Résumé. Delphine Théard

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1 Delphine Théard Département de Biologie Cellulaire, section Biologie Cellulaire des Membranes, Centre Medical Universitaire de Groningue, Université de Groningue, 9713 AV Groningue, Pays-Bas

2 Résumé Découverte il y a presque vingt ans comme inhibitrice de kinases dépendantes des cyclines (CKI), p27 a été extensivement étudiée, sa perte étant correlée avec un mauvais prognostic lors de cancers. Cependant, certaines études ont montré que, malgré un niveau général d expression élevé, la localisation cytoplasmique de p27 contribue à un mauvais taux de survie. En outre, p27 a été impliquée dans des processus tels que migration et apoptose qui ne requièrent pas son activité de CKI (Philipp-Staheli et al., 2001; Besson et al., 2004). Dans les études présentées dans cette thèse, nous démontrons pour la première fois l implication directe de p27 dans différents aspects de l établissement de la polarité cellulaire apico-basolatérale. Dans les cellules de carcinomes hepatocellulaires HepG2, la cytokine Oncostatin M (OSM), de la famille des IL-6, stimule l établissement de la polarité apico-basolatérale à travers la protéine kinase A en régulant le trafic membranaire vers la surface apicale en développement (van der Wouden et al., 2002). Dans le chapitre 2, nous démontrons que l effet de l OSM sur la polarisation cellulaire dépend de sa capacité à augmenter le niveau d expression de p27 inhibant en conséquence, l activité de cdk2 et donc causant le blocage de la transition G 1 -S. Cette dernière est cruciale pour l efficacité de l OSM comme modulateur du développement de la polarité : une fois que les cellules ont entré la phase S, elles deviennent insensibles aux effets polarisant de l OSM. De plus, le recrutement de la protéine kinase A à la région centrosomale provoquée par l OSM est abolie ainsi que l activation de la route de transport à la surface apicale, dépendante de la protéine kinase A. Ceci, cependant, peut être rétabli par l inhibition pharmacologique de l activité de cdk2. La capacité de l OSM à contrôler l activité de la cdk2 via p27 et, par conséquent, la progression à travers la transition G 1 -S est donc cruciale à cette cytokine pour la régulation de la dynamique centrosomale, le trafic membranaire dirigé vers la membrane

3 Résumé plasmique et la stimulation du dévelopement de la polarité cellulaire. L OSM est une cytokine cruciale pour le dévelopement normal du foie. En particulier, dans les hepatocytes foetaux de rats, il a été démontré que l OSM induit la formation des jonctions d adhérence (AJ) basées sur la E-cadhérine (Matsui et al., 2002). Dans le chapitre 3, nous démontrons que l OSM stimule la phosphorylation de p27 sur la Sérine 10 (Ser-10), conduisant à des investigations concernant l effet de mutants de p27 sur la Ser-10 sur l adhésion intercellulaire. En utilisant différentes approches expérimentales, nous montrons que la phosphorylation de p27 sur la Ser-10 est requise pour la formation du complexe protéique des jonctions d adhérence. En effet, la surexpression d un mutant de p27 non-phosphorylable (S10A) prévient l expression à la surface cellulaire des protéines E- cadhérine et β-caténine constitutives des AJ. Au contraire, la surexpression de la forme native ou d un mutant phosphomimetique de p27 (S10D) induit un phénotype hyper-adhésif. De plus, nous montrons que dans des cellules exprimant la forme non phosphorylable de p27, mais pas les formes natives ou phosphomimetiques, p27 et β-caténine interagissent, au détriment de l interaction β-caténine-e-cadhérine. Il est important de noter que les effets opposés des mutants non phosphorylables et phosphomimétiques ne semblent pas être liés au contrôle du cycle cellulaire medié par p27 (mutant ou non). Ces données démontrent donc pour la première fois que la phosphorylation sur la Ser-10 de la protéine régulatrice du cycle cellulaire p27 contrôle directement la capacité des cellules épithéliales à établir l adhésion inter-cellulaire. Pendant plus de 10 ans, la E-cadhérine a été pensée comme l initiatrice de la biogénèse du complexe de jonctions d adhésion, composé des jonctions d adhérence (AJ) et des jonctions serrées (TJ), entre les cellules. AJ et TJ sont supposées être assemblées suivant le tout premier contact entre deux cellules. Dans le chapitre 4, nous montrons que dans la lignée

