Diagnostic rapide de la mammite clinique

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1 Diagnostic rapide de la mammite clinique Jean-Philippe Roy 1, Jodi-Ann Wallace 2 & Caroline Vézina 3 1 Professeur adjoint, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Montréal 2 Clinique vétérinaire Ormstown et étudiante M.Sc., FMV 3 Productrice, Ferme Tranquillity, Brownsburg-Chatham Colloque sur la santé des troupeaux laitiers 12 décembre 2007, Québec Atelier mammite

2 Introduction La mammite clinique = raison #1 pour l usage des antibiotiques chez les vaches (Erskine et al., The Vet. Clinics of N.A., 2003) En basant certaines décisions de traitement sur les résultats bactériologiques, l utilisation d antibiotiques peut être significativement diminuée (Silva, NMC, Proc. 2004) Une réduction de l usage des antibiotiques aiderait à : 1) prévenir les pertes de lait 2) réduire le risque d avoir des résidus dans le lait 3) améliorer les taux de succès des traitements en raison de traitements mieux ciblés (Neeser et al., JAMVA, 2006)

3 Situation actuelle Actuellement, la bactériologie standard du lait permet peu d aider à la prise de décision pour le traitement des mammites cliniques (délais 2 à 5 jours) Il y a maintenant des outils diagnostiques rapides de la mammite disponibles Comment intégrer ces outils dans la gestion de la santé du pis à la ferme ou en clinique vétérinaire?

4 Les pathogènes retrouvés sur 500 cas de mammite clinique Catégorie de traitement n (%) Aucune croissance 116 (23,3) Gram positif 277 (55,4) Gram négatif 92 (18,4) Autres (levures/algue) 15 (3) Total 500 G. Keefe, (RCRMB, cohorte nationale)

5 Pas de croissance 20 à 50 % des échantillons Causes : Élimination spontanée des bactéries Excrétion cyclique des bactéries Faible nombre de colonies (< 100 CFU/ ml) Bactéries phagocytées

6 Les agents pathogènes qui causent la mammite Gram positif Gram négatif Autres Staphylococcus spp. Escherichia coli Mycoplasma spp. Staphylococcus aureus Klebsiella spp. Levures Streptococcus uberis Enterobacter spp. Prototheca Streptococcus dysgalactiae Serratia spp. Streptococcus agalactiae Pasteurella spp. Corynebacterium bovis Proteus spp. A. pyogenes Pseudomonas spp.

7 Outils diagnostiques

8 Minnesota Bi-plates Développé par Université du Minnesota Milieu sélectif : MacConkey et gélose au sang avec 1 % esculine Permet classification des bactéries en Gram + ou Gram - Parfois, peut permettre ID Staph aureus

9 Minnesota Tri-plates Développé par l Université du Minnesota Permet identification Gram +, Gram et streptocoques Parfois peut permettre ID Staph aureus

10 Petrifilm Milieux de culture sélectifs de 3M Microbiologie Utilisés présentement dans le secteur alimentaire (Tassinari et al, Food Quality Magazine, 2006; Ingham et al., J.Food Prot., 2003) Plaques Staph Express (STX) ID Staph. aureus 22-26h - résultats finaux Num. Aérobie (PAC) ID aérobies (Flore totale) (Streptocoques) 24h & 48h - résultats

11 Petrifilm Num. rapide des Coliformes (RCC) ID Coliformes Changement couleur 6-12h 24h résultats finaux Num. Coliformes (CC) ID Coliformes 24h résultats finaux

12 Mise en garde La qualité de l échantillon de lait prélevé est primordiale La technique de prélèvement doit être le plus stérile possible afin d éviter la contamination de l échantillon et une interprétation erronée

