ou des fleurs des trois espèces de menthes provenant de différentes régions du Moyen-Atlas, au dosage des polyphénols et des flavonoïdes présents dans leurs extraits, et à la détermination des rendements et de la composition chimique de leurs HE et leurs hydrolats. Les résultats de l analyse qualitative et quantitative des HE ont permis de conclure que les rendements et la composition chimique varient en fonction de la région d origine. Cependant, les hydrolats extraits à partir de mêmes espèces présentaient des profils chimiques différents riches en monoterpènes oxygénés et pauvres ou dépourvus en 100

127 Chapitre I. : Etude phytochimique des HE et des extraits sesquiterpènes; les composés principaux sont le carvacrol (39,37%) et pipéritenone (10,05%), l'oxyde de pipéritenone (69,32%), et 1,8-cinéole (22,85%) et du camphre (13,53%), respectivement. Les HE de menthes sont une source importante de certains constituants tels que la pulégone, la menthone, le limonène et la carvone qui sont habituellement utilisés dans la fabrication de produits industriels et cosmétiques. L abondance des composés hydrophiles dans les hydrolats de menthes étudiés a été attribuée à leur solubilité élevée dans l eau de distillation. Différents métabolites secondaires ont été identifiés: les flavonoïdes, les tanins galliques, les stérols et triterpènes, les alcaloïdes et les saponines. Par conséquent, la menthe pouliot, la menthe odorante et la menthe verte peuvent être considérées comme une source potentielle de médicaments utiles. D'autres études seront menées afin d'isoler, d'identifier et de caractériser les composés bioactifs qui se produisent dans ces plantes. Donc, ces métabolites secondaires contribuent à une utilisation efficace des plantes dans les industries pharmacologiques. Le dosage des composés phénoliques des extraits et leurs fractions a permis de révéler des teneurs importantes en polyphénols et en flavonoïdes. Ces teneurs varient selon le solvant et la technique d extraction utilisés et également en fonction de l espèce testée elle-même. Les HE et les hydrolats sont dotés de grandes propriétés thérapeutiques mais les hydrolats sont peu coûteux et faciles à produire et encore plus tolérés que les HE. D'autres efforts doivent être fournis pour caractériser davantage la composition chimique des différents hydrolats et d'évaluer leurs propriétés biologiques. 101

128 Chapitre. II Activité antioxydante des extraits et des HE des M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh) et M. spicata (L.)

129 Chapitre II : Activité antioxydante des menthes I. Introduction Dû aux effets toxiques issus de l utilisation des antioxydants synthétiques, de nombreux chercheurs se sont concentrés sur la recherche de composés naturels ayant des propriétés antioxydantes tels que les composés phénoliques, y compris les flavonoïdes signalés être plus puissants antioxydants que les vitamines C, E et β-carotène qui sont largement utilisées en routine. La consommation des flavonoïdes et leur importance potentielle comme antagonistes du stress oxydatif a été l objet de nombreuses études. Certains flavonoïdes présents dans des infusions du thé peuvent avoir des effets protecteurs contre les maladies coronariennes, le cancer, ou l allergie (Kaur et al., 2002). Une des meilleures approches pour découvrir de nouveaux antioxydants est le screening des extraits des plantes. Le pouvoir antioxydant de ces extraits et particulièrement des HE est développé comme substituant dans la conservation alimentaire. Ce sont surtout les phénols et les polyphénols qui sont responsables de ce pouvoir (Souri et al., 2004). Dans ce contexte, cette étude a été réalisée pour s investiguer sur le pouvoir antioxydant des extraits bruts et leurs fractions, et celui des HE des M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh. et M. spicata L. qui poussent spontanément dans la région d Azrou, par la méthode de piégeage du radical libre stable DPPH. II. Tests in-vitro de l activité antioxydante des extraits et des HE des menthes L expérience a été effectuée à l aide d un spectrophotomètre UV visible à la longueur d onde de 515 nm. La solution de DPPH (1,1-diphényl-di-picrylhydrazyl) à M est obtenue par dissolution de 2,4 mg de la poudre de DPPH dans 100 ml de l éthanol. Les échantillons des extraits de chaque plante, issus de l extraction par le méthanol aqueux, le chloroforme, l acétate d éthyle et le n-butanol par macération et par soxhlet, ont été préparés par dissolution dans l éthanol absolu à raison de 1,6 mg/ml (Nikhat et al., 2009). Le test est réalisé par mélange d un volume de 2,8 ml de la solution obtenue de DPPH avec 200 μl de chaque extrait ou d antioxydant standard (Acide ascorbique) à différentes concentrations (de 0,04 à 1,6 mg/ml), ainsi de chaque HE (60 µl/ml). Après 30 minutes d incubation à l obscurité et à température ambiante, l absorbance est lue à 515 nm contre un blanc qui ne contient que l éthanol. Le contrôle positif contient le DPPH sans extrait, et les valeurs obtenues sont transformées par la suite en pourcentages d inhibition selon l équation ci-après : 102

130 Chapitre II : Activité antioxydante des menthes AA% = A Contrôle A échantillon 100 A Contrôle AA% : Pourcentage de l activité antioxydante. A contrôle : Absorbance de la solution contenant uniquement la solution du radical DPPH. A échantillon : Absorbance de la solution des échantillons à tester en présence de DPPH. Les valeurs de la CI50 de différents extraits (concentration correspondant à la perte de 50% de l activité des radicaux libres) ont été déterminées graphiquement à partir des courbes de tendance polynomiale. III. Résultats 1. Évaluation de l activité antioxydante des extraits des menthes testées L activité antioxydante des différents extraits de la plante et de l acide ascorbique vis-àvis du radical DPPH a été évaluée par spectrométrie UV visible en suivant la réduction de ce radical qui s accompagne par son passage de la couleur violette à la couleur jaune, mesurable à 515 nm (Figure 28). Cette capacité de réduction est déterminée par une diminution de l absorbance induite par des substances antiradicalaires. Figure 28 : Evaluation de l activité antiradicalaire in-vitro des extraits de menthes (Passage d une coloration violette à celle jaunâtre) Le pouvoir antioxydant a été caractérisé par le paramètre CI50. Plus la valeur de la CI50 est basse plus l activité antioxydante est élevée. Ce test vise à mesurer la capacité des extraits à piéger le radical DPPH stable formé en solution par donation d'un atome d'hydrogène ou d un électron (Tepe et al., 2005). 103

131 Pourcentage d'inhibition % Pourcentage d'inhibition % Pourcentage d'inhibition % Chapitre II : Activité antioxydante des menthes Acide ascorbique y = 5168,x ,x ,x - 6,553 R² = 0,979 Poly. (AA%) Concentration en acide ascorbique (mg/ml) Figure 29: Pourcentage d inhibition du DPPH en fonction des concentrations de l acide ascorbique. Les valeurs de la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de l acide ascorbique (strandard de référence) (Figure 29), des extraits de M. pulegium (L.) (Figures 30, 31 et 32) et ceux de M. spicata (L.) (Figures 33, 34 et 35), ont été obtenues à partir des courbes de tendance polynomiale de 3 ème degré. Les valeurs des CI50 calculées révèlent que les différents extraits des menthes testées possèdent une activité antiradicalaire. Extrait brut du M. pulegium L. Extrait d'acétate d'éthyle du M. pulegium y = x x x R² = y = 6,139x3-32,51x2 + 72,30x + 16,32 R² = 0, y = x x x R² = AA% Mac AA% Sox Poly. (AA% Mac) Poly. (AA% Sox) y = x x x R² = AA% Mac AA% Sox Poly. (AA% Mac) Poly. (AA% Sox) Concentration en mg/ml Concentration en mg/ml Figure 30. Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait brut du M. pulegium L. Figure 31 : Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait d acétate d éthyle du M. pulegium L. 104

132 Pourcentage d'inhibition % Pourcentage d'ihibition % Pourcentage d'ihibition % Pourcentage d'inhibition % Extrait butanolique du M. pulegium L. Chapitre II : Activité antioxydante des menthes y = -3,827x 3-2,297x ,10x + 10,67 R² = 0,989 y = 13,09x 3-35,57x ,44x + 4,748 R² = 0, AA% Mac AA% Sox Poly. (AA% Mac) Poly. (AA% Sox) Concentration en mg/ml Figure 32 : Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait butanolique du M. pulegium L Extrait d'acétate d'éthyle du M. spicata L. y = 11.36x x x R² = y = x x x R² = Concentration en mg/ml AA% MAC AA% SOX Poly. (AA% MAC) Poly. (AA% SOX) Extrait brut du M. spicata L, y = 79.81x x x R² = y = x x x R² = Concentration en mg/ml AA% SOX AA% MAC Poly. (AA% SOX) Poly. (AA% MAC) Figure 33: Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait brut du M. spicata L. Figure 34: Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait d acétate d éthyle du M. spicata L Extrait butanolique du M. spicata L. y = x x x R² = y = x x x R² = AA% Mac AA% Sox Poly. (AA% Mac) Poly. (AA% Sox) Concentration en mg/ml Figure 35: Pourcentage d inhibition du DPPH par l extrait butanolique du M. spicata L. 105

133 IC 50 mg/ml Chapitre II : Activité antioxydante des menthes 1.1. Évaluation du pouvoir antioxydant des extraits du M. pulegium L. D après les valeurs des CI50 trouvées, les extraits du M. pulegium L. ont pu réduire le radical libre DPPH (Tableau 11). Ils ont montré une bonne capacité antioxydante comparée à celle du standard (CI50 de l acide ascorbique = 0,051 mg/ml). Tableau. 11: Valeurs de la CI50 des extraits du M. pulegium L. Extrait CI 50 mg/ml Macération Soxhlet Extrait brut 0,845 0,634 Extrait d acétate d éthyle 0,457 0,391 Extrait n-butanolique 0,92 0,83 On remarque que les extraits obtenus par la technique du soxhlet présentent une activité antioxydante plus importante que ceux préparés par macération ainsi l extrait d acétate d éthyle, par les deux techniques d extraction, paraît le plus actif par rapport aux autres extraits avec une valeur de la CI50 de l ordre de 0,457 mg/ml et 0,391 mg/ml par macération ou par soxhlet respectivement. Bencheikh (2012) a trouvé également des résultats similaires dont l extrait d acétate d éthyle de la menthe pouliot algérienne est doté d une activité antioxydante plus élevée (CI50= 0,017 µg/ml) que les extraits brut, chloroformique et aqueux M. pulegium L Mac Sox Extrait brut Extrait d acétate d éthyle Extrait butanolique Acide ascorbique Figure 36 : Valeurs de la CI 50 des différents extraits du M. pulegium D autres travaux ont démontré également que les extraits des plantes ont une forte capacité d agir comme des antioxydants. L extrait méthanolique de la menthe pouliot d Algérie a montré un fort pouvoir antiradicalaire (CI50= 0,051 ± 0,001 mg/ml) par rapport au standard BHT (CI50 = 0,041 ± 0,001 mg/ml) (Khalid-Khodja, 2012). La CI50 de l'extrait aqueux de la menthe pouliot était de 5,5 ± 0,3 µg/ml quant à l'extrait méthanolique était de 6,1 106

