TP Génétique Humaine. 1. Introduction. 2. L'enzyme MTHFR

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3 TP Génétique Humaine 1. Introduction Le MéthylèneTétrahydroFolate Réductase est une enzyme qui joue un rôle important dans le métabolisme des folates et d'homocystéine, pour fournir de la méthionine, un acide aminé qui s'intègre aux protéines, ou donne le groupement méthyle pour méthyler l'adn ou l'arn. Un polymorphisme au niveau du nucléotide 677 qui provoque une substitution de la base cytosine avec la base thymine au niveau du gène, et l'acide aminé alanine par une valine au niveau de l'enzyme donne une enzyme thermolabile qui perd une proportion importante de son activité. Ce polymorphisme est associé avec le cancer du sein et autres cancers. L'objectif du TP est la recherche de ce polymorphisme chez des donneur de sang de la région orientale témoins supposées saines. Le matériel à travailler est le sang recueilli du centre transfusion sanguine d'oujda. L'extraction de l'adn est faite par précipitation au NaCl, suit par PCR pour l'amplifier, une digestion par une enzyme spécifique l'hinf I et une électrophorèse sur gel d'agarose. 2. L'enzyme MTHFR La 5,10- Méthylène tétrahydrofolate réductase, MTHFR est une enzyme importante qui catalyse, de façon irréversible la conversion du 5,10-méthylène tétrahydrofolate en 5- méthylènetétrahydrofolate, un substrat clé donneur de folate et de carbone pour la reméthylation de l homocystéine en méthionine (13). Cette enzyme est codée par le gène MTHFR localisé sur le bras court du chromosome 1 dans la région 1p36.3 (3). Plus précisément, il se trouve à partir de la paire de base à , composé de 12 exons de 102 à 432 paires de bases. Il a été cloné en

4 Figure 1: : localisation cytogénétique du gène de la MTHFR (4). L enzyme est un homodimère présent dans le cytoplasme et localisée dans la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse, possédant un site de liaison pour le dinucléotide adénine de flavine (FAD) et est constituée de 656 acides aminés. Son poids moléculaire est de Da. Son expression est plus intense nse dans le testicule, intermédiaire dans le cerveau et le rein, et inférieur dans d autres tissus. Elle catalyse la réaction irréversible suivante: 5,10-CH 2 FH 4 +NADPH 5-CH 3 FH 4 +NADP + Figure 2: structure du gène de la MTHFR avec localisation des protéines et des mutations connus (4). 2

5 3. Le polymorphisme C677T 60 polymorphismes et 41 mutations rares et nuisibles dans le gène MTHFR ont été rapportés (4). Le variant C677T dans l'exon 4 a été particulièrement remarquable depuis qu'il a été reconnu comme la cause génétique principale d'hyperhomocystéinémie qui cause plusieurs désordres complexes. Cette mutation génétique de cette enzyme crée une enzyme thermolabile qui possède une activité réduite d environ 50 % à 37 C et une perte complète d activité à 46 C. La mutation a lieu dans le nucléotide 677 et transforme la base Cytosine en Thymine. Ceci a pour conséquence la formation d un acide aminé, la valine (V) au lieu d une alanine (A) en position 222(8). La mutation T au lieu de C crée un site de restriction pour deux enzymes qui sont Hinf I (GA/TC) et Taq I (T/CGA) (9). Lorsque le taux de folates apporté par l alimentation est bas, l enzyme ayant une activité réduite ne transforme pas intégralement le peu de folates d où une augmentation en homocystéine. Un faible taux en folates accentue donc l effet de la mutation. MTHFR dans les lymphocytes de sujets avec le génotype TT a ~ 30% de l'activité catalytique par rapport au type sauvage(cc), alors que le génotype CT a 65% l'activité catalytique (10). Figure 3: : Représentation schématique de 41 mutations graves du gène MTHFR et de 2 polymorphismes particulièrement étudiés (11). Les 41 mutations spécifiées n ont été identifiées que dans des familles de patients présentant un déficit important de MTHFR. Dans la figure 19, la protéine MTHFR est représentée par un rectangle et les acides aminés mutés sont indiqués au-dessus, ainsi que les mutations affectant l épissage du gène. Les nombres sous le rectangle désignent la position des mutations dans la 3