13 Application à la ferme Mammite clinique

14 Mammite Clinique Pas de FIÈVRE, appétit normal = Mam. Grade 1-2 : prendre échantillon, attendre résultats pour TX Examen Ensemence 1cc de lait sur 1.STX 2. CC FIÈVRE et/ou ne mange pas = Mam. Grade 3 : traitement avec antiinflammatoires, fluides, surveille, +/- antibiotiques, ± prendre échantillon Positif S. aureus Négatif S. aureus, Positif croissance Positif Coliformes Vérifie CCS Si chronique, haut CCS; Aucun tx, ségrégation, réforme Nouvelle infection: 1 er cas, un quartier, lactation 1 ou 2, bas CCS : Thérapie prolongée Croissance G+ : Vérifie CCS et histoire de mamm, Tx IMM produit homologué Aucun Ab IMM; Tx avec antiinflammatoires, fluides et surveille

15 S il n y a aucun changement envoyer échantillon congelé au laboratoire pour une bactériologie standard

16 Pas de FIÈVRE, mange bien = Mam. Grade 1-2 : prendre échantillon, attendre résultats pour TX Examen Mammite Clinique FIÈVRE et/ou mange pas = Mam. Grade 3 : traitement avec antiinflammatoires, fluides, surveille, +/- antibiotiques, +/- prendre échantillon Ensemencer sur Tri-plate Croissance dans zone rouge et brune; Strep. spp. = Tx avec Ab IMM Croissance dans zone G+ seulement : S. aureus ou Staph. spp. Croissance dans zone G-; Aucun tx Ab, continuer les fluides, anti-inflam. et surveille Staph. aureus: Vérifie CCS Si chronique haut CCS = Aucun tx, ségrégation, réforme Ou Staph. aureus: 1er cas, un quartier, lactation 1 ou 2, bas CCS : Thérapie prolongée Staph. spp. Tx avec Ab IMM et surveille Adapté de L.Tikofsky

17 S il n y a aucun changement envoyer échantillon congelé au laboratoire pour une bactériologie standard

18 Application à la ferme Dépistage du Staph. aureus

19 Dépistage de Staph. aureus au vêlage : Ferme XYZ Vêlage, haut CCS, achats + Prendre échantillon CMT Ensemence 1cc de lait sur Petrifilm STX congèle l échantillon Composite ou Surveille CCS S. aureus - Aucune croissance S. aureus + Négatif S. aureus, Positif croissance Vérifie CCS Si chronique haut CCS = Aucun tx, ségrégation, réforme Nouvelle infection : 1 er cas, un quartier, lactation 1 ou 2, bas CCS = Thérapie prolongée Croissance G+ : Vérifie CCS et histoire de mammites Tx IMM produit homologué S il n y a aucun changement envoyer échantillon congelé au laboratoire pour bactériologie standard Surveille CCS

20 Résultats d études

21 Mammite Clinique Pas de FIÈVRE Mam Grade 1-2 : prendre échantillon, attendre pour résultats de culture Examen FIÈVRE Mam. Grade 3 : prendre échantillon, traitement avec anti-inflammatoires, fluides, surveille Culture standard à la ferme S. aureus S. ag. Staph. spp Strep. spp Coliformes Pas de croissance ATB IMM, ségrégation, réforme ATB IMM ségrégation ATB IMM ATB IMM Pas ATB Antiinflammatoire, surveille Pas ATB Antiinflammatoire, surveille

22 Résultats Diminution 80 % de l usage des antibiotiques lors de mammites cliniques 55 % pas de croissance, 25 % Gram Souvent signes de mammite absents 24h plus tard TX = pas de retour plus rapide en production, pas moins de quartiers perdus, lait anormal aussi longtemps

23 Résultats d étude Étude Université du Wisconsin, 2004 Implantation d un protocole de traitement avec cultures du lait sur STX, CC, PAC 600 vaches Comparaison des résultats de culture à la ferme avec et sans protocole de traitement