134 Chapitre II : Activité antioxydante des menthes ± 0,1 µg/ ml comparable à celle du BHT (4,9 ± 0,2 µg/ml) (Kamkar et al., 2010). Cette activité est considérée comme plus élevée que celle rapportée par Nickavar et al. (2008) sur l'extrait éthanolique (17,92 µg/ml) et Mata et al. (2007) sur l'éthanol (24,9 µg/ml) et l'extrait aqueux (8,9 µg/ml) de M. pulegium L. Selon Mata et al. (2007), les extraits d'éthanol et d'eau présentent de très bonnes activités de piégeage des radicaux. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec l extrait aqueux de la menthe pouliot (CI50= 8,9 ± 0,2 µg/m1). Cette valeur est inférieure à celle du BHT (15,7 ± 0,2 µg/m1). L extrait aqueux de la menthe pouliot était plus actif que celui de l'éthanol. De même, l extrait d eau chaude de la menthe pouliot portugaise a montré une activité antiradicalaire élevée (EC50= 16,3 ± 0,4 g/ml) suivi de l extrait éthanolique et celui d eau froide (Teixeira et al., 2012). L extrait méthanolique de la menthe pouliot d Iran a été évalué pour sa capacité antioxydante par Derakhshani et al. (2012), ils ont déduit qu il présente une efficacité antioxydante importante et que les fleurs sont fortement actives que les feuilles : 2,94 ± 0,05 et 3,35 ± 0,08 mmol Fe/100 g poids frais. Toutefois, Stagos et al. (2012) ont constaté que les extraits aqueux et méthanolique de pennyroyal de la Grèce sont dotés d une activité antiradicalaire modérée par rapport aux autres espèces de lamiacées testées; les valeurs da la CI50 obtenues avoisinant 26 ± 0,6 µg/m1 et 28 ± 0,1µg/m1 respectivement. Vladimir-Knezevic et al. (2014) ont trouvé également que l activité antiradicalaire de l extrait éthanolique de la menthe pouliot de la Croatie est modérée par rapport aux autres lamiacées testées (CI50= 24,27 ± 0,21 µg/ml par rapport à la CI50 du standard de référence Trolox= 1,99 ± 0,03µg/ml). Même degré d activité a été observé pour l extrait méthanolique de la menthe pouliot tunisienne mais avec une valeur de la CI50 plus élevée 48µg/ml (Hajlaoui et al., 2009) Évaluation du pouvoir antioxydant des extraits de M. spicata L. Les résultats de l essai de DPPH ont indiqué que M. spicata possède une activité antiradicalaire notable. Les valeurs trouvées da la CI50 des extraits sont comparables à celle de l acide ascorbique (Figure 37). 107

135 CI 50 mg/ml M. spicata L Chapitre II : Activité antioxydante des menthes Extrait brut Extrait d acétate d éthyle Extrait butanolique Acide ascorbique Mac Sox Figure 37: Valeurs de la CI 50 de différents extraits du M. Spiata L. Ce sont les fractions n-butanoliques obtenues par macération et par soxhlet qui ont enregistré les plus basses concentrations inhibitrices (CI50); elles sont de 0,112 et 0,121 respectivement (Tableau 12). Quant à la fraction d acétate d éthyle obtenue par soxhlet est venue en second lieu avec une CI50 égale à 0,160 mg/ml alors que celle obtenue par macération a enregistré la plus faible activité antioxydante (CI50=1,712 mg/ml). En revanche, la fraction d acétate d éthyle du M. spicata L. en provenance de l Inde est dotée d une activité antioxydante (95%) plus élevée que celles d hexane (18%) et du chloroforme (22%) suivie de la fraction aqueuse (84%) (Arumugam et al., 2006). Tableau 12 : Valeurs da la CI 50 des extraits du M. spicata L. Extrait CI 50 mg/ml Macération Soxhlet Extrait brut 0,385 0,241 Extrait d acétate d éthyle 1,712 0,160 Extrait n-butanolique 0,121 0,112 Des travaux réalisés pour la détermination de l activité antiradicalaire du M. spicata L. ont montré que cette espèce présente un potentiel antioxydant remarquable mais d autres ont constaté qu elle a une activité modérée ou faible. Mata et al. (2007) ont trouvé que l extrait aqueux s avère fortement plus actif avec une CI50= 5,7 ± 0,4 µg/ml inférieure à celle du standard BHT (15,7 µg/ml). En outre, Barchan et al. (2014) ont constaté que l activité de l extrait aqueux de la menthe verte du Nord Marocain atteint 90,32% approximativement égale à celle du BHT (90,61%) quant à celle de l extrait méthanolique était de 89,38%. Naidu et al. (2012) et Kanatt et al. (2007) ont également rapporté que l extrait méthanolique de la menthe verte de Malaisie et celle de l Inde ont eu une activité antiradicalaire importante avec 108

136 Chapitre II : Activité antioxydante des menthes une CI50 environ 25,2 µg/ml (CI50 de l acide ascorbique= 18 µg/ml) et 25,8 µg/ml (CI50 du BHT= 10,1 µg/ml) respectivement. Cependant, Moldovan et al. (2014) ont trouvé que l extrait éthanolique s est montré modérément actif dont la valeur de la CI50= 151,05 ± 1,95 μg/ml par rapport au standard Trolox (12 ± 0,54 μg/ml). De même, l extrait éthanolique de la menthe verte iranienne a enregistré la plus faible activité de piégeage du radical DPPH (CI50= 87,89 μg/ml) parmi les cinq menthes testées (Nickavar et al., 2008) Discussion La plupart des genres de Lamiacées sont riches en terpènes et ils contiennent également une quantité considérable de différents glycosides, des flavonoïdes et des acides phénoliques tels que l'acide rosmarinique et d'autres composés phénoliques (Valant-Vetschera et al., 2003; Naghibi et al., 2005). Dans la présente étude, les espèces de Lamiaceae sélectionnées ont montré une variation significative de la teneur en composés phénoliques et du potentiel antioxydant et ceci est en accord avec des études antérieures sur les propriétés antioxydantes de certaines plantes Lamiacées (Zheng et al., 2001; Ozgen et al., 2006; Nickavar et al., 2008). Nos résultats sur l activité antioxydante des extraits de menthes indiquent que chaque espèce a réagi différemment vis-à-vis du radical libre DPPH et selon le solvant d extraction. La fraction d acétate d éthyle du M. pulegium L. (Tableau 13) et celle de n-butanol du M. spicata L. (Tableau 14) qui ont enregistré la plus forte activité antiradicalaire. Par ailleurs, selon les rendements des extraits ainsi les teneurs en composés phénoliques obtenus, il parait que la technique d extraction par soxhlet était la plus efficace par rapport à la macération. Même résultat a été obtenu par Bimakr et al. (2011), les rendements d extraction par soxhlet et les teneurs en flavonoïdes étaient plus importants que ceux issus de la méthode de dioxyde de carbone supercritique. Tableau 13: Teneurs en polyphénols et en flavonoïdes et Valeurs de la CI 50 des extraits du M. pulegium L Extraits du M. pulegium L. Macération (µg/ml) Soxhlet (µg/ml) CI 50 PhC Flav CI 50 PhC Flav Extrait brut 0,845 7,23 3,21 0,634 14,24 14,12 Extrait d acétate d éthyle 0,457 9,70 7,53 0,391 9,66 20,53 Extrait n-butanolique 0,92 4,88 4,63 0,83 11,88 12,50 109

137 Chapitre II : Activité antioxydante des menthes Tableau 14: Teneurs en polyphénols et en flavonoïdes et Valeurs de la CI 50 des extraits du M. spicata Macération (µg/ml) Soxhlet (µg/ml) Extraits du M. spicata L. CI 50 PhC Flav CI 50 PhC Flav Extrait brut 0,385 5,98 3,54 0,241 15,44 9,1 Extrait d acétate d éthyle 1,712 0,52 0,01 0,160 16,11 14,85 Extrait n-butanolique 0,121 4,38 9,91 0,112 7,11 5,01 Les plus forts pourcentages d inhibition du DPPH enregistrés pour M. pulegium et M. spicata L. sont 81,57% et 86,22% respectivement comparables à celui de l acide ascorbique 90%. Il est difficile de comparer l activité antioxydante de ces deux menthes voire l interaction de plusieurs paramètres: l effet du solvant, la technique d extraction, l organe testé et l espèce elle-même. Tout de même, d après les données de la littérature sur l'activité antioxydante des espèces de Mentha, sont souvent difficiles à comparer en raison des différences dans la méthodologie (Moldovan et al., 2012). Certains de nos résultats étaient généralement similaires à ceux obtenus pour M. pulegium ou M. spicata. Les plus faibles valeurs de la CI50 ont été marquées généralement pour M. spicata L. et M. pulegium L. successivement. Par contre, Ahmad et al. (2012) ont révélé que l extrait méthanolique du M. pulegium L. (75%) était plus actif par comparaison à celui de et M. spicata L. (71%). D autre part, l extrait méthanolique du M. pulegium a montré un potentiel antioxydant plus important que celui du M. spicata L. (Derakhshani et al., 2012). Quant à l extrait éthanolique du M. pulegium L. s est montré plus efficace que celui du M. spicata L. (Nickavar et al., 2008). Des résultats similaires ont été rapportés par Mata et al. (2007) dont l extrait éthanolique de M. pulegium a eu une activité antiradicalaire plus élevée que celui de M. spicata L. Par contre, l extrait aqueux du M. spicata L. qui s est avéré plus actif que celui de M. pulegium L. alors que Moldovan et al. (2012) ont trouvé que l extrait aqueux de M. spicata L. est doté d une activité antioxydante moins forte que les autres menthes testées. Notons que les teneurs en polyphénols et en flavonoïdes les plus élevées des extraits ont été observées pour ceux qui ont montré une activité antiradicalaire importante: l extrait d acétate d éthyle de M. pulegium (L.) et celui de n-butanol de M. spicata L. Par conséquent, cette activité pourrait être attribuée à l abondance des composés phénoliques dans ces extraits. Une corrélation positive a été trouvée entre la teneur en polyphénols et le degré d activité antioxydante. Les coefficients de corrélation (r 2 ) obtenus sont: 0,877 (M. pulegium) et 0,815 (M. spicata) pour les extraits issus de la macération. Hormis ceux qui ont une forte activité, 110

138 Chapitre II : Activité antioxydante des menthes les fractions extraites par soxhlet ont manifesté quelques hétérogénéités entre le contenu en polyphénols et l activité antiradicalaire (r 2 < 0,3). Cette hétérogénéité peut-être due aux composés phénoliques qui renferment une différente capacité antioxydante (Zheng et al., 2001) ou bien à d autres composés qui ne sont pas phénoliques et qui sont responsables en partie de cette activité (Nickavar et al., 2008). De nombreux chercheurs ont rapporté une corrélation positive entre l'activité de piégeage des radicaux libres et le contenu en composés phénoliques (Zheng et al., 2001; Luximon et al., 2002; Kanatt et al., 2007; Khaled-Khodja et al., 2010; Derakhshani et al., 2012). Romero- Jimenez et al. (2005) ont indiqué que le niveau d'activité antioxydante était fortement associé à la teneur en composés phénoliques des extraits. Par ailleurs, Barchan et al. (2014) ont constaté également que l'activité antioxydante est bien corrélée avec le contenu phénolique (r 2 = 0,88 et 0,66 pour M. spicata et M. pulegium respectivement). De même, Mata et al. (2007) ont déduit que le potentiel antioxydant des menthes dépend grandement de la présence de composés phénoliques. Les principaux constituants phénoliques des menthes sont des dérivés de l'acide caféique, en particulier l acide rosmarinique et les flavonoïdes, y compris les flavones, flavanones et leurs formes glycosidiques. 2. Étude de l activité antioxydante des HE de menthes L activité antioxydante in-vitro des HE des menthes a été également évaluée par le test du piégeage du radical libre DPPH. Il semble que le pourcentage d inhibition du DPPH augmente avec l augmentation de la concentration soit pour l acide ascorbique en tant que standard de référence (Figure 38) ou pour les trois HE de menthes (Figures 39, 40 et 41). Ainsi, les pourcentages d inhibition du radical libre pour les trois HE sont élevés mais inférieurs à celui de l acide ascorbique pour toutes les concentrations utilisées. Ils sont de 82; 73 et 70% pour les HE de la menthe pouliot, de la menthe odorante et de la menthe verte respectivement. 111

