Mort cellulaire 1. Définitions et principes mis en jeu

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1 Mort cellulaire 1. Définitions et principes mis en jeu 2. Caractéristiques morphologiques 3. Rôle physiologique 4. Voies apoptotiques

2 1. Définitions et principes mis en jeu Apoptose Processus physiologique, génétiquement programmé, par lequel les cellules déclenchent leur autodestruction en réponse à un signal externe ou interne 70 milliards de cellules meurent par apoptose chaque jour dans un être humain Nécrose Processus pathologique au cours duquel les cellules ayant subit un dommage déversent des substances toxiques pour les cellules voisines.

3 1. Définitions et principes mis en jeu Les voies de signalisation impliquées dans le contrôle de l apoptose mettent en jeu des mécanismes de nature très diverses - phosphorylations - régulations transcriptionnelles - séquestration ou libération de certains compartiments cellulaires - interactions protéines/protéines homotypiques ou hétérotypiques - agrégations - changements de conformation - dégradation par le protéasome - clivages protéolytiques - La phosphorylation est un phénomène réversible, le clivage protéolytique est un phénomène irréversible (activation des caspases : point de non retour)

4 Mort cellulaire 1. Définitions et principes mis en jeu 2. Caractéristiques morphologiques 3. Rôle physiologique 4. Voies apoptotiques

5 2. Caractéristiques morphologiques Van Cruchten 2002

6 2. Caractéristiques morphologiques Noyau Apoptose Vésicularisation. Condensation chromatine puis coupure internucléosomique Organites Morphologiquement intacts Nécrose Caryolyse. Agrégation et cassure irrégulière de la chromatine Grandement altérés Membrane plasmique Protubérances membranaires Rupture Volume cellulaire La cellule s atrophie La cellule gonfle In situ Une seule cellule peut être affectée Un groupe de cellules est affecté Réponse tissulaire Phagocytose Réaction inflammatoire

7 2. Caractéristiques morphologiques Dommages nucléaires Apoptose Activation de nucléases et coupures entre les nucléosomes (fragments multiples de 200nt) Nécrose Digestion aléatoire de l ADN (fragments de taille aléatoire) Expression génique Essentielle Facultative ADN mitochondrial Intact Digestion précoce Fonction membranaire Milieu intracellulaire Intacte ph légèrement acide Augmentation possible de Ca 2+ ATP nécessaire Perdue ph acide Augmentation de Ca 2+ Perte d ATP

8 2. Caractéristiques morphologiques Nécrose cellulaire Hypoxie Facteur toxique Infection Traumatisme Intégrité membrane plasmique Entrée d eau et d électrolytes Libération de facteurs toxiques Dilatation des organites Fragmentation aléatoire de l ADN Augmentation [Ca2 + ] int (rupture du RE)

9 2. Caractéristiques morphologiques Apoptose cellulaire Fragmentation de la C. en vésicules Corps apoptotiques Pas de réaction inflammatoire Désorganisation du cytosquelette Fragmentation contrôlée de l ADN Phagocytose et nécrose secondaire

10 2. Caractéristiques morphologiques Apoptose cellulaire Utilisation de colorants fluorescents de l ADN «Apoptosis: a laboratory manual of experimental methods»

11 2. Caractéristiques morphologiques Apoptose cellulaire Utilisation de terminal transférase + immunohistochimie = TUNNEL TUNNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase dutp nick end labeling

12 2. Caractéristiques morphologiques Apoptose cellulaire Cytométrie en flux, diffusion du faisceau lumineux

13 2. Caractéristiques morphologiques Apoptose cellulaire Nombre de noyaux Cytométrie en flux + colorant vital fluorescent Noyaux apoptotiques 5% Noyaux apoptotiques 69% Contenu en ADN Contenu en ADN

14 2. Caractéristiques morphologiques Apoptose cellulaire Fragmentation de l ADN génomique au cours du temps

15 2. Caractéristiques morphologiques Apoptose cellulaire Utilisation de l annexine V présentant une affinité pour la phosphatidyl sérine Milieu intracellulaire phosphatidyl sérine

16 2. Caractéristiques morphologiques Apoptose cellulaire Cellule Normale Phospholipide Phosphatidyl sérine Annexine Cellule Apoptotique

17 Mort cellulaire 1. Définitions et principes mis en jeu 2. Caractéristiques morphologiques 3. Rôle physiologique 4. Voies apoptotiques

18 3. Rôle physiologique Homéostasie tissulaire Division cellulaire Mort cellulaire cellules/s cellules/s Ajustement du nombre de cellules Par exemple, neurones versus cellules gliales Contrôle de qualité des cellules Elimination cellules anormales, non fonctionnelles, mal localisées, obsolètes Elimination de cellules endommagées et ne pouvant se réparer

19 3. Rôle physiologique Mise en place des tissus

20 3. Rôle physiologique Homéostasie tissulaire Cellules lactotropes hypophysaires

