Nom : Groupe : 18 avril 2016 Test 3OC (45 ) B. Emery Génétique moléculaire des procaryotes COPAD

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1 Nom : Groupe : 18 avril 2016 Test 3OC (45 ) 3BCoc B. Emery Génétique moléculaire des procaryotes COPAD Aucun document autorisé (ni personnel, ni fourni). Les réponses doivent figurer sur l énoncé. Écrivez très lisiblement et dans un français correct, merci. 1. Pour fabriquer des tablettes pour lave-vaisselles, on utilise des enzymes produites par des bactéries. Mais l utilisation d une haute température de lavage, détruit ces enzymes et les empêche de fonctionner. Toutefois, certaines bactéries (les extrémophilles) vivent à haute température (~70 C) et leurs enzymes résistent très bien à celle-ci. Malheureusement, la culture des extrémophilles est compliquée. On cherche donc à transférer les gènes produisant certaines enzymes digestives (comme l Aminopeptidase T, qui dégrade les protéines) de Thermus (ou Thermophilus) aquaticus (un extrémophille), dans Escherichia coli (une bactérie intestinale dont la température de croissance est de 37 C et facile à transformer). Le gène de l aminopeptidase T (M29) n est pas dans un opéron polycistronique, mais est un gène isolé (monocistronique). Un bout d ADN de T. aquaticus (comprennant la séquence codante de M29 ainsi que 500 pb. en amont et en aval de cette séquence) est introduit dans un plasmide (contenant uniquement une origine de réplication et un gène de résistance à un antibiotique). Le plasmide est ensuite transféré dans une souche E. coli. La production d aminopeptidase T par une bactérie transformée est finalement analysée. Malheureusement malgré l introduction du gène M29 dans la bactérie, celle-ci ne produit pas l enzyme. Après analyse du gène de M29, il se trouve que le codon d initiation (habituellement AUG) a été remplacé par un autre (GUG) chez T. aquaticus, ce qui empêche la traduction par E. coli de la protéine. a) Supposons qu on modifie le codon d initation en le remplaçant par AUG dans le plasmide précédant, est-ce que E. coli produira forcément la protéine? Justifiez (1pt) Page 1/4

2 b) Décrivez la procédure de fabrication d un plasmide recombinant qui garanti la production d aminopeptidase T par E. coli. (3pt) c) Avec ce nouveau plasmide recombinant (garantissant une production en grande quantité de la protéine par E. coli), existe-t-il tout de même un risque qu il ne soit pas possible de faire produire M29 par E. coli? Si oui, indiquez pourquoi. (1pt) d) Est-ce que la procédure que vous avez précédemment décrit (ou à défaut celle indiquée dans l énoncé) est de la «biologie synthétique»? Justifiez. (1pt) Page 2/4

3 2. Voici un extrait du livre «Biologie» (Campbell et coll., ed. 2007), présentant le transfert de gènes d Agrobacterium tumefaciens vers une cellule de plante. «( ) Chez de nombreuses espèces végétales, une seule cellule de tissu mise en culture peut donner une plante adulte. ( ) Le vecteur employé pour introduire de nouveaux gènes dans les cellules végétales est un plasmide, appelé plasmide Ti (pour tumor inducing), provenant d'agrobacterium tumefaciens, bactérie du sol. Un segment de l'adn (ADN T ) de ce plasmide est inséré dans l'adn chromosomique des cellules végétales hôtes. ( ) On peut insérer des plasmides Ti recombinés [=modifié] ( ) dans Agrobacterium ; les plantes ou les cultures de cellules végétales sont alors infectées par les bactéries qui contiennent le plasmide recombiné.» (p.442) Il est à noter que les gènes du segment ADN T d A. tumefaciens sont (entre autre) des «oncogènes» causant des tumeurs. De part et d autre de l ADN T, se trouve des éléments cis-régulateurs définissant le début et la fin du segment devant être transféré vers la plante (donc, l ADN T ). a) Comparez les cellules d A. tumefaciens (la bactérie) à celles d A. thaliana (une plante infectée par A. tumefaciens). Citez 2 différences majeures. (2pt) b) Comparez le processus de modification génétique ci-dessus à celui de la «transduction» étudié en cours. (2pt) Page 3/4