139 Pourcentage d'inhibition % fi Pourcetage d'inhibition % Pourcentage d'inhibition % Pourcentage d'inhibition % Chapitre II : Activité antioxydante des menthes Acide ascorbique y = 0,000x 3-0,061x2 + 3,227x + 26,22 R² = 0,988 Poly. (AA% ac ascorb) Concentration en mg/ml Figure 38: Pourcentage d inhibition du DPPH en fonction des concentrations de l acide ascorbique HE du M. pulegium HE dum. suaveolens y = x x x R² = y = x x x R² = %AA MO Poly. (%AA MO) Concentration en mg/ml Concentration en mg/ml Figure 39 : Pourcentage d inhibition de DPPH par l HE du M. pulegium L. Figure 40 : Pourcentage d inhibition de DPPH par l HE du M. suaveolens Ehrh HE du M. spicata y = 0.001x x x R² = Concentration en mg/ml Poly. (%AA MV) Figure 41 : Pourcentage d inhibition de DPPH par l HE du M. spicata L. Les valeurs de la CI50 calculées des HE des M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh.et M. spicata L. ainsi de celle du standard de référence sont regroupées dans la figure. (42). D après 112

140 C I50 mg/ml Chapitre II : Activité antioxydante des menthes ces résultats, les trois HE testées ont manifesté une activité antiradicalaire importante par rapport à celle de l acide ascorbique (CI50 de l acide ascorbique = 8,849 mg/ml). Le degré de cette activité décroît comme suit : l acide ascorbique > HE de M. pulegium> HE de M. suaveolens> HE de M. spicata M. spicata L. M. suaveolens M. pulegium Acide ascorbique Figure 42 : Valeurs de la CI 50 des menthes et du standard de référence 2.1. Évaluation de l activité antioxydante de l HE du M. pulegium L. Les travaux antérieurs sur l activité antioxydante ont permis de révéler une variation dans la réaction des huiles essentielles de même espèce vis-à-vis du DPPH. Hajlaoui et al. (2009) et Proestos et al. (2013) ont également montré que l HE de la menthe pouliot possède une capacité antiradicalaire importante dont la CI50=10 µg/ml et 13,5 ± 0,5 µg/ml respectivement. Cependant, les HE de la menthe pouliot, étudiées par Kamkar et al. (2010) et Texeira et al. (2012), ont présenté une faible activité antioxydante avec des EC50 environ 147,36 mg/ml (BHT = 0,0049 mg/ml) et 6,2 ± 0,2 mg/ml respectivement; ceci est expliqué par un manque d antioxydants dans cette huile. Pour Mata et al. (2007), cette HE n a manifesté aucune potentialité pour piéger le DDPH ; ceci est peut-être dû à sa faible solubilité sous les conditions du test Évaluation de l activité antioxydante de l HE du M. suaveolens Ehrh. La meilleure inhibition de DPPH a été enregistrée par l HE du M. suaveolens (Ehrh.) après celle de la menthe pouliot, avec une valeur de la CI50 de 16,32 mg/ml. Peu nombreux les travaux qui ont traité le potentiel antioxydant de l HE de la menthe à feuilles rondes. L'HE de cette espèce a été testée par El-Kakhoury et al. (2012), ils ont 113

141 Chapitre II : Activité antioxydante des menthes constaté qu elle a exercé une puissante activité antioxydante in-vivo (95,8% par rapport à la vitamine E) et un potentiel antiradicalaire modéré in-vitro dont la valeur de CI50 est de 200 µg/ml par rapport à l'acide ascorbique (7,5 µg/ml). Récemment, Kasrati et al. (2014) et Al- Ansary et al. (2014) ont trouvé que l HE du M. Suaveolens a manifesté également une activité antioxydante modérée Évaluation de l activité antioxydante de l HE du M. spicata L. D après les valeurs de CI50, l HE de la menthe verte a eu aussi une activité antiradicalaire mais moins importante que celle des autres huiles testées. Des études antérieures ont confirmé les résultats obtenus. Trois HE de la menthe verte de différentes régions de la Tunisie ont été évaluées par Snoussi et al. (2015) ; ils ont obtenu une valeur de CI50 de 3 µg/ml par comparaison avec 11,5 µg/ml pourle standard BHT alors que celle trouvée par Dhifi et al. (2013) était d'environ 10 µg/ml. Quant à Mkaddem et al. (2009) ont déduit que la CI50 était de 3476,3 mg/l par rapport à celle de la vitamine C (4,4 ± 0,2 mg/l). De même, Martins et al. (2012) ont rapporté que l essence du Portugal a montré une activité antioxydante vis-à-vis de DPPH (31,45%) par contre celle de même origine étudiée par Mata et al. (2007) n a révélé aucune activité antioxydante. Une étude récente, sur la même espèce originaire de l Algérie, menée par Laghouiter et al. (2015), a montré qu elle est dotée d un potentiel important pour réduire le radical DPPH dont la CI50 avoisine 208,495 ± 4,247 µg/ml. D'après cette étude de l'activité antioxydante, on remarque que la capacité d'éliminer le radical DPPH par nos huiles est plus importante. Ceci est expliqué par leur forte capacité d'agir comme des donneurs d'électrons. Cette activité biologique intéressante peut être attribuée à la composition chimique des HE. L'efficacité antioxydante dans les plantes a été signalée être principalement due aux composés phénoliques qui pourraient jouer un rôle important dans l'inhibition de l'auto-oxydation des huiles (Ramarathnam et al., 1986; Ruberto et al., 2000). En conséquence, Les essences de menthes testées sont riches en monoterpènes et sesquiterpènes oxygénés tels que la pulégone, le thymol et le carvacrol pour l HE de la menthe pouliot; la carvone et le limonène pour la menthe verte et enfin, l oxyde de piperitenone pour l HE de la menthe odorante en plus d autres composés qui se trouvent en quantités moins élevées mais ils ont prouvé également leur contribution à l activité antioxydante comme le β-pinène, le ɤ-terpinène, l α-terpinéol et le spathulénol (Martins et al., 2012; Snoussi et al., 2015; Sharapov et al, 2015). 114

142 Chapitre II : Activité antioxydante des menthes Le plus fort potentiel antioxydant de l HE du M. pulegium par rapport aux autres HE, comme indiqué dans de nombreuses espèces de menthes (Mimica-Dukic et al., 2003; Teixeira et al., 2012), peut être justifié par la forte teneur en pulégone et la présence des composés phénoliques tels que le thymol et le carvacrol qui sont principalement responsables du fort potentiel antioxydant d'huiles qui les contiennent (Tepe et al.,2005; Sharapov et al., 2015). IV. Conclusion Cette étude a eu pour but d évaluer et de comparer l efficacité antioxydante des extraits et des huiles essentielles des M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh. et M. spicata L. Les extraits qui ont présenté les fortes teneurs en polyphénols et en flavonoïdes ont manifesté un important potentiel antioxydant comparable à celui du standard de référence. Les trois essences ont également montré une activité antioxydante importante. Nos résultats indiquent que les extraits et les HE de ces menthes pourraient être alternatifs aux antioxydants synthétiques et utilisés dans les domaines: agroalimentaire et pharmaco-médical. 115

143 Chapitre. III Activité antibactérienne des HE et des hydrolats des M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh., et M. spicata L.

144 Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes I. Introduction L intérêt accroît ces dernières décennies pour la recherche des produits naturels et des composés actifs qui pourraient être une alternative à l'emploi des antibiotiques. Plusieurs travaux ont mis l'accent sur les propriétés antimicrobiennes des extraits végétaux et particulièrement des HE (Teixeira et al., 2012). Dans la littérature, les HE les plus étudiées pour leurs propriétés antibactériennes appartiennent aux Lamiacées, les menthes en font partie. De nombreuses HE de Mentha ont prouvé leur activité antimicrobienne contre les micro-organismes pathogènes dans différentes parties du monde (Iscan et al., 2002; Mahboubi et al., 2008; Hajlaoui et al., 2009). L'efficacité antimicrobienne des HE du Mentha a été trouvée modérée ou importante en corrélation souvent avec leur composition chimique (Mimica-Dukic et al., 2003; Mahboubi et al., 2008; Sutour et al., 2010; Shahmohammadi et al., 2011; Hassan et al., 2012; Seladji et al., 2014). Quant aux hydrolats, ils n ont pas bénéficié du même intérêt. Certains auteurs (Sadgic et al., 2003; Sutour et al., 2010; Verma et al., 2011) se sont intéressés à l évaluation du pouvoir antibactérien des hydrolats de quelques plantes mais les travaux menés sur celui de menthes restent encore rares. Au Maroc, à notre connaissance, jusqu à maintenant, le pouvoir antibactérien des hydrolats n a pas fait l objet d aucune recherche antérieure. Pour complémenter ces études, le présent travail a eu pour objectif d évaluer les propriétés antibactériennes des HE et des hydrolats des M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh., et M. spicata L., utilisées en médecine traditionnelle pour le traitement de diverses infections, sur la croissance des souches bactériennes multi-résistantes in-vitro. II. Matériels et méthodes 1. Choix des souches bactériennes Pour évaluer l activité antibactérienne de nos HE et hydrolats, nous avons utilisé six souches bactériennes collectées de l hôpital régional de Meknès (Hôpital Mohammed V) à partir du prélèvement de différentes natures : une bactérie à Gram positif: Staphylococcus aureus et cinq à Gram négatif: Escherichia coli BLSE, Escherichia coli (sauvage), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, et Proteus mirabilis. 116

145 Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes 2. Détermination de l activité antibactérienne des HE par la méthode de diffusion sur disque sur milieu solide Nous avons utilisé le milieu de culture Mueller Hinton Agar (MHA) préparé à partir de 40 g de poudre dans 1000 ml de l eau distillée; Chauffé et agité afin d obtenir un milieu complètement dissolu. Après stérilisation à l autoclave à 121 C pendant 15 min, nous l avons laissé refroidir puis le fait couler dans des boites de Pétri en plastiques stériles. La suspension bactérienne (10 8 UFC/ml) inoculée sur la surface du milieu de culture (MHA) dans une boîte de Pétri avec un coton-tige. Les disques de papier filtre (6 mm de diamètre) chargés de 5 μl, 10 μl, 15 μl et 20 μl de l'he et d hydrolat purs sont placés dans les boîtes de Pétri inoculées et l antibiotique disque (gentamicine 10 meg) est déposé en tant que témoin positif. Un disque contenant du sérum physiologique est utilisé comme témoin négatif. L'incubation est effectuée pendant 24 heures à 37 C. Les zones d'inhibition autour des disques ont été mesurées en utilisant une règle transparente (en mm). 3. Détermination de l activité antibactérienne des HE sur milieu liquide La méthode de macrodilution en milieu liquide a été utilisée pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et les concentrations minimales bactéricides (MBC) d'he et d hydrolats (Figure 43). Pour la solution de diméthylsulfoxyde (DMSO), nous avons ajouté une quantité d'he 60/40 (DMSO/HE: v/v) pour obtenir une solution mère homogène. De la solution mère, nous avons sélectionné des volumes spécifiques pour avoir des concentrations finales environ 0,15; 0,30; 0,60; 1,20; 2,40; 4,80; 9,60; 19,20; 38,40; 76,80 (µl/ml) qui ont été ajoutés de manière aseptique dans une série de tubes à essai contenant un volume de Mueller-Hinton stérile en ml. Chaque tube de l'ensemble, contenant 3,96 ml de la solution d'essai (milieu bouillon + HE), a été ensemencé avec 40 µl d inoculum normalisé (10 8 UFC/ml). Pour les hydrolats, nous avons procédé de la même manière mais sans ajouter du DMSO. Les concentrations appliquées sont: 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256 et 512 µl/ml. Cet inoculum a été obtenu sous la forme d'une suspension dans une solution saline stérile solution (NaCl à 0,9%). Le volume final de la solution dans chaque tube est égal à 4 ml. Après une incubation de 18 à 24 heures à 37 C, les valeurs des CMI des HE sont déterminées. La CMI correspond à la concentration du premier tube dans lequel il n'y a pas de croissance du germe 117