21 3. Rôle physiologique Homéostasie tissulaire < grossesse Dopamine GS & Allaitement - Dopamine > grossesse Dopamine - Oestradiol + - Prolactine Prolactine Prolactine Cellules lactotropes Prolif & Hyperplasie Apoptose

22 3. Rôle physiologique Echappement à l homéostasie tissulaire : pathologie Inhibition Cancers Accumul Cellulaire Résistance traitements Mal. Autoimmunes Non élimination des clones autoréactifs Infections Non élimination des cellules infectées Activation SIDA Déplétion des Lymphocytes T Mal. neurodégénératives Alzheimer Parkinson Mal. Autoimmune Mort cell. des tissus cibles Lésions ischémiques Infarctus AVC

23 Mort cellulaire 1. Définitions et principes mis en jeu 2. Caractéristiques morphologiques 3. Rôle physiologique 4. Voies apoptotiques

24 Signal ExC Protéases initiatrices Signal IC Caspases : Enzymes clefs Protéases amplificatrices Protéases effectrices Substrats

25 Les cascades d activation des caspases 1 molécule de caspase initiatrice Multiples molécules de caspase effectrices Clivage de protéines cytosoliques Clivage de lamin nucléaire

26 Les cascades d activation des caspases CASPASE : Cystein ASPartic acid protease 14 isoformes chez l homme Leur site actif contient une cystéine: QACXG Elles coupent les liaisons peptidiques après un acide aspartique Asp Xxx La nature des résidus en amont de l acide aspartique confère leur spécificité aux caspases

27 Les cascades d activation des caspases Pro-domaine de longueur variable : long = procaspase initiatrice Domaines séparés par des résidus aspartate Enzyme activée par protéolyse régulée et tétramérisation Pro-domaine Gde SU Pte SU Cibles cellulaires Couzinet 2002

28 Les cascades d activation des caspases

29 Les cascades d activation des caspases Plateformes d activation des caspases effectrices DED Death Effector Domain CARD Caspase Recruitement Domain Caspases 8 & 10 Caspases 2 & 9 DISC (Death-Inducing Signaling Complex) Apoptosome

30 Les cascades d activation des caspases Régulation de l activité caspasique Localisation sub-cellulaire Modulation de leur expression (transcription) et des isoformes (procaspase 9b inhibitrice & procaspase 2L activatrice) Modifications post-traductionnelles bloquant l activité (nitrosylation (caspase 3) & phosphorylation (caspase 9)) Interaction avec les inhibiteurs (IAP, FLIP) IAP= Inhibitor of Apoptose Protein (voie intrinsèque) FLIP= FLICE inhibitory protein, inhibe caspase 8 (voie extrinsèque)

31 Les cascades d activation des caspases Le phénotype apoptotique est obtenu par clivage de divers substrats des caspases, par exemple : - bourgeonnement de la membrane - clivage et activation de la kinase ROCK1 (phosphoryle la cofiline et l inhibe) - dégradation internucléosomale de l ADN par ICAD - clivé par caspase 3 & activation de l endonucléase CAD - désorganisation des filaments d actine (détachement de la C. apoptotique) - clivage et activation de la gelsoline - fragmentation du noyau - clivage des lamines A, B1 et C - inactivation de nombreuses protéines kinases (Akt, Raf-1, IKKb, MEKK1)

32 Les cascades d activation des caspases

33 Voie extrinsèque Lc killer Lc killer Ligand adaptateur Aggrégation et coupure des procaspase Caspase active Cell. cible Procaspase inactive Cell. apoptotique Alberts 17-39

34 Voie extrinsèque Exemple d un ligand (TNF) Trimérisation des récepteurs TNFR Recrutement de protéines adaptatrices Auto-activation de la caspase 8 Recrutement de protéines de signalisation

35 Voie extrinsèque Lc killer Ligand fas Récepteur de mort fas Lc killer Adaptateur FADD Eff dom de mort Procaspase 8/10 Dom de mort Eff dom de mort Caspase 8/10 activées Caspase exécutantes Cell. apoptotique Cell. cible Assemblage de DISC Death Inducing Signaling Complex Activation et clivage procaspase 8/10 Mol Biol C. 18-6

36 Voie extrinsèque

37 Voie extrinsèque Compétition entre signalisation par NF-kB & FLIP et par l endocytose de DISC Complexe DISC SURVIE Inhibiteurs APOPTOSE Micheau & Tschopp 2003

38 Voie extrinsèque Plusieurs niveaux de modulation de la signalisation des récepteurs de mort cellulaire Au niveau des récepteurs Glycosylations Transcription de récepteurs de mort (Fas et TRAIL-R) induite par p53 après un dommage à l ADN Transcription de leurres: récepteur sans domaines DD ou avec un domaine DD non fonctionnel Signal de mort non transmis apoptose

39 Voie extrinsèque Plusieurs niveaux de modulation de la signalisation des récepteurs de mort cellulaire Au niveau du cytosol Récepteur FADD ou Casp8 DD Protéine SOOD (silencer of death domain protein) sans DED DED DED FLIP DED Flash DEDD Signal court-circuité +++ apoptose