4 3. Décrivez les différentes étapes de la PCR (réaction de polymérisation en chaine) et expliquez ce qui s y passe. (3pt) 4. En biologie moléculaire, «Transcription» et «Traduction» font référence à des processus biologique précis. Définissez-les rapidement. (2pt) Total des points : / 15 Note : ( / 13) x = Page 4/4

5 Nom : CORRECTIONS Groupe : 18 avril 2016 Test 3OC (45 ) 3BCoc B. Emery Génétique moléculaire des procaryotes COPAD Aucun document autorisé (ni personnel, ni fourni). Les réponses doivent figurer sur l énoncé. Écrivez très lisiblement et dans un français correct, merci. 1. Pour fabriquer des tablettes pour lave-vaisselles, on utilise des enzymes produites par des bactéries. Mais l utilisation d une haute température de lavage, détruit ces enzymes et les empêche de fonctionner. Toutefois, certaines bactéries (les extrémophilles) vivent à haute température (~70 C) et leurs enzymes résistent très bien à celle-ci. Malheureusement, la culture des extrémophilles est compliquée. On cherche donc à transférer les gènes produisant certaines enzymes digestives (comme l Aminopeptidase T, qui dégrade les protéines) de Thermus (ou Thermophilus) aquaticus (un extrémophille), dans Escherichia coli (une bactérie intestinale dont la température de croissance est de 37 C et facile à transformer). Le gène de l aminopeptidase T (M29) n est pas dans un opéron polycistronique, mais est un gène isolé (monocistronique). Un bout d ADN de T. aquaticus (comprennant la séquence codante de M29 ainsi que 500 pb. en amont et en aval de cette séquence) est introduit dans un plasmide (contenant uniquement une origine de réplication et un gène de résistance à un antibiotique). Le plasmide est ensuite transféré dans une souche E. coli. La production d aminopeptidase T par une bactérie transformée est finalement analysée. Malheureusement malgré l introduction du gène M29 dans la bactérie, celle-ci ne produit pas l enzyme. Après analyse du gène de M29, il se trouve que le codon d initiation (habituellement AUG) a été remplacé par un autre (GUG) chez T. aquaticus, ce qui empêche la traduction par E. coli de la protéine. a) Supposons qu on modifie le codon d initation en le remplaçant par AUG dans le plasmide précédant, est-ce que E. coli produira forcément la protéine? Justifiez (1pt) Pas forcément. En effet, le gène est directement tiré de T. aquaticus et introduit dans E. coli, mais cependant ces 2 organismes sont différents. Il n est pas du tout certain que le promoteur de T. aquaticus soit fonctionnel dans E. coli. (Justification 1pt) En l occurence, lorsque l expérience a été réalisée, cela a fonctionné. Page 1/5

6 b) Décrivez la procédure de fabrication d un plasmide recombinant qui garanti la production d aminopeptidase T par E. coli. (3pt) On prend la séquence codante (amplifiée par PCR) que l on introduit dans un vecteur d expression grâce à des enzymes de restriction (1pt). Celui-ci comprend une origine de réplication et un gène marqueur (comme celui proposé dans l énoncé - 1pt), ET un système d expression fonctionnel dans l organisme de destination et dans lequel on introduit la séquence codante (1pt). On introduit le résultat dans la bactérie et on sélectionne les transformants grâce au gène marqueur. c) Avec ce nouveau plasmide recombinant (garantissant une production en grande quantité de la protéine par E. coli), existe-t-il tout de même un risque qu il ne soit pas possible de faire produire M29 par E. coli? Si oui, indiquez pourquoi. (1pt) (Justification 1pt) Oui, car la protéine elle-même peut être toxique pour la bactérie qui la produit en particulier dans ce cas puisqu il s agit d une protéase. On peut aussi imaginer qu il soit impossible d introduire ce plasmide dans E. coli, mais c est très peu probable et donc pas une très bonne justification. d) Est-ce que la procédure que vous avez précédemment décrit (ou à défaut celle indiquée dans l énoncé) est de la «biologie synthétique»? Justifiez. (1pt) Non. En effet, la biologie synthétique vise à créer quelques chose qui n existe pas du tout dans la nature (gène synthétisé à partir de rien p.ex.). Ici on ne fait que prendre un seul gène d une espèce pour le déplacer vers une autre espèce (ce qui pourrait arriver naturellement). Il n y a rien de nouveau en soit c est juste du génie génétique. (Justification 1pt) Page 2/5