146 Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes visible à l'oeil nu. Nous avons ensemencé par la suite la surface de gélose (MHA) avec 100 µl du contenu des tubes ayant une concentration supérieure ou égale à la CMI pour déterminer la CMB. Celle-ci est la concentration la plus faible qui inhibe totalement la croissance bactérienne dans les 24 heures. Figure 43 : Tests pour la détermination de la CMI et la CMB des HE des menthes III. Résultats et Discussion 1. Evaluation de l activité antibactérienne des HE des menthes étudiées L activité antibactérienne in-vitro des HE des M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh. et M. spicata L. vis-à-vis des bactéries à Gram positif et à Gram négatif a été évaluée qualitativement et quantitativement à partir des diamètres des zones d inhibition et des valeurs des CMI et CMB. Les diamètres des zones d inhibition formées par ces huiles indiquent qu elles présentaient une activité considérable contre les bactéries enquêtées (Tableau 15). Les souches du S. aureus (25,4-29 mm) est la plus sensible aux HE de menthes suivie d'e. Coli sauvage (14-19,8 mm), Pr. mirabilis (9-12,2 mm) puis d E. Coli BLSE (9-10 mm). Par ailleurs, l HE du M. spicata a eu généralement l activité antibactérienne la plus active suivie de celle du M. pulegium (L.) puis celle du M. suaveolens (Ehrh.). Cependant, elles n ont aucun effet sur les souches du Ps. putida et du Ps. aeruginosa. Cette dernière a prouvé sa résistance à toutes les HE de menthes évaluées par certains chercheurs (Kizil et al., 2010; Boukhebti et al., 2011; Bensabah et al., 2013 et Brahmi et al., 2016). 118

147 Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes Tableau 15: Zones d inhibition des bactéries traitées par les HE de menthes Diamètre de la zone d inhibition (mm) Bactérie M. pulegium M. suaveolens M.spicata Gentamicyne Escherichia coli BLSE Pseudomonas putida Escherichia coli (sauvage) 19, Proteus mirabilis ,2 13 Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Tableau 16 : Valeurs des CMI/CMB des HE de menthes vis-à-vis des bactéries testées Bactérie Concentration en µl/ml M. pulegium L. M. suaveolens Ehrh. M. spicata L. CMI CMB CMI CMB CMI CMB Escherichia coli BLSE 4,80 19,20 9,60 > 76,80 1,20 76,80 Escherichia coli (sauvage) 1,20 38,40 19,20 76,80 0,30 38,40 Proteus mirabilis 4,80 76,80 9,60 > 76,80 0,60 76,80 Staphylococcus aureus 9,60 19,20 19,20 38,40 0,30 19,20 Les concentrations minimales inhibitrices obtenues varient selon l espèce testée et le microorganisme traité. Elles sont comprises entre 0,30 et 1,2 µl/ml pour l HE du M. spicata L., entre 1,20 et 9,60 µl/ml pour celles du M. pulegium tandis que celles du M. suaveolens, elles présentent des concentrations élevées qui oscillent entre 9,60 et 19,20 µl/ml (Tableau 16). Par ailleurs, ces bactéries ont été tuées à des concentrations allant de 19,20 et 76,80 µl/ml pour M. pulegium L., de 19,20 et 76,80 µl/ml pour celle du M. spicata L. et de 38,40 et 76,80 µl/ml pour M. suaveolens Ehrh. Silva et al. (2015), dans leur étude sur l activité antibactérienne des HE des M. spicata et M. pulegium vis-à-vis de certaines bactéries, ont rapporté que ces HE ont présenté des CMI similaires de 62,5 µl/ml pour E. Coli, tandis que l HE du M. pulegium L. a été plus efficace contre les souches de S. aureus avec une CMI de 15,6 µl/ml plus importante que celle du M. spicata L. (62,5 µl/ml). De même, Boukhebti et al. (2011) ont constaté que ces HE ont eu un pouvoir antibactérien contre E. Coli et les espèces de Staphylococcus et Streptococcus à une concentration de 20%. Bien que nos essences n aient été pas efficaces contre les souches du P. putida, celle du M. pulegium (L.) du Portugal a eu un effet inhibiteur avec une valeur de CMI égale à 1,2 mg/ml. D autres études sur l évaluation de l activité antibactérienne des HE des menthes ont 119

148 Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes montré également leur efficacité contre plusieurs microorganismes. Des résultats conformes aux nôtres ont été déduits récemment par Brahmi et al. (2016) dont l HE du M. spicata, originaire de l Algérie, a exercé un effet inhibiteur sur les souches du S. aureus (14,3 ± 1,5 mm) et E. Coli (11,0 ± 1mm) et d autres espèces de bactéries. Nos résultats s accordent également avec ceux trouvés par Bensabah et al. (2013), l HE du M. spicata du Nord Marocain possède une bonne activité antimicrobienne contre S. aureus (15-19 mm) et E. Coli (12,33-13,66 mm). De même pour l essence du Pakistan avec des zones d'inhibition (ZI) de 12 à 29 mm contre des souches bactériennes et particulièrement contre S.aureus (24-25 mm) et E. Coli (12-14 mm) (Hussain et al., 2010). En outre, Kizil et al. (2010) ont prouvé l efficacité de cette essence vis-à-vis d une large gamme de micro-organismes y compris E. Coli et S. aureus. Comme nous l avons déjà signalé auparavant, l'he du M. pulegium était très efficace pour inhiber la croissance de la majorité des bactéries testées. Ceci concorde avec l étude de Marzouk et al. (2008) dont les souches du S. aureus et d E. Coli étaient sensibles aux HE extraites à partir des feuilles de la menthe pouliot tunisienne avec des CMI allant de 1,25 à 1,6 µl/ml pour S. aureus et de 1,6 à 1,8 µl/ml pour E. coli; mais à l opposé de notre étude et de celles réalisées par Hajlaoui et al. (2009), Boukhebti et al. (2011), Ait-Ouazzou et al. (2012) et Silva et al. (2015), cette HE a eu un effet inhibiteur sur Ps. Aeruginosa dont la CMI est de 2,5 µl/ml. L étude réalisée au Maroc par Ait-Ouazzou et al. (2012) a révélé que l essence, originaire de la région de Taourirt, était efficace contre plusieurs souches bactériennes y compris S. aureus dont la ZI est de 21,4±0,8 mm et la CMI observée est de 1 µl/ml. L HE de la menthe pouliot étudiée par Mahboubi et al. (2008) a exercé une action inhibitrice sur S. aureus (ZI= 21 mm; CMI= 0,5 µl/ml) mais avec un faible effet sur E. Coli (ZI= 0 mm; CMI= 4 µl/ml). Mêmes résultats ont été signalés par Hajlaoui et al. (2009) dont les valeurs de ZI pour S. aureus et E. Coli sont de 10,66 ± 1,15 mm et 13,66 ± 0,57 mm, et de CMI= 1,25 et 2,5 mg/ml respectivement. L effet inhibiteur de l HE de la menthe pouliot vis-à-vis de P. mirabilis a été observé également par Zanjani et al. (2015) dont la ZI= 15,24 ± 0,37 mm et la CMI = 1,25%. L HE de la menthe à feuilles rondes, évaluée dans cette étude, est caractérisée par la variabilité de son activité vis-à-vis des microorganismes testés. Son effet inhibiteur fort est marqué contre S. aureus (ZI= 25,4 mm) alors qu il était modéré contre E. Coli sauvage (ZI= 14 mm) et P. mirabilis (ZI= 9 mm). Par contre, cette essence n a pas eu d effet sur Ps. aeruginosa, Ps. putida et E. Coli BLSE. Nos résultats sont en accord avec les conclusions de Moussaoui et al. (2013) qui ont rapporté que l HE de la menthe odorante, collectée au Nord 120

149 Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes du Maroc, a manifesté une faible activité antibactérienne contre E. Coli (ZI= 6 mm; CMI et CMB= 0,5%) alors qu elle était modérément active contre d autres souches comme Salmonella. les résultats du test de diffusion mené par Petretto et al. (2014) indiquent que l HE du M. suaveolens présentait un très faible potentiel antibactérien contre toutes les bactéries testées à l exception du L. lactis subsp., lactis et S. xylosus avec des diamètres de ZI de 10,45 ± 0,9 et 10,35 ± 0,2 mm, respectivement. En outre, l essence du M. suaveolens ssp insularis, testée par Sutour et al. (2008) sur 11 bactéries, a montré son effet inhibiteur seulement contre S. aureus (ZI= 18 mm) et B. cereus (ZI= 16 mm). En revanche, Oumzil et al. (2002) ont rapporté que les HE du M. suaveolens, issues d autres régions du Maroc, sont dotées d un pouvoir antibactérien important contre un large spectre de bactéries dont les CMI obtenues sont inférieure, ou égales à 1,38 ppm. Une autre étude réalisée au Maroc par Kasrati et al. (2013) a révélé que les HE du M. suaveolens présentaient une activité antibactérienne importante dont les valeurs de CMI sont entre 0,93 et 2,33 mg/ml). La bactérie à Gram positif testée (S. aureus) semble être plus sensible aux HE de menthes que celles à Gram négatif. Cependant, l'activité antibactérienne faible ou modérée, contre les bactéries à Gram négatif observée dans cette étude, est en accord avec d'autres travaux de Cantore et al. (2004) et Moussaoui et al. (2013). Ce phénomène a été attribué à la possession de ces bactéries à des chaînes de polysaccharides hydrophiles constituant une barrière aux HE hydrophobes (Inouye et al., 2001). Les propriétés antimicrobiennes des HE de plusieurs plantes aromatiques et médicinales ont été attribuées à leur profil chimique et surtout aux alcools terpéniques (Satrani et al., 2006; Hassan et al., 2012). Les HE des trois menthes ont montré une moyenne ou une bonne activité antibactérienne; ceci est prouvé également dans la littérature sur des HE de certaines Lamiacées (Mimica-Dukic et al., 2003; Delamire et al., 2007). Cette activité pourrait être attribuée aux composés des HE et particulièrement aux monoterpènes. En plus, les composés phénoliques sont signalés avoir un niveau élevé d activité antibactérienne (Sivropoulou et al., 1995). D après Tepe et al. (2005), les composés phénoliques des HE montrent la plus forte activité antibactérienne, suivis d'aldéhydes, de cétones et d'alcools. Le degré élevé d activité de l HE du M. spicata et du M. pulegium (L.) est dû aux teneurs importantes en carvone et trans-carvéol, et en pulégone et piperiténone respectivement sans oublier l effet synergique des autres constituants. Ces composés ont prouvé leur fort potentiel antibactérien dans des recherches antérieures (Oumzil et al., 2002; Sutour et al., 2008; Moussaoui et al., 2013). Bader et al., (2003) ont trouvé que la carvone présentait une meilleure activité antimicrobienne que l'huile entière. La pipéritone et la pipéritenone, principaux composés de 121