6 séquence de l ADNc (GenBank GI: ). Les nombres entre parenthèses désignent la présence d une mutation intronique à proximité du résidu mentionné. Les 2 polymorphismes de MTHFR les plus étudiés sont indiqués, en vert (12). La MTHFR par son rôle peut moduler les taux d homocystéine, de méthionine et de S- adénosylméthionine. La MTHFR peut aussi indirectement influencer les taux de nucléotides, puisque son substrat, le 5,10-méthylène tétrahydrofolate, est utilisé pour la synthèse de la thymidine et qu il peut aussi être converti en d autres dérivés foliques qui participent à la synthèse des purines. Heureusement, l interaction entre les prédispositions génétiques (C677T) et des paramètres non-génétiques (acide folique alimentaire, suppléments vitaminés) est susceptible de prévenir certaines manifestations cliniques associées à une légère déficience en MTHFR. II. Matériels et méthodes II.1. La mise en évidence du polymorphisme C677T du gène MTHFR chez des patientes atteintes du cancer du sein II.1.1. Patientes et matériels Nos témoins sont des femmes supposées saines et qui ne représentent pas un cancer du sein. Les échantillons sont recueillis du centre de transfusion sanguine d'oujda. Le prélèvement est fait à partir du sang périphérique dans un tube EDTA. II.1.2. Extraction de l'adn à partir du sang II Principe Les techniques d extraction des acides nucléiques relativement simples, permettent d obtenir un ADN de pureté élevée et de quantité importante. Elles ont pour but de récupérer les acides nucléiques en suspension et de les resolubiliser dans un tampon adéquat. Il convient simplement d éviter toute destruction enzymatique ou mécanique de l ADN. Ils se déroulent selon les étapes suivantes: - Lyse des globules rouges - digestion des protéines associées à l'adn par précipitation au NaCl - précipitation de l'adn par additionnement de l'isopropanol froid 4

7 II Protocole Figure 4: protocole de l'extraction de l'adn à partir du sang humain II.1.2.3) Evaluation de la qualité et de la quantité de l ADN extrait Le contrôle de la quantité d ADN extrait consiste en un dosage spectrophotométrique, afin de déterminer sa concentration et sa pureté. Une électrophorèse sur gel d agarose à 2% permet de s assurer de son intégrité. 5

8 II Dosage de l ADN Le maximum d'absorption des acides nucléiques se situe à 260 nm. Les protéines, principaux contaminant des préparations absorbent aussi à 260 nm, mais avec maximum d'absorption qui se situe vers 280 nm à cause des acides aminés aromatiques. Le rapport R= A260nm / A280nm constitue alors un bon moyen pour apprécier une éventuelle contamination de la préparation d'adn par les protéines ou par les RNA. *R = A260nm/A280nm * ADN pur: 1,8 < R < 2 * ADN contaminé par les protéines: R < 1,7 * ADN contaminé par les ARN: R > 2 Pour calculer la concentration d ADN: 1 unité DO260nm correspond à une concentration de 50 µg/ml d ADN double brin/ml. Donc: La concentration de l ADN en µg/ml = facteur de dilution DO µg/ml. II L intégrité de l ADN L intégrité de l ADN est appréciée par une électrophorèse sur un gel d agarose 2%. L ADN génomique s il n est pas dégradé, sera visible en lumière ultraviolette sous la forme d une bande unique qui migre très lentement. A l inverse l ADN dégradé apparaît sous forme d une traînée. II.1.3. PCR-RFLP II Principe de la PCR La technique PCR permet l amplification exponentielle d une région spécifique d'un acide nucléique donné par l utilisation d une ADN polymérase thermostable, d amorces et des quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dntp). L ensemble est soumis à une série de cycles de température afin d obtenir une quantité suffisante de la séquence d ADN désirée. L'amplification se fait de façon exponentielle (2 n ): n= le nombre de cycles 6