7 2. Voici un extrait du livre «Biologie» (Campbell et coll., ed. 2007), présentant le transfert de gènes d Agrobacterium tumefaciens vers une cellule de plante. «( ) Chez de nombreuses espèces végétales, une seule cellule de tissu mise en culture peut donner une plante adulte. ( ) Le vecteur employé pour introduire de nouveaux gènes dans les cellules végétales est un plasmide, appelé plasmide Ti (pour tumor inducing), provenant d'agrobacterium tumefaciens, bactérie du sol. Un segment de l'adn (ADN T ) de ce plasmide est inséré dans l'adn chromosomique des cellules végétales hôtes. ( ) On peut insérer des plasmides Ti recombinés [=modifié] ( ) dans Agrobacterium ; les plantes ou les cultures de cellules végétales sont alors infectées par les bactéries qui contiennent le plasmide recombiné.» (p.442) Il est à noter que les gènes du segment ADN T d A. tumefaciens sont (entre autre) des «oncogènes» causant des tumeurs. De part et d autre de l ADN T, se trouve des éléments cis-régulateurs définissant le début et la fin du segment devant être transféré vers la plante (donc, l ADN T ). a) Comparez les cellules d A. tumefaciens (la bactérie) à celles d A. thaliana (une plante infectée par A. tumefaciens). Citez 2 différences majeures. (2pt) Dans la mesure où l une est une bactérie et l autre une cellule végétale, il y a de nombreuses différences 1pt par différence majeure. P.ex : Les bactéries n ont pas de noyau contrairement aux eucaryotes. La transcription et la traduction sont simultanées chez les bactéries et séparée chez les eucaryotes. b) Comparez le processus de modification génétique ci-dessus à celui de la «transduction» étudié en cours. (2pt) 1pt pour les similitudes et 1pt pour les différences : Similitudes : Les deux systèmes transforme (modifie génétiquement) une espèce par (l intermédiaire d ) une autre. Différence : Le système ici est prévu par la bactérie et ne permet le transfert que de l ADNT (et rien d autre). Dans la transduction, c est une erreur de la réplication virale qui est à l origine du transfert, et n importe quel fragment d ADN de la bactérie d origine peut être transférer. Le transfert s effectue dans la transduction entre une bactérie et une autre, par l intermédiaire d un virus. Ici le transfert s effectue entre une bactérie et une plante, sans autre intermédiaire. Page 3/5

8 3. Décrivez les différentes étapes de la PCR (réaction de polymérisation en chaine) et expliquez ce qui s y passe. (3pt) Dénaturation : On commence par chauffer à 95 C pour séparer les 2 brins d ADN matrice (1pt) Hybridation : On refroidit vers 50 C pour que les amorces (créée artificiellement) et l ADN matrice s apparie (1pt) Elongation : On réchauffe à 72 C pour que la Taq polymérase, fabrique le nouveau brin en polymérisant les nouveaux nucléotides (complémentaire à la matrice) à la suite de l amorce. (1pt) 4. En biologie moléculaire, «Transcription» et «Traduction» font référence à des processus biologique précis. Définissez-les rapidement. (2pt) Transcription (1pt) : Une copie monobrin d un segment d ADN (un gène ou un opéron) est fabriqué par une polymérase. Traduction (1pt) : Une protéine est fabriqué par un ribosome lisant les instruction figurant sur l ARN messager résultant de la transcription (et de la maturation chez les eucaryotes). Total des points : / 15 Note : ( / 13) x = Page 4/5

9 Grille d évaluation de l épreuve Biologie Synthétique. Avril. 16 3OC Note : ( /13) x 5+1 = Nom : Groupe : Page 1 - Q1a Justification Total des points : / 1 Page 2 Q1b d b) La séquence codante amplifiée par PCR est introduite b) derrière le promoteur d un vecteur d expression (plasmide) b) et contenant également une origine de réplication et un gène marqueur c) Justification d) Justification Total des points : / 5 Page 3 - Q a) Différence majeure 1 a) Différence majeure 2 b) Similitudes avec la transduction b) Différences avec la transduction Total des points : / 4 Page 4 Q3, Q ) Dénaturation à 95 C pour séparer les brins matriciels 3) Hybridation à 50 C pour lier amorces et brins matriciels 3) Elongation à 72 C pour fabriquer les nouveaux brins par la pol. Taq 2) Transcription : copie monobrin d un segment d ADN par une pol. 2) Traduction : assemblage d une protéine par ribosome lisant l ARNm Total des points : /5 Page 5/5