150 Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes l HE du M. pulegium (71,1%) étudiée par Mahboubi et al. (2008), ont présenté une activité antibactérienne remarquable contre les bactéries à Gram positif que celles à Gram négatif. D'autre part, l HE de la menthe odorante était principalement caractérisée par l abondance de l'oxyde de pipéritenone considérée ayant une faible activité antibactérienne en raison de la présence d'un époxyde entre C1 et C2 (Oumzil et al., 2002). Cependant, cette essence a montré la même CMB contre certaines bactéries que les autres HE. Ce résultat souligne en particulier l'importance du rôle des composants mineurs (Cimanga et al., 2002). Le mécanisme de l'action inhibitrice de l'he sur les micro-organismes n est pas bien compris. Pour l'instant, il y a un nombre limité d'études décrivant le mode d'action de nombreuses HE. L'activité antimicrobienne des HE peut être expliquée par le caractère lipophile des monoterpènes qui s'y trouvent. Les monoterpènes agissent en perturbant la membrane cytoplasmique microbienne, qui perd ainsi son imperméabilité élevée pour les protons et les ions plus grands; si la perturbation de l'intégrité de la membrane se produit, ses fonctions sont compromises non seulement comme une barrière, mais également en tant que matrice pour les enzymes et en tant que transducteur d'énergie. Cependant, les mécanismes spécifiques impliqués dans l'action antimicrobienne des monoterpènes restent mal caractérisés (Stringaro et al., 2014). 2. Evaluation de l activité antibactérienne des hydrolats de menthes Les trois hydrolats des menthes ont été évalués pour leur pouvoir inhibiteur vis-à-vis des mêmes microorganismes que les HE (Tableau 17).Toutes les bactéries testées ont manifesté leur résistance aux hydrolats à l exception des souches du S. aureus. En effet, l hydrolat du M. pulegium L. a révélé un pouvoir antibactérien important avec un diamètre de ZI de 35 mm et une CMI avoisinant 256 µl/ml suivi du M. spicata L. (ZI=30 mm/cmi= 256 µl/ml) puis M. suaveolens Ehrh. (10 mm / CMI>512 µl/ml). Hormis l hydrolat du M. suaveolens Ehrh., Les diamètres des ZI observés pour les hydrolats de la menthe pouliot et de la menthe verte sont supérieurs à ceux obtenus par les HE de mêmes espèces. De même, Sutour et al. (2008) ont conclu que l hydrolat du M. suaveolens de la Corse s est montré plus actif à l égard du S. aureus (ZI= 20 mm) que l HE de la même espèce (ZI= 18 mm). Quant à l hydrolat du M. spicata L., étudié par Verma et al. (2011), est doté d une activité faible à modérée contre les bactéries testées dont le diamètre de la ZI des souches d E. coli a atteint 6mm alors qu il n a pas pu inhiber la croissance du Ps. Aeruginosa. En revanche, l hydrolat du M. spicata L. de la Turquie, testé par Sadgic et Ozgan (2003), n a eu aucun effet sur les souches des S. aureus et E. coli; alors qu ils étaient sensibles aux hydrolats d Origanum vulgare et de Satureja 122

151 Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes hortensis par contre ils étaient résistants à l hydrolat de Rosadamascena et des espècesde Lavandula étudiées par Ulusoy et al. (2009) et Moon et al. (2006) respectivement.par ailleurs, les hydrolats d O. basilium, T. schimperi, E. cardamaon, C. zeylanicum, B. nigra et S. aromaticum ont montré leur pouvoir antibactérien avec des pourcentages d inhibition compris entre 20 à 100% pour S. aureus, 10 à 100% pour E. coli et entre 0 à 35% pour Ps. Aeruginosa (Hussein et al., 2011). Tableau 17: Zones d inhibition des bactéries traitées par les hydrolats de menthes Diamètre de zone d inhibition en mm / CMI (µl/ml) Hydrolat E. coli Ps. putida E. coli P. mirabilis Ps. aeruginosa S.aureus BLSE (sauvage) M. pulegium / 256 M. suaveolens / 512 M. spicata / 256 Comme pour les HE, l action antimicrobienne des hydrolats testés s explique par leur richesse en composés solubles tels que les alcools terpéniques et les phénols (Prates et al., 1998; Inouye et al., 2001; Suschke et al., 2006). En outre, le fort pouvoir inhibiteur des hydrolats contre les souches du S. aureus est dû essentiellement à leurs principaux constituants: carvacrol (39,37%), pulégone (2,32%) et thujones (1,17%) pour M. pulegium, et 1,8-cinéole (22,85%), camphre (13,53%) et carvacrol (3,65%) pour M. spicata. Ces composés sont dotés d un grand pouvoir antibactérien (Senatore et al., 2004; Moussaoui et al., 2013) en plus du phénomène de synergie qui peut survenir entre les constituants volatils car les interactions synergiques entre les différents composés peuvent être l origine d une activité beaucoup plus prononcée que celle prévisible pour les composés majoritaires (Thomson et al., 2003; Zhiri et al., 2005; Viuda-Martos et al., 2008). L activité modérée de l hydrolat du M. suaveolens constatée par rapport à l HE de la même espèce contre S. aureus peut être due à la composition particulière de cet hydrolat pauvre en monoterpènes oxygénés et dont l oxyde de pipéritenone, connu par son faible pouvoir inhibiteur, constitue 69,32% du total de la composition. D autre part, la résistance des bactéries Gram étudiées est attribuée à leur membrane externe hydrophile qui peut bloquer la pénétration de composés hydrophobes dans la membrane cellulaire cible. L action relative des thujones et 1,8-cinéole (présents dans les hydrolats du M. pulegium et du M. spicata) a été associée à leur basse hydrosolubilité et la capacité de former des liaisons hydrogènes, ce qui limite leur entrée dans les Gram qui possèdent des voies hydrophobes inopérants dans la membrane externe (Faleiro, 2003). 123

152 IV. Conclusion Chapitre. III: Activité antibactérienne des menthes L'activité antimicrobienne des HE des M. pulegium, M. suaveolens et M. Spicata a été prouvée. Les concentrations élevées de la carvone et de la pulégone peuvent être utilisées comme explication pour les utilisations traditionnelles de ces espèces du Mentha pour le traitement de maladies microbiennes. La résistance croissante aux antibiotiques des agents pathogènes associés aux maladies infectieuses et les effets secondaires indésirables des antibiotiques ont laissé suggérer l'utilisation d'he de Mentha comme antibiotiques ou alternatives aux molécules synthétiques. Toutefois, d'autres recherches sont nécessaires pour explorer l'activité antibactérienne de ces huiles dans les produits formulés in-vivo. Les résultats de l évaluation des hydrolats ont permis de déduire que ces produits naturels présentent une activité antibactérienne vis-à-vis de certains microorganismes. Ils peuvent être également une source pour l isolement de composés de haute valeur comme le carvone, carvacrol, et l eucalyptol utilisés dans l aromathérapie, l industrie cosmétique et pour d autres vertues thérapeutiques. Des études plus approfondies sont recommandées afin de vérifier l efficacité de ces hydrolats contre diverses souches microbiennes. 124

153 Chapitre. IV Activité insecticide des HE et des hydrolats des M. pulegium L., M. suaveolens Ehrh., et M. spicata L.

154 Chapitre IV : Activité insecticide des menthes I. Introduction Les plantes ont été utilisées dans la nature en tant qu insecticides depuis des millions d'années sans aucun effet négatif sur l'écosystème. Le matériel végétal a été exploité par l'homme comme répulsif par suspension des plantes meurtries dans les maisons ou sous forme de fumigants bruts pour chasser les moustiques nuisibles et plus tard sous forme de formulations d'huiles appliquées sur la peau ou les vêtements (Maia et al., 2011). La lutte biologique a été remplacée par la suite par celle chimique, mais les effets négatifs des pesticides sur la santé humaine et sur l environnement ont conduit à un recours aux insecticides à base végétale et aux HE en raison de leurs coûts et de leurs effets secondaires écologiques minimes (Kumar et al., 2011; Khater, 2012). Les HE peuvent agir comme des fumigants (Benayad, 2008; Boughdad et al., 2011), des insecticides de contact (Tang et al., 2007; Brahmi et al., 2016), des répulsifs (Islam et al., 2009; Brahmi et al., 2016) et des antiappétents (Gonzalez-Coloma et al., 2006) et peuvent affecter certains paramètres biologiques tels que le taux de croissance (Nathan et al., 2008), la durée de vie et de reproduction (Isikber et al., 2006; Boughdad et al., 2011). Ces propriètés biologiques qu acquièrent les HE sont dues à leur richesse en principes actifs. Plusieurs travaux ont traité l activité insecticide des HE de différentes espèces. Les hydrolats, même s ils renferment une teneur faible ou modérée en principes actifs, ont des activités biologiques intéressantes qui les rendent utiles pour l'industrie alimentaire et cosmétique (Sağdiç et al., 2002; Verma et al., 2012). En outre, ils trouvent également une application dans l'agriculture pour fertiliser le sol et contre les champignons, les moisissures et les insectes (Paolini et al., 2008). Mais, il n y a pas suffisamment d'informations à ce propos. Jusqu à maintenant, et à notre connaissance, une seule étude a été menée par Petrakis et al. (2015) pour s investiguer sur les propriétés insecticides de certains hydrolats contre les pucerons de pêche Myzus persicae. Dans ce contexte, nous avons mené également une étude originaire dont l objectif principal était de tester le potentiel insecticide des hydrolats du M. pulegium et du M. suaveolens (Ehrh.) sur les pucerons noirs du Citrus (agrumes). Nous avons également conduit des études sur le pouvoir des HE du M. pulegium (L.), M. suaveolens (Ehrh.) et du M. spicata (L.) sur un ravageur des denrées stockées connu par sa large répartition à travers notre pays. 125

155 Chapitre IV : Activité insecticide des menthes Ce chapitre est consacré donc à la valorisation de ces menthes par les tests insecticides étant donné leur importance économique à l échelle mondiale et aussi leur grande utilisation par la population Marocaine. D autre part, nous avons voulu aussi contribuer à la recherche de biopesticides à base de produits naturels contre les ravageurs des denrées alimentaires et des cultures. II. Matériels et méthodes 1. Ravageurs traités 1.1. Sitophilus Oryzae (L.) Les adultes de S. Oryzae (L.) ont été collectés du marché des céréales et élevés par la suite aux dépens des grains du blé dans des bocaux en verre sous une température de 24± 1 C et une humidité relative de 76 ± 5% à l obscurité afin d obtenir une population homogène Toxoptera aurantii Les pucerons noirs, T. aurantii, ont été collectés sur un bigaradier infesté. Les feuilles infestées sont déformées et enroulées sur elles-mêmes et les pucerons forment des colonnies en grappe le long des tiges et sur la face inférieure des feuilles (Figure 44). Figure 44 : Feuilles infestées par les pucerons noirs 126