24 Mammite Clinique Pas de FIÈVRE Mam. Grade 1-2 : prendre échantillon, attendre pour résultats de culture Examen Ensemencer 1cc de lait sur 1. STX 2. CC 3. PAC FIÈVRE Mam. Grade 3 : prendre échantillon, traitement avec anti-inflammatoires, fluides, +/- antibiotiques & surveille Vérifie CCS Si chronique haut CCS; Aucun tx, ségrégation, réforme Positif S. aureus Nouvelle infection: 1 er cas, un quartier, lactation 1 ou 2, bas CCS: Thérapie prolongée Négatif S. aureus, Positif croissance PAC + Croissance G+: Vérifie CCS et histoire de mamm., Tx IMM produit homologué Positif Coliformes ou aucune croissance Aucun Ab IMM; Tx avec antiinflammatoires, fluides et surveille

25 Résultats d étude Résultats Sans protocole (n=100 cas) Avec protocole (n=267 cas) P value Jours lait jeté 19,7 7,8 <0,001 # tubes IMM/cas 33,3 5,3 * <0,001 Cas qui reçoit tubes IMM Coût des tubes et lait jeté / cas 87 % 33 % <0, $ 90 $ *une partie de la réduction est due à une changement des tubes IMM à 1x/jr

26 Impact économique Étude Iowa State : Coût par 100 animaux présentant une mammite clinique Traitement tous les cas : 285 $/100 cas Traitement basé sur la culture : 99 $/100 cas Le succès thérapeutiques n était pas différent entre les groupes malgré un délai de 24 heures

27 Impact économique Université de Cornell : Un troupeau de 100 vaches peut économiser $ par an en utilisant les traitements basés sur les résultats de culture Si traitement seulement des streptocoques, économie jusqu à $ par an

28 Avantages d un programme de contrôle incluant des traitements basés sur les résultats de culture Réduction des coûts des Ab Réduction du risque de résidus dans le lait Réduction des pertes de lait car moins de cas traités avec Ab Réduction du délai d attente pour la réforme

29 Avantages de faire la culture à la ferme ou en clinique vétérinaire Accessibilité du laboratoire fins de semaine et congés Rapidité Résultats préliminaires sont disponibles en 24h

30 Limitations Ne permet pas l identification des mycoplasmes Les levures peuvent croître sur les plaques comme un Gram + mais le traitement antibiotique risque d empirer la situation

31 Coûts Bi-plate : 1,75 $ Tri-plate : 2,80 $ Plus frais de transport

32 Coûts ($) Petrifilm Staph Express Staph Express Disques Petrifilm Coliformes Petrifilm Coliformes Rapides Petrifilm Count Aérobique Pipettes stériles Tubes de dilution Boîte Caisse 2,34 1,99 1,53 1,37 1,00 0,81 2,14 1,65 0,91 0,76 0,17 1,10

33 Coûts de démarrage EQUIPEMENT COÛTS ($) Incubateur (aérobie) 37 O C Réfrigérateur/Congélateur Applicateurs stériles Matériel pour prise d échantillons de lait Variable Pièce propre, tempérée, bien éclairée Variable Poubelle pour déchets bio-médicaux Variable MEDIA

34 Matériel additionnel Microscope et coloration Gram Test coagulase Autres tests biochimiques

35 Prix des incubateurs HovaBator ~ 125 $ Ranch Cunicole St-Hyacinthe, QC Incubateur portatif ~ 100 $ Compact Incubator # Certified Incubator Thermometer # Nelson Jameson Incubateur de laboratoire 557 $ Disponible chez 3M

36 Conclusions Ces systèmes de culture ne remplacent pas les laboratoires commerciaux car ils ne permettent pas d identifier tous les pathogènes présents La mise en place d un protocole de traitement et de prévention adapté à la ferme est primordiale (collaboration producteur - médecin vétérinaire)

37 Conclusions Permettraient une utilisation plus rationnelle, économique et responsable des antibiotiques Les milieux de culture sélectifs Petrifilm et Bi & Tri-plates ont le potentiel d être des outils diagnostics importants à la ferme ou en clinique vétérinaire

38 Ferme Tranquillity

39 Ferme Tranquillity < 2004 : 35 vaches en stabulation attachée 2004 : nouvelle étable 6 rangées, 130 logettes 115 vaches en lactation Salon de traite D-8 Westfalia-Surge