40 Voie intrinsèque Cytochrome C Adaptateur Aggrégation adaptateurcytochrome-procaspase Caspase active Mitochondrie altérée dans la cell. cible Liaison cytochrome & adaptateur Procaspase inactive Coupure des Procaspase Cell. apoptotique Alberts 17-39

41 Voie intrinsèque Quel choix? Survie ou apoptose? Pores mitochondriaux fermés Survie

42 Voie intrinsèque Cytochrome C GFP Marqueur mitochrondrial Normal UV Mol Biol C. 18-7

43 Voie intrinsèque Quel choix? Survie ou apoptose? Pores mitochondriaux ouverts apoptose

44 Voie intrinsèque Prot. antiapoptotiques Bc2 Prot. proapoptotiques BH123 Bcl2, Bcl-X L Bax, Bak Bcl2 Bcl2 Bcl2 Bax Survie Prot. proapoptotiques BH3 Bad, Bim, Bid, Puma, Noxa Protéines Bc2 Bax Bax Apoptose Mol Biol C. 18-9

45 Voie intrinsèque Voie inactivée Bcl-2 active BH 123 inactive Cytochrome C

46 Voie intrinsèque Voie activée Stimulus apoptotique Bcl-2 inactive Fuite des protéines BH 3 active BH 123 aggrégée active Cytochrome C

47 Voie intrinsèque Apaf1 Domaine CARD Domaine CARD Procaspase 9 Cytochrome C datp Assemblage apoptosome (largage ADP) Activation caspase 9 Activation des caspases par caspase 9 Apaf 1 Apoptotic protase activating factor 1 CARD CAspase Recruitment Domain Mol Biol C. 18-8

48 Voie intrinsèque Régulation de Bad : phosphorylation et séquestration IL3 Récepteur IGF-1 IGF-1 R Privation en facteur de croissance PI3K PI3K bloqueur P P Bad P P P Bad P Phosphatases Signalisation de survie Kinases (Akt, PKA ) Bax Bclx L Bad Carence de signalisation de survie D après Desagher

49 D après Desagher 4. Voies apoptotiques Voie intrinsèque Régulation de Bid : phosphorylation et clivage Phosphatase Caspase initiatrice Bid tbid Kinases P P Bid P P Apoptosome Bax Bcl-2 Caspases effectrices

50 Voie intrinsèque Stress oxydatif Privation en facteur de croissance Radiations Toxines Drogues anti-cancéreuses Détachement de la matrice extracellulaire Cascades de signalisation Famille de Bcl-2 Cyt C p53 p53 Activation des caspases Lésions de l ADN apoptose D après Desagher

51 Voie intrinsèque p53 sensibilise à l apoptose via Bax pro-apoptotique Bax Bcl2 Bid Bcl2 p53 Bcl2 Bax p53 Bcl2 Bax Bid Lève l inhibition de Bax Libération de protéines BH3-Like apoptose

52 Voie intrinsèque Bax Bcl2 p53 Bcl2 p53 inactif par interaction avec Bcl2 PUMA Bcl2 Bax p53 PUMA Bcl2 Bax p53 Liaison directe à Bax Liaison directe à Bax apoptose

53 Conclusion Apoptose : balance des populations cellulaire ; dérèglement = déséquilibre des populations Apoptose normale, mort cellulaire programmée : formation de l être pluricellulaire, survie de l être pluricellulaire, l ajustement de populations cellulaires Apoptose anormale : anomalies d embryologie, survie de cellules anormales

54 Conclusion Induire l apoptose dans des cellules cancéreuses via les récepteurs de mort cellulaire Causer l apoptose des cellules cancéreuses plutôt que la mort par toxicité : beaucoup de chimiothérapie induisent une apoptose à laquelle les cellules résistent en dépit de lésions de l ADN Intérêt d un ciblage : * induire une apoptose en court-circuitant des contrôles internes tels que p53 * activation de caspases initiatrices même si bcl2 très exprimé (cf + loin) Limites à cibler les récepteurs au TNF par du TNF ou par des anticorps anti fas : le développement d effets secondaires notables Les perspectives sont plus prometteuses pour les récepteurs de mort cellulaire TRAIL-R et TRAIL Induire l apoptose dans des cellules cancéreuses via des cibles intracellulaire Ciblage de bcl2 souvent surexprimé dans les cellules cancéreuses les protégeant de l apoptose : inhibiteurs de bcl2 Ciblage des inhibiteurs des caspases : inhibiteurs pour bloquer l inhibition

55 Conclusion Aspects thérapeutiques induire l apoptose dans des cellules cancéreuses via des cibles intracellulaire Ciblage de bcl2 souvent surexprimé dans les cellules cancéreuses les protégeant de l apoptose : inhibiteurs de bcl2 Ciblage des inhibiteurs des caspases : inhibiteurs pour bloquer l inhibition