156 Chapitre IV : Activité insecticide des menthes 2. Bioessais 2.1. Tests de toxicité des HE par fumigation vis-à-vis du S. oryzae Les tests de fumigation ont été effectués dans des boites hermétiques en plastique d un litre de capacité. Ainsi, dans chaque boîte, a été placée une boite de Pétri aérée par une gaze en mousseline contenant 10 adultes du S. oryzae (L.) et un papier filtre sur lequel a été déposée la concentration utilisée. Les concentrations appliquées sont : 0.75; 0.25; 0.5; 1 et 2 μl d HE des M. pulegium, M. suaveolens et M. spicata/ l d air. Pour chaque concentration, 5 répétitions ont été conduites. Le contrôle de mortalité a été effectué quotidiennement par le dénombrement d individus morts jusqu à la mort du dernier insecte Tests de toxicité des hydrolats à l égard des pucerons noirs Six concentrations d hydrolats des M. pulegium L. et M. suaveolens Ehrh: 31 µl, 125 µl, 250 µl, 500 µl, 1ml, 2ml ont été diluées chacune dans 10 ml (5 répétitions) de l eau distillée plus un témoin contenant seulement 10ml de l eau distillée. Des feuilles des orangers infestées par des pucerons, contenant chacune environ 50 individus, ont été noyées dans les hydrolats préparés et parfaitement enfermées dans des boites de pétri et laissées agir dans les conditions ambiantes. Après 24 heures du traitement, les individus morts ont été dénombrés selon chaque concentration. 3. Analyses statistiques Pour évaluer l effet fumigant toxique de l huile essentielle testée sur les paramètres biologiques mesurés, une analyse de variance, réalisée au moyen du logiciel Excel (version 2007), a été conduite sur l arsin ((racine (pourcentages de mortalités)). Le calcul des probabilités de survie et la comparaison de l effet de chaque concentration testée ont été conduits respectivement par le test de Kaplan-Meier (1958) et le test de logrank (Lee et al. 2003). Les concentrations létales pour 50% (CL50) et 99% (CL99) des insectes fumigés et des pucerons traitésont été déterminées par la méthode des Probits selon Finney (1971). Le traitement des données issues du dénombrement des pucerons morts a été réalisé à l aide du logiciel Excel 2007 et du logiciel SPSS. 127

157 Probabilité de survie VI. Résultats des tests insecticides Chapitre IV : Activité insecticide des menthes 1. Evaluation de l activité insecticide des HE des menthes sur S. oryzae L Etude de l activité insecticide de l HE du M. pulegium L. D après les résultats de tests de fumigation, les concentrations de l HE de la menthe pouliot testées ont montré une activité fumigante significative. Le degré de cette activité dépend de la concentration appliquée (Fconcentration = 18,38 >F (0,05, 5-192) = 2,2141) et de la durée d'exposition (Ftemps= 12,83>F (0,05, 7-192)= 2,0096). Le taux de survie des insectes diminue au fur et à mesure que la concentration et le temps d'exposition accroissent (figure 45). L'interaction entre les charançons et l'he a duré huit jours. La mortalité a été observée dès le premier jour et même à la plus basse concentration. À 2 ml/l d air, les insectes ont été totalement décimés au quatrième jour. Quant aux faibles concentrations, la mortalité des insectes atteint progressivement l'ensemble de la population au huitième jour après le début de la fumigation μl/l air(a) 0.25μl/l air(b) 0.75μl/l air(b) 0.5μl/l air(c) 1μl/l air(cd) 2μl/l air(d) Jour après traitement Figure 45 : Taux de survie des adultes du S. oryzae fumigés par l'he du M. pulegium (Les concentrations affectées d une même lettre ne diffèrent pas statistiquement entre elles (Test Logrank)). Les paramètres de toxicité de l'he testée sont résumés dans le Tableau (18). Les concentrations létales calculées CL50 et CL99 varient en fonction du temps; elles diminuent progressivement avec l augmentation du temps de fumigation. Les concentrations létales CL50 et CL99 extrêmes s echelonnent entre 2,65 et μl/l d air et, entre 143,9 et μl/l d air respectivement. 128

158 Chapitre IV : Activité insecticide des menthes Tableau 18: Paramètres de toxicité de l'he du M. pulegium vis-à-vis des adultes du S.oryzae Jours Equation X 2 obs<x 2 tab=7.815 LC 50 (μl/l air) [IC] LC 99 (μl/l air) [IC] 1 1,34x + 4,43 0,487 2,652[1,699; 7,691] 143,9[27,9;111637,9] 2 1,84x + 5,02 0,739 0,973[0,792; 78,02] 17,67 [8,11;8,02] 3 1,97x +5,47 1,172 0,577[0,499; 0,709] 8,65 [4,66; 27,33] 4 2,46x +6,25 5,525 0,310[0,233; 0,384] 2,735[1,829; 5,601] 5 2,77x +6,33 4,444 0,219[0,137; 0,284] 1,507[1,060; 2,971] 6 2,41x +7,59 2,672 0,084[0,004; 0,162] 0,777[0,518; 0,892] 7 2,16x +7,94 0,813 0,044 0,518 [IC] : Intervalle de confiance ; Obs : observé ; Tab : tabulé L'efficacité de l'huile de menthe pouliot peut être attribuée à sa composition chimique en général, et en particulier aux monoterpènes qui agissent comme agents insecticides (Abdelgaleil et al., 2009). Notre plante est riche en monoterpènes (96,87%), principalement en pulégone (68,86%), pipéritenone (24,81%), thymol (1,01%), limonène (0,9%) et en pinène (0,32%). Ces composés actifs ont révélé une activité insecticide importante contre plusieurs ravageurs (Karr et al., 1990; Franzios et al., 1997; Lee et al., 2003; Abdelgaleil et al., 2009; Boughdad et al., 2011; Bouchikhi et al., 2010). Ces résultats corroborent ceux rapportés par Benayad (2008) dont une concentration de 3 µl/l d air de l HE du M. pulegium (73,33% de pulégone) a provoqué la mortalité de tous les charançons du S. oryzae après un jour de traitement. De même, ces insectes ont également été décimés à une dose de 1, µl/cm 3 de l HE du M. suaveolens (85,5% de la pulégone) après 7 jours de traitement et à une dose de 3, µl/cm 3 d'huile après 24 heures (El Arch et al., 2003). L'effet fumigant de cette huile contre les adultes du S. oryzae pourrait également s expliquer par la forte teneur en pulégone. La toxicité de cette cétone contre S. oryzae a également été observée par Lee et al. (2003) et Hannin et al. (1997) Etude de l activité insecticide de l HE du M. suaveolens Ehrh. Des différences considérables dans la mortalité des insectes traités par l HE du M. suaveolens (Ehrh.) ont été observées selon la dose et le temps d'exposition. Les résultats de tests insecticides ont montré que l HE du M. suaveolens est très toxique contre S. oryzae. Le degré de cette toxicité a été influencé également par la concentration appliquée (Fconcentrations = 53,82 > F (0,05; 4-120) = 2,45) et le temps d'exposition (Ftemps = 68,82> F (0,05; 5-120)= 2,29). La survie de charançons traités a diminué avec l'augmentation des concentrations et du temps d'exposition (Figure 46). 129

159 Probabilité de survie Chapitre IV : Activité insecticide des menthes L'HE du M. suaveolens a affecté significativement la survie des charançons du S. oryzae. Dans les boites traitées, les charançons ont été totalement détruits à la dose de 2 µl/l d air après un temps d'exposition de 72 heures. Aux faibles doses, le taux de mortalité au sein de charançons a été enregistré au premier jour, puis il a atteint l'ensemble de la population au cinquième jour. Dans le lot témoin, aucun insecte mort n'a été observé au cours de fumigation Jours après traitement 0µL/L air (a) 0.25µL/L air (b) 0.5µL/L air (bc) 0.75µL/L air 1µL/L air (d) 2µL/L air (d) Figure 46 : Taux de survie des adultes du S. oryzae (L.) fumigés par l'he du M. suaveolens Ehrh. (Les concentrations affectées d une même lettre ne diffèrent pas statistiquement entre elles (Test Logrank)) Les paramètres de toxicité de l'he du M. Suaveolens sont résumés dans le Tableau (19). Les concentrations létales CL50 et CL99 calculées ont révélé que les adultes du S. oryzae sont si sensibles à cette huile. Les valeurs extrêmes de CL50 et CL99 varient en fonction de la durée d'exposition; ils allaient de 1,742 à 0,070 µl/l d air et 106,33 respectivement à 0,654 μl/l d'air au début de la fumigation jusqu'au dernier jour. Tableau 19 : Paramètres de toxicité de l HE du M. suaveolens Ehrh. vis-à-vis du S. oryzae Jours Équation X 2obs < X 2tab LC 50 (μl/ l air) [IC] LC 99 (μl/ l air) [IC] = ,30x + 4,68 2,929 1,742 [1,224 ; 3,638] 106,336 [23,212 ; 5236,862] 2 1,66x + 5,46 4,357 0,531 [0,396 ; 0,665] 13,220 [6,054; 63,460] 3 2,22x+ 7,008 5,066 0,124 [0,039 ; 0,196] 1,391 [0,908 ; 3,977] 4 2,39x +7,76 1,582 0,070 [0,000 ; 0,150] 0,654 [0,438 ; 5,621] De nombreuses études ont été menées sur la toxicité de l HE du M. suaveolens contre S. oryzae et d'autres organismes nuisibles. Benayad (2008) a constaté que cette huile (12 μl/l air) a détruit tous les charançons de S. oryzae au premier jour du traitement. De même, Boughdad et al. (2011) et Eman et al. (2010) ont remarqué que cette essence a été très efficace contre les insectes du C. maculatus. De plus, celle du M. microphylla, dont le principal composé est 130

160 Taux de survie Chapitre IV : Activité insecticide des menthes l oxyde de piperitenone (46,70%), a également montré la toxicité la plus forte parmi toutes les huiles testées contre S. oryzae (CL50 = 0,21 μl/l) (Magdy et al., 2008). Comme signalé auparavant, le pouvoir insecticide est lié à la composition chimique de l HE et à la présence des monoterpènes. L'essence du M. Suaveolens contient 86,2% de monoterpènes tels que l'oxyde de pipéritenone, pulégone, limonène, pipéritenone, β-pinène, α- pinène et ƿ-cimène dont leur toxicité a été prouvée à l égarddes parasites des produits stockés (Franzios et al., 1997; El Arch et al., 2003; Tripathi et al., 2004; Benayad, 2008; Abdelgaleil et al., 2009; Bouchikhi et al.,2010; Koliopoulos et al., 2010; Boughdad et al., 2011). La toxicité de cette huile peut être justifiée également par le taux élevé d'oxyde de pipériténone (74,69%). Ce monoterpène oxygéné a été signalé doté d une toxicité élevée contre les organismes nuisibles (Tripathi et al., 2004; Magdy et al., 2008; Koliopoulos et al., 2010) Etude de l activité insecticide de l HE du M. spicata (L.) Le potentiel fumigant toxique a été observé également pour L HE du M. spicata (L.). Cette essence a affecté significativement la survie des adultes du S. oryzae (Figure 47). La survie des charançons oscille entre un et 14 jours. Elle diminue au fûr et à mesure que la concentration de l HE et la durée du traitement augmentent. Les adultes du S. oryzae sont totalement détruits à une dose de 2 µl/l d air après un contact de 9 jours. La mortalité des charançons a atteint 100% au 14 ème jour à une dose de 0,25 µl/l d air Jour après traitement 0µL/L d'air(a) 0.25µL/L d'air(b) 0.5µL/L d'air(b) 0.75µL/L d'air 1µL/L d'air(cd) 2µL/L d'air(d) Figure 47 : Taux de survie des adultes du S. oryzae (L.) fumigés par l'he du M. spicata L. (Les concentrations affectées d une même lettre ne diffèrent pas statistiquement entre elles (Test Logrank)) L HE du M. spicata (L.) a testée pour son potentiel insecticide vis-à-vis d autres ravageurs; l HE de Meknès (carvone 39%) a provoqué la mortalité des adultes du C. 131