40 Ferme Tranquillity

41

42 Ferme Tranquillity 2005 : augmentation des mammites cliniques Mammites Grade 3/Sévères Envoyer plusieurs échantillons au laboratoire Mycoplasmes Les vaches positives pour Mycoplasmes = Réforme Échantillon du réservoir mensuellement pour prévention Ne pas congeler le lait pour l analyse des mycoplasmes

43 Ferme Tranquillity Été 2005 : Beaucoup de mammites environnementales; Gram négatifs (coliformes), et des streptocoques On a réalisé que les traitements IMM avec Ab de tous les cas de mammite n étaient pas efficaces ou économiques Commande de Tri-plates de Minnesota

44 Ferme Tranquillity Tri-plates Commande 15 Tri-plates à la fois Coût : 2,80 $/plaque + coût de transport ~ 77 $ pour 15 = 5,13 $/plaque Achat Hova-Bater Applicateurs coton-tige Tubes d échantillon pour le lait Période d entraînement Un guide d utilisation (en anglais seulement) Suggère de travailler avec votre vétérinaire

45 Les Tri-plates se conservent au frigo Congélation des échantillons (sauf pour mycoplasmes)

46 L incubateur

47 L incubateur

48 L incubateur

49 Notre expérience On traite beaucoup moins de cas de mammite avec des antibiotiques $$$ épargnés Un autre outil très important pour gérer la santé du pis Bonus : les résultats sont disponibles en 24h permet réagir rapidement Avertissements : - L entraînement est essentiel - Quand vous êtes dans le doute : envoyer l échantillon congelé au laboratoire

50 Procédures de mise en culture Se laver les mains Assainir la surface de travail Sortir le matériel Sortir les échantillons Identifier les plaques Inoculer les plaques Incuber C

51 Technique d ensemencement et interprétation Bi-plates & Tri-plates

52 Technique d ensemencement : Bi-plates / Tri-plates Prendre l échantillon de lait Mélanger l échantillon Tremper l applicateur coton-tige dans le lait & ensemencer sur chaque compartiment du média (retremper entre chaque section) Incuber pour C Lecture des plaques pour la croissance bactérienne

53 1 2 3

54 Technique d interprétation : Bi-plate Croissance sur le coté rouge (gélose au sang) = Gram + Est-ce qu il y a une zone claire (hémolyse) autour de la colonie? OUI = Probablement S. aureus NON = prob. Staph spp. ou Strep.

55 Technique d interprétation: Bi-plate Croissance sur le côté rose (MacConkey) = Gram - Est-ce que la colonie est rose-sec, et la zone autour de la colonie peut être rose? OUI = Probablement E. coli

56 Interprétation : Bi-plate Est-ce que la colonie est rose-pâle/blanc, et a l air muqueux/gluant? OUI = Klebsiella

57 Technique d interprétation : Tri-plate Croissance sur le coté MTKT (brun) = Juste les Streptocoques Laisse à la température de la pièce pour 30 min (pour la réaction esculine) Strep. dysgalactiae : colonie bleue-grise avec aucune hémolyse Strep. uberis : colonie très foncée ou noire

58 Interprétation : Tri-plate

59 Interprétation : Tri-plate

60 Interprétation : Tri-plate

61 Interprétation : Tri-plate MacConkey

62 Tri-plates à la ferme Tranquillity

63 S. aureus positif NÉGATIF NÉGATIF

64 Staph. spp. Staph. spp.

65 Strep. spp. Gram - : Aucune croissance Strep. spp. ou Strep. uberis

66 Strep. uberis

67 Strep. dysgalactiae

68 Technique d ensemencement et d interprétation : Petrifilm STX, RCC, CC, PAC

69 Technique d ensemencement et d interprétation Petrifilm - STX 1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la plaque, déposer 1ml de lait au centre de la plaque 2. Abaisser délicatement la pellicule supérieure de haut en bas vers l échantillon pour empêcher que des bulles d air ne s infiltrent (Ne pas laisser tomber la pellicule) 3. Répartir l inoculum uniformément en zone circulaire en exerçant une légère pression avant que le gel ne se solidifie 4. Incuber les plaques en piles de 20 max à 35 C 24 heures +/- 2h