9 II Les composantes de la PCR Figure 5: la cinétique d'une PCR L'ADN matrice: l'adn qu'on veut tester. Les meilleurs résultats sont obtenus avec de l ADN parfaitement purifié. Tampon de la Taq polymérase: il sert à maintenir la stabilité et le ph du milieu pour une activité optimale de la Taq polymérase. L'amorce sens et anti-sens: ce sont des petites séquences d ADN d environ 20 nucléotides. Elles sont capables de s hybrider de façon spécifique grâce à la complémentarité des bases, leur extrémité 3 OH libre va servir d amorce pour l ADN polymérase. Les concentrations d amorces habituellement utilisées sont comprises entre 0.2 et 0.8 µm. Sens: 5'-CAA AGG CCA CCC CGA AGC-3' Anti-sens: 5'-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3' Le chlorure de magnésium (MgCl2): c est l élément clef de l hybridation des amorces. L hybridation des amorces dépend de la température et de la concentration ionique. En plus, c est un cofacteur qui catalyse le fonctionnement de l ADN polymérase. Les concentrations optimales sont en général comprises entre 0,5 et 2,5 mm. Les dntps: Ce sont les monomères de base (datp, dctp, dgtp, dttp) appelés globalement dntps (DésoxyNucléotides-Tri-Phosphates), utilisés par la Taq Polymérase pour synthétiser les brins d'adn complémentaires. Taq polymérase: enzyme extraite d'une bactérie thermophile, résistante à des températures très élevées, le Thermus aquaticus. Les quantités optimales d enzyme sont comprises entre 1 et 2,5 unités. La séquence du gène qu'on amplifie est de 245 paires de base: 7

10 caa agg cca ccc cga agc agg gag ctt tga ggc tga cct gaa gca ctt gaa gga gaa ggt gtc tgc ggg agc cga ttt cat cat cac gca gct ttt ctt tga ggc tga cac att ctt ccg ctt tgt gaa ggc atg cac cga cat ggg cat cac ttg ccc cat cgt ccc cgg gat ctt tcc cat cca ggt gag ggg ccc agg aga gcc cat aag ctc cct cca ccc cac tct cac cgc acc gtc ct (40) II Protocole La réaction d'amplification a été faite dans un volume final de 15 µl du mélange suivant: -Tampon de la réaction 10X 1,5µL -dntp (2 mm) 1, 5µL -MgCl 2 (50 mm) 0, 75µL -Amorce sens (0,5µM) 1µL -Amorce antisens (0,5 µm) 1µL -H 2 O ultrapure 8,05µL -Taq polymérase (5U/µl) 0,2 µl Dans un premier temps, un mélange ou mix est réalisé pour un nombre de n de tubes, puis réparti à raison de 14 µl/tube. L'ADN (1µL) est ajouté en dernier au mélange réactionnel pour les échantillons à étudier et l'eau distillée pour le témoin. II Programme PCR On règle le thermocycleur par le programme suivant: -Dénaturation primaire 94 C pendant 5 min -Dénaturation 94 C pendant 30 secondes -Hybridation 58 C pendant 45 secondes 30 cycles -Elongation 72 C pendant 40 secondes -Elongation finale 72 C pendant 5 min II Principe PCR-RFLP Le principe de la technique consiste à amplifier la région du gène du MTHFR par PCR et de digérer le produit obtenu avec des enzymes de restriction et d'analyser sur gel d'agarose les produits de digestion obtenus dans le but de détecter des polymorphismes ou des mutations ponctuelles. Dans notre cas on utilise une enzyme de restriction la HinfI car la substitution de C à T au niveau du nucléotide 677 dans la région codante du gène de la MTHFR crée un site de restriction pour cette endonucléase (35). 8

11 Figure 6: sites de restriction d'hinfi La digestion enzymatique d'une séquence de 198 pb du gène MTHFR donne 3 fragments de 175 pb, 198 pb et 23 pb selon le génotype du gène après séparation par électrophorèse et visualisation par UV (figure 27). Figure 7: (A) Structure du gène MTHFR. La flèche indique le site de restriction du gène MTHFR. Lorsque la séquence contient l'allèle T, HinfI restreint le site. Les produits sont trois fragments, 198 -, 175 -, et 23 pb. L'allèle C ne fait qu'un fragment de 198 pb. (B) Le polymorphisme C / T dans le gène MTHFR. L'allèle T a été coupé par HinfI. La figure montre la photo de l'électrophorèse sur gel d'agarose (2%) coloré par le bromure d'éthidium après la digestion par HinfI des produits PCR. La bande unique avec 198 pb indique un génotype C / C. Homozygotie de l'allèle T a deux bandes avec et 23 pb. Toutefois, la bande de 23 pb n'est pas détectée sur le gel d'agarose à 2%. Le type C / T est indiquée par trois bandes avec 198 à et 23 pb. (6). 9