161 Chapitre IV : Activité insecticide des menthes maculatus à une concentration de 80 µl/l d air durant 4 jours d exposition (Boughdad et al., 2011). Ainsi, cette huile a également prouvé son efficacité contre les insectes des D. auraria (Konstantopoulou et al., 1992) et D. melanogaster (Franzios et al., 1997). Des résultats analogues ont été obtenus avec l HE du M. rotundifolia sur le même ravageur à une dose de 1, µl/cm 3 pendant 7 jours de traitement et 3, µl/cm 3 après 24 heures (El Arch et al., 2003), à 15 µl/l d air de l HE du Romarin, de lavande et du Laurier (Haubrugue et al., 1989). Alors que l essence étudiée par Boriky (2005) a entrainé la mortalité de 60% des charancons de S. oryzae à partir d une concentration de 2, µl/ml après 7 jours de traitement. En outre, cette HE a été évaluée pour son activité insecticide contre les acariens (Sertkaya et al., 2010). Tout récémment, Brahmi et al. (2016) ont trouvé que le pouvoir fumigant de l HE du M. spicata de l Algérie contre les adultes de R. dominica est modéré; un taux de mortalité de 43% a été observée après 96 jours de traitement à une dose de 2 μl/ml. Les valeurs de CL50 et CL99 calculées varient en fonction du jour de traitement. Après 14 jours d exposition, les CL50 et CL99 sont respectivement 0,084 et 0,531 µl/l d air. Elles augmentent parallèlement à la durée du traitement (Tableau 20). La DL50 de l HE du M. spicata de la Grèce vis-à-vis du D. melanogaster est de 1,12 (Franzios et al., 1997). De même, Abd El-Salam (2010) a constaté que les HE du S. aromaticum, E. globulus, C. zelanicum, T. vulgaris, S. chenensis, C. flexuosus et M. alternifolia ont manifesté une puissante toxicité visà-vis du S. oryzae après 3 jours : 8,4; 10,6; 12,4; 16; 31; 36 et 69,6 µl/l d air alors que la CL50 de l HE du D. ambrosioîdes était de 5,83 µl/l d air (El Idrissi et al., 2014). Tableau 20 : Paramètres de toxicité de l HE du M. spicata L. vis-à-vis des adultes du S. oryzae X 2 obs<x 2 tb Jours Equation = 7,815 CL50 (μl/l air) [IC] CL99 (μl/l air) [IC] 1-1, ,082x 0,749 16,639 [4,457;333904,013] 2354,343 [75,363; ,4] 2-0,979+1,096x 0,339 7,826 [3,127; 397,536] 1037,783[64,511; ,291] 3-0, ,968x 0,037 6,661[2,719;317,115] 1681,402 [81,007; ,22] 4-0,574 +0,909x 0,222 4,284[2,030 ; 97,110] 1556,534 [78,565; ,948] 5-0, ,294x 1,685 1,035[0,777 ; 1,591] 65,018 [16,786; 1809,212] 6 0, ,446x 0,335 0,370[0,225 ; 0,493] 15,033[6,048; 117,177] 7 1, ,462x 0,448 0,207[0,087;0,309] 8,070[3,606;55,967] 8 1, ,734x 1,532 0,180[0,080;0,266] 3,961[2,168; 15,302] 9 1, ,191x 3,480 0,177[0,088 ; 0,249] 2,041[1,308; 5,266] 10 2, ,477x 2,950 0,143[0,058;0,210] 1,241[0,843; 3,073] 11 2, ,783x 2,028 0,108[0,018;0,177] 0,740[0,518; 2,391] 12 3, ,901x 0,454 0,084[0,000 ; 0,162] 0,531[0,371;9,038] La menthe verte testée contient 88,65% de monoterpènes principalement la carvone (71,56%) et le limonène (10,50%). Ces deux constituants ont provoqué la mortalité de plusieurs ravageurs (Boughdad et al., 2011; Abdelgaleil et al., 2009; Tripathi et al., 2003; 132

162 Pourcentagde de mortalité% Pourcentage de mortalité% Chapitre IV : Activité insecticide des menthes Franzios et al., 1997; Karr et al., 1990). La DL50 de la carvone à l égard des adultes du D.melanogaster est de 0,67. Ce cétone s est manifesté également toxique contre les adultes des S. oryzae, T. castaneum et R. dominica (Tripathi et al., 2003). En plus du rôle synergique probable avec d autres constituants qui sont connus dans la littérature par leur toxicité même s ils se présentent en petites quantités tels que l α-pinène, le β-pinène et la pulégone. 2. Activité insecticide des hydrolats de menthes sur Toxoptera aurantii Les hydrolats de la menthe odorante et de la menthe pouliot testés ont montré une activité insecticide intéressante à l égard de T. aurantii après 24 heures de traitement (Figures 48 et 49). Ils ont affecté considérablement la longévité des aphidés. La mortalité a augmenté avec l augmentation des concentrations appliquées des hydrolats (FCalculé= 207,79> F0,05; 6-56 = 2,27). Pour la même concentration, l hydrolat du M. suaveolens Ehrh. s'est montré plus toxique contre les pucerons noirs que celui du M. pulegium L. (FCalculé = 307,64> F0,05; 1-56 = 4,01) Concentration en hydrolat du M. pulegium (ml/10 ml ED) Concentration en hydrolat du M. suaveolens (ml/10 ml ED) Figure 48: Mortalité des pucerons noirs selon la dose de l hydrolat du M. pulegium L. Figure 49: Mortalité des pucerons noirs selon la dose de l hydrolat du M. Suaveolens Ehrh. La mortalité des pucerons noirs traités par l hydrolat du M. suaveolens atteint 100% à une concentration d un ml tandis que 99% des pucerons ont été détruits à 2 ml de celui de la menthe pouliot. Les concentrations létales (CL50) étaient d'environ 0,01 et 0,5 ml pour M. suaveolens (Ehrh.) et M. pulegium (L.) respectivement. L'activité insecticide des deux hydrolats a été également évaluée en fonction de l'âge de pucerons. Les résultats ont montré que la mortalité des pucerons dépend étroitement de leur âge (ρ <0,01) (Figures 50 et 51). Les petits pucerons semblent être les plus sensibles à l hydrolat du M. pulegium (L.). A une dose d un ml, ils ont été totalement décimés mais la mortalité des pucerons moyens et les adultes ont atteint 99% et 98% respectivement à une concentration de 2 ml. 133

163 Chapitre IV : Activité insecticide des menthes Pour l hydrolat du M. suaveolens, une dose de 0,25 ml était susceptible de causer la mort de tous les petits pucerons. Ils ont montré une sensibilité élevée même à faibles doses. Cependant, la mortalité totale de tous les pucerons moyens et les adultes a été observée à une concentration de 1 ml d'hydrolat. Pourcentage de mortalité % Concentration en hydrolat du M. pulegium (ml/ 10 ml ED) Petits Moyens Adultes Pourcentage de mortalité % Concentrations en hydrolat du M. suaveolens (ml/10 ml ED) Petits Moyens Adultes Figure 50: Pourcentages de mortalités de la population de T. aurantii traitée par l hydrolat du M. pulegium L. Figure 51.: Pourcentages de mortalités de la population de T. aurantii traitée par l hydrolat du M. suaveolen Les paramètres de toxicité de ces hydrolats sont rassemblés dans le Tableau (21). Les valeurs de la CL50 et CL99 ont clairement démontré l'activité insecticide plus forte de M. suaveolens que M. pulegium en fonction de l'âge des pucerons noirs. Tableau 21: Paramètres de toxicité des hydrolats de menthes en fonction de l âge de T. Aurantii Plante Age Equation X 2 CL 50 (in 10ml ED)*[IC] CL 99 (in 10ml ED)*[IC] Hydrolat du M. suaveolens Hydrolat du M. pulegium ED : Eau distillée Petits 1,002x+7,17 2,137 0,007 [0,000; 0,024] 1,431 [0,457;95,871] Moyens 1,13x+7,59 2,318 0,005 [0,001; 0,012] 0,590 [0,331;1,694] Adultes 1,15x+8,42 7,750 0,001 [0,000; 0,006] 0,113 [0,057;0,727] Petits 1,60x+6,93 28,483 0,063[0,010; 0,135] 1,770 [0,555;168,357] Moyens 1,33x+6,31 16,869 0,104 [0,057; 0,209] 5,859 [1,527;441,806] Adultes 1,35x+6,12 10,398 0,147 [0,059; 0,270] 7,729 [2,340;166,519] 134

164 Chapitre IV : Activité insecticide des menthes Bien que la composition chimique des hydrolats des M. pulegium et M. suaveolens soit un peu différente de celle des HE mais ils sont également riches en monoterpènes bien connus par leur effet insecticide; leurs principaux composés: le carvacrol et l oxyde de pipériténone respectivement ont été rapportés dans des travaux antérieurs comme toxiques contre des différents ravageurs (Szczepanik et al., 2012; Magdy et al., 2009). En outre, la toxicité élevée de l hydrolat de la menthe à feuilles rondes par rapport à celui de la menthe pouliot peut être justifiée par le taux élevé de l'oxyde pipériténone (69,32%) contre le carvacrol (39,37%). En outre, l HE du M. suaveolens (Ehrh.), de la même plante, était plus efficace que celle du M. pulegium (L.). Aussi, l HE du M. microphylla, dont l oxyde de pipériténone est le principal composé (46,70%), a également montré une toxicité plus forte contre certains ravageurs (Magdy et al., 2009). L'effet insecticide de ces produits naturels, que ce soit des HE ou des hydrolats, ne se limite pas uniquement à leurs composés majoritaires ; il pourrait aussi être dû à l activité de certains constituants mineurs ou à l effet synergique de plusieurs constituants (N gamo et al., 2008). En outre, les constituants majeurs de certaines espèces, caractérisées par leur toxicité, peuvent être présents en petites quantités dans d'autres. Les constituants tels que la pulégone, le limonène, le pinène et le thymol étaient présents en quantités modérées, mais ils ont déjà montré un effet insecticide potentiel (Boughdad et al., 2011; Bouchikhi et al., 2010; N Domo et al., 2009; Brada et al., 2007; El Arch et al., 2003). La pulégone, présente dans l hydrolat de la menthe pouliot en pourcentage modéré (2,32%), est bien connue par sa toxicité vis-à-vis des ravageurs de produits stockés comme S. oryzae, R. dominica et T. castaneum (Lee et al., 2003; Hannin et al., 1997). Le mode d'action des HE et de leurs constituents en tant qu insecticides n'a pas été clairement connu et non plus pour les hydrolats. Des études récentes ont indiqué qu'ils affectent la physiologie des insectes de diverses manières. En outre, les monoterpènes ont été étudiés pour leur neurotoxicité (Kumar et al., 2011); ils sont typiquement des composés volatils et plutôt lipophiles qui peuvent pénétrer dans les insectes rapidement et interférer avec leurs fonctions physiologiques par inhibition de neurotransmetteurs tels que l'acétylcholinestérase (Lopez et al., 2010) et l octopamine (Price et al., 2006). 135

