ATELIER TECHNIQUE L'ELECTROPHORESE DES PROTEINES SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE EN PRESENCE DE SDS (SDS PAGE) proposé par

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1 ATELIER TECHNIQUE L'ELECTROPHORESE DES PROTEINES SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE EN PRESENCE DE SDS (SDS PAGE) proposé par La Faculté des Sciences Exactes et Naturelles (UFR SEN) (Campus de Fouillole, Pointe à Pitre - Guadeloupe) aux Enseignants de l'association des Professeurs de Biologie et de Géologie (APBG) de Guadeloupe le Mercredi 23 février 2005 de 14:00 h à 17:00 h salle EB 27 Bât. Enseignement Campus de Fouillole organisé par Jérôme Guerlotté, Professeur, jerome.guerlotte@univ-ag.fr Nicole Laurent, Maître de conférences, nicole.laurent@univ-ag.fr Patrick Jean-Louis, Technicien

2 Planning de l'atelier d'électrophorèse ---- Séparation par électrophorèse SDS sur gel de polyacrylamide (SDS PAGE) des protéines du blanc d'oeuf 14:00 h : Accueil 14:15 h : Présentation du matériel Montage de la cuve d'électrophorèse 14:30 h : Préparation du gel de séparation 15:00 h : Coulage du gel de séparation Arrêt de la migration du gel témoin Démoulage du gel témoin et coloration 15:30 h : Préparation du gel de concentration 16:00 h : Préparation des échantillons Charger les échantillons Lancer la migration 16:30 h : Décoloration du gel témoin 17:00 h : Exploitation des résultats : Tracer la courbe du logarithme de la masse moléculaire en fonction de la distance de migration.

3 L'Oeuf L 'œuf est réputé depuis fort longtemps comme un aliment de haute qualité pour l'homme. Exposer les connaissances acquises sur l' œuf du point de vue nutritionnel revient à choisir dans le contexte occidental pour modèle quasi-exclusif l'œuf de poule (Gallus domesticus). STRUCTURE ET COMPOSITION DE L'ŒUF Œuf entier Les principales parties de l'œuf sont de l'intérieur vers l'extérieur : le jaune ou vitellus, le bianc ou albumen, les membranes coquillères (interne et externe) et la coquille. Les parts relatives de chacun de ces constituants peuvent varier dans des proportions importantes. Les valeurs moyennes applicables à un œuf de poule sont : coquille 9,5 %, blanc 61,5 %, jaune 29,0 %. L 'œuf entier renferme environ 66 % d'eau, Il % de matières minérales et 23 % de substances organiques (12 % de protéines : Il % de lipides). Composition du blanc d'oeuf Le blanc est composé en quasi-totalité d'eau et de protéines, avec quelques minéraux, ce qui représente une grande originalité pour un 'produit d'origine animale (90 % de matière sèche sont des protéines). Il renferme également du glucose libre (deux fois plus concentré que dans le plasma sanguin) qui constitue la première source d'énergie utilisable par l'embryon. Chaque protéine est connue pour des propriétés spécifiques, fonctionnelles ou nutritionnelles (tabl. 6.1). Ainsi: - L'ovalbumine, la protéine la plus abondante de l'albumen, est une phosphoglycoprotéine. Elle contient 3,5 % de glucides et le nombre de moles de phosphate liées aux résidus de sérine varie de 2 à O. La molécule renferme 4 groupements SH libres et 2 ponts disulfure mais le nombre de ces derniers augmente au cours de l'entreposage et il se forme une "S-ovalbumine" plus thermostable que la protéine native. La proportion de S- ovalbumine qui est de 5% au moment de la ponte peut atteindre 80 % après un stockage de 6 mois au froid. - La conalbumine (ou ovotransférine) est une glycoprotéine constituée de deux sous-unités. Elle a la capacité de complexer les cations métalliques bi- et trivalents. Au phi, une molécule peut fixer 2 cations et prend une coloration rouge (Fe 3+ ) ou jaune (Cu 2+ ). Ces complexes métalliques sont plus thermostables que la protéine native. - L'ovomucoïde est une glycoprotéine constituée de trois sous-unités. Elle est thermoresistante sauf en milieu alcalin et possède une activité anti-trypsique. - Le lysozyme est une holoprotéine au phi très élevé. Elle possède une activité enzymatique β-glucosaminidasique qui lui permet de lyser la paroi des bactéries Gram +. - l'ovomucine est une glycoprotéine dont la teneur en glucides est proche de 30 %. La structure étirée de la molécule s'explique par les répulsions électrostatiques dues aux charges négatives des résidus d'acide sialique responsables de la viscosité de la couche gélifiée de l'albumen, cette protéine est insoluble dans l'eau et soluble dans les solutions salines de ph supérieur ou égal à 7.

4 PROTOCOLE D'ELECTROPHORESE (SDS PAGE) SELON LAEMMLI Solutions utilisées : Tampon du gel de concentration : Tris-HCl, 1 M ph 6,8 Tampon du gel de séparation : Tris-HCl, 1 M ph 8,8 Tampon de dénaturation (2X) : Tris-HCl, 0,125 M ph 6,8 Glycérol 20% SDS 4% Bleu de bromophénol 0,2% β-mercaptoéthanol 10% Tampon de migration : Tris 25 mm Glycine 192 mm SDS 0,1% Solution de coloration : Bleu de Coomassie R250 0,25% acide acétique 20% Isopropanol 20% H % Solution de décoloration : acide acétique 10% Isopropanol 45% H % Dénaturation des échantillons Dans des microtubes (1,5ml) Eppendorf dont le bouchon a été percé à l'aide d'une aiguille, mettre successivement : - 20 µl de solution protéique des fractions ( 0,5 mg/ml) - 20 µl de tampon de dénaturation (2x) Préparer les échantillons de standards de poids moléculaires Porter tous les échantillons à ébullition pendant 4 minutes. Montage du gel dans la cuve Enlever le peigne délicatement sans déchirer le gel de séparation Enlever le joint et monter les plaques dans la cuve. Les appliquer contre la facade de la cuve et les serrer avec des pinces. Remplir de tampon de migration les deux bacs de la cuve.

5 Dépôt des échantillons et migration : Déposer 10 à 50µl d'échantillon protéique dénaturé par puits à l'aide d'une micropipette P 20. Connecter les électrodes au générateur, (le + en bas du gel). Faire migrer à 30mA pendant 3 à 4 heures, jusqu'à ce que le front de Bleu de Bromophénol atteigne le bord du gel. Coloration/ décoloration : Démouler le gel - incuber 30 mn à 1 h dans la solution de coloration sous agitation - incuber 3 fois 30 minutes dans la solution de décoloration sous agitation Le gel peut être conservé dans une solution aqueuse d'acide acétique à 5%. Exploitation des résultats : - Représenter l'électrophorégramme sous forme d'un schéma à l'échelle sur lequel figureront le distances de migration. - Tracer la courbe du log de la masse moléculaire en fonction de la distance de migration. - Discuter les résultats.

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