12 II Caractéristiques de l'enzyme de restriction HinfI Source: Haemophilus influenzae Température d'incubation:37 C Température d'inactivation: 80 C pendant 10 minutes Tampon de la réaction: 10 mm Tris-HCl (ph 7.5 à 37 C) 10 mm MgCl2 50 mm NaCl 1 mm dithiothreitol 100 µg/ml albumine du sérum bovin Tampon du stockage: 50mM Tris-HCl (ph 7.5 à 4 C) 0.1 mm EDTA 10 mm β-mercaptoethanol 500 µg/ml albumine du sérum bovin 50% (v/v) glycérol Conditions de stockage: Stocké à -20 C dans la glace sèche. II Protocole La réaction de digestion a été faite dans un volume final de 20 µl de mélange suivant: Tampon 10X 2µl Acetylated BSA (10µg/µl) HinfI (10U/µl) Eau distillée stérile 0,2µl 0,5µl 2,3µl BSA stabilise l'enzyme et empêche son adhésion sur les tubes. Dans un premier temps, un mélange ou mix est réalisé pour un nombre n de tubes, puis réparti à raison de 5µl/tube. L'ADN produit du PCR (15µl) est ajouté en dernier au mélange réactionnel. Incubation du mélange pendant 4heures dans un bain-marie à 37 C. 10

13 II.1.4. Electrophorèse sur gel d'agarose II Principe L électrophorèse est une méthode permettant la séparation de particules chargées sous l action d un champ électrique uniforme. A ph neutre, les molécules d ADN sont chargées négativement du fait de la présence du phosphate, et migrent vers l anode quand elles sont soumises à un champ électrique. Leur rapport charge/taille étant constant, ces molécules se séparent en fonction de la facilité avec laquelle elles progressent à travers les mailles constituées par le gel. La séparation est ainsi assurée par l effet de la filtration du gel. La vitesse de la migration d une molécule d ADN dépend de deux paramètres : sa taille et la concentration en agarose du gel, mais le voltage et la force ionique du tampon interviennent aussi. II Protocole II Préparation du gel On pèse 2 g d'agarose et on le met dans 100 ml du tampon TAE 1X (2%). L'agarose est fondu sur plaque chauffante jusqu'à ce que le mélange devienne limpide, puis coulé dans une porte gel où un peigne de 16 puits a été soigneusement placé. El est laissé jusqu'à polymérisation complète. Le peigne sera soigneusement levé. Le gel solidifié est recouvert par le tampon TAE 1X. Dans chaque puits, une quantité de produit de digestion (20 µl) préalablement mélangé avec du tampon de charge (2µl) (Vf=22 µl) sera déposée. Le dernier puits sera réservé au marqueur de poids moléculaire (5µL). II Migration La migration de l'adn est réalisée à 80V, 64 ma durant 2h30, elle se fait du pôle négatif (cathode) vers le pôle positif (anode). En effet, les acides nucléiques en solution sont chargés négativement à cause de l'ionisation de leurs groupements phosphates, ils se déplacent donc vers l'électrode positive. La vitesse de déplacement des molécules à travers le gel est limitée par la dimension des pores et par conséquent par la taille des molécules, celles de petits poids moléculaires migrent rapidement. 11

14 II Coloration et visualisation Lorsque la migration est terminée, l'alimentation électrique est arrêtée, le gel retiré du porte gel et déposé dans une solution du BET (500 µl de BET dans 1litre d'eau distillée) pendant 30 min, après, 2 lavages successifs de 30 min dans de l'eau distillée sont faits pour éliminer l'excès du colorant. Le BET étant un cation qui s'intercale entre les bases de l'adn, le complexe éthidium/adn est fluorescent sous UV. Ainsi il est possible de visualiser les fragments d'adn dans le gel et de prendre des photos polaroid en noir et blanc. Formule chimique de bromure d'éthidium Le BET est un produit dangereux, qui doit être manipulé avec précautions. 12

15 III. Résultats III.1. Résultats de la PCR-RFLP Les produits PCR amplifiés et digérés représentent les 3 fragments suivants: 1 fragment de 245 pb pour l'homozygote C/C, 2 fragments de 173 et 72 pb pour l'homozygote T/T et 3 fragments de 245, 173 et 72 pb pour l'hétérozygote C/T. Figure 8: photo du résultat de la PCR-RFLP RFLP sur gel d agarose 13

16 Figure 9: photo du résultat de la PCR-RFLP RFLP sur gel d agarose 14