165 VI. Conclusion Chapitre IV : Activité insecticide des menthes Dans cette étude, nous avons évalué le potentiel insecticide par fumigation des HE des menthes sur un ravageur des denrées stockées, ainsi que par contact des hydrolats contre un ravageur de Citrus. L HE du M. suaveolens (Ehrh.) a montré une activité insecticide importante par rapport aux autres huiles de menthes avec une mortalité totale enregistrée après cinq jours d exposition à une dose de 2 µl/l d air. Cette activité varie selon la dose utilisée et la durée du traitement. L'utilisation des HE de ces menthes en fumigation pour contrôler les populations du S. oryzae peut être très efficace puisque la fumigation peut gérer de grandes masses de graines sans les déplacer. En outre, les propriétés des HE telles que la forte volatilité, la biodégradabilité rapide et ils ne peuvent pas présenter de risque de résidus sur les produits traités ou sur la germination des grains transformés. Par conséquent, ellesont un potentiel énorme comme des insecticides naturels dans la protection des céréales stockés. Cette étude a permis également de confirmer le potentiel insecticide des hydrolats chez certaines plantes comme M. suaveolens et M. pulegium. Les deux hydrolats étaient toxiques vis-à-vis de T. aurantii, mais M. suaveolens possède l'activité insecticide la plus élevée. Le degré de cette activité dépendait significativement des doses appliquées et de l'âge de pucerons testés. En outre, cet effet pourrait être principalement corrélé à la composition chimique des hydrolats. Les résultats obtenus ont confirmé la possibilité d'application de ces hydrolats de menthes comme pesticides botaniques vis-à-vis des insectes nuisibles tels que Toxoptera aurantii. Voire que les hydrolats sont faciles à produire et peu coûteux et possèdent une faible volatilité, ils peuvent donc constituer une solution plus efficace que les HE dans la gestion des ravageurs dans les champs. D'autres études doivent être menées pour augmenter le nombre de plantes utilisées pour la lutte antiparasitaire afin d'obtenir des pesticides moins chers et la pollution de l'environnement diminuera progressivement. D'autres études sont recommandées pour évaluer ces substances naturelles contre un grand nombre de ravageurs des produits alimentaires et des cultures. 136

166 CONCLUSION GENERALE

167 Conclusion Générale L objectif scientifique du présent travail a été la recherche des molécules naturelles à activité biologique qui pourraient servir d appui pour trouver des alternatives aux produits synthétiques qui ont prouvé leur nuisance à la santé humaine et à l environnement. Ce travail a consisté en l étude phytochimque et biologique de trois espèces de menthes choisies sur la base de leurs usages traditionnels par la population marocaine. Dans un premier temps, nous nous sommes investigués sur les principes actifsde la fraction volatile des menthes, et sur les différents métabolites secondaires de la fraction non volatile. Dans un second temps, nous avons procédé à l extraction, au dosage des composés phénoliques et à l évaluation des activités antioxydante, antibactérienne et insecticide des extraits volatils et non volatils de ces menthes. Les HE et les hydrolats, constituant les fractions volatiles, ont été extraits par hydrodistillation à partir de Mentha pulegium (L.), Mentha suaveolens (Ehrh.) et Mentha spicata (L.) collectées de quatre régions du Moyen-Atlas, et leur composition chimique a été déterminée par CPG/SM. Les profils chimiques obtenus ont montré que la composition varie en fonction de la région d origine et de l espèce. Les produits majoritaires des HE du M. pulegium sont: la pulégone et/ou la pipériténone, l oxyde de pipériténone et/ou la pipériténone pour M. suaveolens, et la carvone et le limonène pour M. spicata (L.). La caractérisation des hydrolats chargés en composés hydrosolubles s inscrit dans une démarche de valorisation d une matière jusqu alors considérée comme un effluant. Leur composition chimique semblait différente de celle des HE. Ils ont présenté comme composés majoritaires: le carvacrol et la pipériténone pour M. pulegium; l oxyde de pipériténone pour M. suaveolens, et le 1,8-cinéole et le camphre pour M. spicata (L.). D un point de vue industriel, ces coproduits des HE contenant plusieurs constituants oxygénés dans une phase aqueuse présente un intérêt commercial prometteur. Pour réaliser l étude phytochimique, nous avons effectué au préalable un criblage des diverses familles de métabolites secondaires contenus dans les menthes choisies. La nature des familles chimiques détectées a laissé prévoir des propriétés pharmacologiques intéressantes. Il s agit donc des flavonoïdes, des saponosides, des tanins et des alcaloïdes. Ainsi, l extraction et le dosage des phénols totaux et des flavonoïdes ont permis de déterminer leurs teneurs dans les extraits bruts des trois espèces et leurs fractions. Ces teneurs dépendent à la fois de la technique et du solvant d extraction et, de l espèce elle-même. 137

168 Conclusion Générale L évaluation de l activité antioxydante in-vitro des extraits/fractions et des HE a été réalisée par la méthode du piégeage du radical libre DPPH. Nous avons constaté que les différents extraits et fractions testés ont montré une activité antiradicalaire intéressante, dépendante du contenu en polyphénols totaux et en flavonoïdes ; les fractions les plus riches en flavonoïdes étant les plus actives. Les HE ont montré également un potentiel antioxydant important mais l HE du M. pulegium a eu le pouvoir antiradicalaire le plus intéressant. Les HE de ces trois espèces de menthes ont été également soumises à une évaluation de leur activité antibactérienne in-vitro, contre six souches de bactéries pathogènes, en employant la méthode de diffusion sur disque et la méthode de microdilution en milieu liquide. L évaluation qualitative de l activité antimicrobienne des HE étudiées a montré un effet antimicrobien pour toutes les huiles testées. Ces résultats ont été confirmés par l évaluation quantifitive qui a également mis en évidence une activité antibactérienne importante de ces composés naturels. Quant aux hydrolats, rarement évalués pour leur pouvoir antibactérien, ont montré aussi leur efficacité inhibitrice contre certaines souches. Les résultats de bioessais ont montré que les HE de trois menthes exercent une activité insecticide par fumigation sur la longévité des adultes du ravageur S. oryzae. L HE du M. suaveolens s est montrée la plus efficace suivie de celle des M. pulegium et M. spicata; elle a permis d éradiquer tous les charançons traités dans 5 jours d exposition. Les taux de survie diminuent avec l augmentation de la dose et de la durée d exposition pour toutes les huiles testées. Le pouvoir insecticide des hydrolats de mêmes espèces a été également étudié. Cette étude a été réalisée dans le cadre de la valorisation de ces eaux magiques non encore évaluées pour leur effet insecticide. Les hydrolats testés par contact semblent avoir tous un effet toxique sur la durée de vie des aphidés du T. aurantii de différents âges. L hydrolat du M. suaveolens s est avéré aussi le plus efficace de manière que la mortalité a atteint 100% après 24 h du traitement. L ensemble des résultats obtenus lors de ce travail pourrait constituer une justification scientifique de l usage traditionnel des menthes étudiées et une confirmation de leurs vertus thérapeutiques dans le traitement de nombreux maux. Ces résultats constituent donc une contribution à la connaissance des potentiels antioxydants, antimicrobiens et insecticides naturels de ces espèces. 138

169 Conclusion Générale De nombreuses perspectives de recherche peuvent être dégagées de ces travaux notamment : L extraction et l identification des principes actifs des HE des menthes issues de différentes régions ; L analyse chromatographique par HPLC des extraits non volatils des menthes afin d identifier les divers types de flavonoïdes responsables de leur activité antioxydante et les corréler avec le degré de cette activité ; L évaluation de l activité antioxydante des extraits de menthes par d autres méthodes autres que le test de DPPH afin de déduire la plus efficace ; L étude de l activité antibactérienne des composés majoritaires sur les mêmes souches testées et sur d autres germes pathogènes ; L étude de toxicité des mêmes HE vis-vis d autres ravageurs des denrées stockées et celle des composés majoritaires sur la même espèce testée et leurs effets synergiques ou antagonistes. Ainsi, les résultats concernant les hydrolats demeurent prometteurs, et pourraient servir de base pour des études ultérieures afin de confirmer l efficacité insecticide et antimicrobienne de ces produits naturels et de proposer leur utilisation en tant qu agents antimicrobiens et biopesticides alternatifs. Il serait donc intéressant de: Déterminer et comparer la composition chimique des autres hydrolats extraits ; Tester ceux-ci sur la même espèce afin de comparer leur efficacité insecticide en relation avec la variabilité de leur composition ; les tester également sur d autres espèces nuisibles des cultures et en plein champ afin de déterminer les doses létales car le traitement par les pesticides souffre du problème de dosage; Évaluer leur potentiel antimicrobien sur d autres souches pathogènes; S investiguer également sur leur pouvoir antioxydant car les recherches à ce propos restent très rares. Par ailleurs, des formulations préparées à base des menthes étudiées seraient une alternative intéressante pour développer des biopesticdes, des produits agroalimentaires ou des suppléments alimentaires permettant d augmenter leur éfficacité à moindre dose et coût. Enfin, nous espérons que ce travail constitue une véritable contribution dans le cadre du développement durable et dans la mise en valeur de la flore marocaine peu explorée scientifiquement jusqu à ce jour. 139

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183 ANNEXES

184 Annexes Annexe 1 : Profils chromatographiques des HE et des hydrolats des menthes étudiées Relative Abundance Relative Abundance Hydrolat de M. pulegium d Azrou Relative Abundance RT: SM: 7G Time (min) NL: 2.77E6 TIC F: MS 626UATRS 11_GC01 Hydrolat de M. suaveolens RT: SM: 7G NL: 8.18E6 TIC F: MS 626UATRS 11_GC Time (min) Hydrolat de M. spicata d Azrou RT: SM: 7G NL: 1.78E6 TIC F: MS 626UATRS 11_GC Time (min) 152

185 Annexes L HE de M. suaveolens Ehrh. d Azrou Relative Abundance Relative Abundance RT: SM: 7G Time (min) NL: 3.31E7 TIC F: MS 748UATRS 11_GC02 Relative Abundance RT: SM: 7G L HE de M. spicata L. d Azrou Time (min) NL: 3.77E6 TIC F: MS 745UATRS 11_GC09 L H.E de M. spicata (L.) de Meknès RT: SM: 7G NL: 7.59E6 TIC F: MS 745UATRS 11_GC Time (min)

186 Relative Abundance Annexes L HE de M. pulegium d Azrou Relative Abundance RT: SM: 7G NL: 3.63E7 TIC F: MS 748UATRS 11_GC Time (min) L HE de M. pulegium de M rirt Relative Abundance RT: SM: 7G NL: 4.45E7 TIC F: MS 442UATRS 12_GC Time (min) L HE de M. pulegium de Khénifra RT: SM: 7G NL: 1.16E7 TIC F: MS OA197_10_ GC Time (min) 154

187 Annexes Annexe 2 : Tests de détection des métabolites secondaires des menthes étudiées Tanins Saponosides Flavonoïdes Alcaloides Stérols et triterpènes Mucilages 155

188 Annexes Annexe 3 : Tests de dosage des polyphénols dans les extraits de menthes Tests de dosage des flavonoïdes dans les extraits de menthes 156

189 Absorbance à 433 nm Absorbance à 760 nm Annexes Annexe 4 : Courbes d étalonnage des standards de référence pour tester l activité antiradicalaire y = 0,095x + 0,003 R² = 0, Concentration d'acide gallique en μg /ml Courbe d étalonnage de l acide gallique y = 0,073x - 0,081 R² = 0, Concentration de quercitrine en μg /ml Courbe d étalonnage de la quercétine 157

190 Annexes Annexe 5 : Zones d inhibition de la croissance bactérienne par l HE des menthes étudiées Zones d inhibition de la croissance bactérienne par l HE de M. spicata L. 158

191 Annexes Annexe 6 : Tests de l activité insecticide des HE et des hydrolats des menthes étudiées Tests de l activité insecticide des HE vis-à-vis des adultes du S. oryzae Tests de l activité insecticide des hydrolats vis-à-vis des aphides du T. aurantii 159

192 Annexes Annexe 7 : Résumés des articles publiés 160

193 Annexes 161

194 Annexes 162

195 Annexes 163

196 Annexes 164