70 Technique - STX 5. Lecture des plaques à 24 ± 2 heures 6. Si croissance de colonies Soulever la pellicule supérieure & mettre un disque de Staph Express. Glisser fermement un doigt sur le dessus de la pellicule 7. Lecture 1-3 hr après (suggère 3h) Compter toutes les zones roses, qu une colonie soit présente ou non

71 Interprétation : Staph Express Petrifilm (STX) : Détection : S. aureus Si seulement des colonies rouges-violacées sont présentes : Colonies rouges-violacées sont comptées comme des S. aureus

72 Interprétation : STX Utilisation du disque Colonies autres que rouges-violacées sont présentes Disque est inséré Plaque et disque sont incubés à 35 C de 1-3 heures Les zones roses de DNase sont comptées comme des S. aureus

73 1 ml en plaque direct 150 et + colonies, colonies sont petites et les zones sont aussi très petites. Dilution 1: zones roses présentes Rapporter UFC/ml

74 Staph. spp.

75 Technique RCC &CC 1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la plaque déposer 1ml de lait au centre de la plaque 2. Abaisser délicatement la pellicule supérieure de haut en bas vers l échantillon pour empêcher que des bulles d air ne s infiltrent (Ne pas laisser tomber la pellicule) 3. Répartir l inoculum uniformément en zone circulaire en exerçant une légère pression avant que le gel ne se solidifie 4. Lecture des plaques : RCC : À 6-14h : noter un changement de couleur (les zones acides jaunes avec ou sans centre rouge) (Oui ou Non) RCC & CC : À 24h : noter le nombre de colonies et le nombre de types de colonie (1 ou 2)

76 Interprétation : Num. rapide des coliformes (RCC) : Num. des coliformes par les zones acides (6-14 heures) Dénombrer les zones acides jaunes avec ou sans centre rouge comme des coliformes

77 Interprétation : RCC Num. des coliformes par les zones acides (6-14 heures)

78 Interprétation : RCC = TNTC

79 Plaque coliformes totaux Petrifilm (CC) Détection : Coliformes (bâtonnets Gram ) Interpréter : Toutes colonies rouges avec gaz (bulle d air)

80 1 ml en plaque direct Beaucoup de gaz et de petites colonies TNTC Dilution 1: coliformes Rapporter 1250 UFC/ml UFC/ml = (Nb de bactéries X facteur de dilution) / Nb ml mis en culture

81 Technique d ensemencement et d interprétation Petrifilm - PAC 1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la plaque, déposer 1ml de lait au centre de la plaque 2. Déposer la pellicule supérieure en la laissant tomber. Ne pas la déposer en la déroulant 3. Poser un étaleur, coté strié vers le bas, sur la pellicule supérieure de l inoculum. Appliquer une légère pression sur l étaleur afin d étaler l inoculum sur la zone circulaire. Ne pas tourner ni faire glisser l étaleur 4. Lecture des plaques PAC : À 24 h : noter le nombre de colonies

82 Technique d interprétation : PAC

83 Est-ce applicable dans votre ferme ou votre clinique? 1. Est-ce que vous avez des protocoles différents pour des types d infections différentes? 2. Est-ce que vous avez une personne fiable qui aura le temps de faire les cultures? 3. Est-ce que vous avez un nombre d échantillons suffisant de mammite/vêlage/aug. CCS pour qu une personne développe une expertise? 4. Est-ce que les producteurs et médecins vétérinaires sont prêts à embarquer dans ce type de protocole?

84 Petrifilm ou Bi-plate/Tri-plate? Cela dépend de votre troupeau Le nombre de vaches, le nombre de cas cliniques et sous-cliniques Durée de vie du milieu de culture La prévalence des différentes bactéries (S. aureus vs streptocoques vs coliformes) Vos objectifs en santé du pis Mammite clinique Mammite sous-clinique : Contrôle S. aureus

85 Parlez-en à votre médecin vétérinaire!