4 cellulaire S10A (décrite dans le chapitre 3), qui n exprime pas la E-cadhérine à la surface cellulaire, l établissement de la polarité apico-basolatérale existe toujours. Ces cellules AJ-déficientes présentent toutes les caractéristiques d un domaine apical: les protéines des TJ sont correctement localisées et forment des TJ fonctionnelles. Ces structures assurent leur fonction de clôture ( fence ), qui a pour rôle de séparer les protéines et lipides basolatéraux et apicaux. Elles assurent aussi la fonction de barrière ( gate ) permettant la séparation des milieux extracellulaires apicaux et basolatéraux. L incapacité à former des AJ, cependant, n empêche pas la morphogénèse de la membrane plasmique apicale (canalicule biliaire). De plus, nous observons le passage du ciblage apical de la protéine interne DPPIV, mais pas de la 5 nucléotidase, d une voie indirecte à une voie directe, suggérant un rôle régulateur de la E-cadhérine associée à la surface cellulaire dans le ciblage de certaines protéines apicales. La manière dont la E-cadhérine dirige les différentes voies de distribution apicales reste néanmoins à élucider. Dans l ensemble, ces données démontrent que l adhésion cellule-cellule mediée par la E-cadhérine n est pas indispensable pour la biogénèse de la surface apicale (canalicule biliaire) per se mais pour le remodelage apical ultérieur, et pourrait être impliquée dans la direction de protéines apicales spécifiques et/ou voie de trafic vers le domaine basolatéral. Dans le chapitre 5, nous avons examiné au niveau (ultra)structural l implication de p27 et de son site de phosphorylation Ser-10 sur l organisation de la membrane plasmique apicale. La surexpression de p27 native ou p27s10a résulte en une augmentation dans la fréquence et la longueur des microvilli de la surface apicale. Par contraste, la surexpression de p27s10d produit des microvilli apicaux raccourcis et hautement désorganisées et des lumens apicaux typiquement pâles aux électrons. L apparence de ces lumens apicaux pâles aux électrons est accompagnée d une accumulation subapicale de larges endosomes tardifs/corps multivesiculaires (MVB) et lysosomes

5 secondaires, denses aux électrons. Les effets des mutants de p27 sur la Ser-10 ne peuvent être attribués à son effet connu sur le contrôle du cycle cellulaire. En outre, l inhibition de la signalisation par Rho, une cible de p27 décrite précédemment, n affecte pas l intégrité structurale des lumens apicaux (canalicule biliaire). Cependant, l inhibition de la signalisation par Rho cause l accumulation de lysosomes denses aux électrons qui sont morphologiquement distinguables de ceux présents dans les cellules exprimant p27s10d. Dans l ensemble, nos données impliquent p27 et la phosphorylation de sa Ser-10 comme un nouveau facteur déterminant dans l organisation structurale de la surface apicale et dans la dynamique des endosomes tardifs/lysosomes. En conclusion, p27 joue, dans les cellules HepG2, un rôle crucial dans l établissement de la polarité apico-basolatérale stimulée par l OSM, en régulant l activité cdk2 et, de cette manière, définit clairement une programmation méticuleuse de la progression du cycle cellulaire et du dévelopment de la polarité. De plus, nous démontrons pour la première fois un rôle direct pour p27 et le statut de phosphorylation sur sa Ser-10 dans l établissement de l adhésion intercellulaire, l organisation structurale de la surface apicale et la dynamique des MVB, qui n est pas lié à son rôle connu de contrôle du cycle cellulaire

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