Optique & Microscopie. microscopie en lumière directe. 3 - Microscopie en lumière blanche. & en fluorescence. Arnauld Sergé

Transcription

1 Optique & Microscopie 3 - Microscopie en lumière blanche & en fluorescence Arnauld Sergé microscopie en lumière directe 1

2 Réglages de Köhler Réglages de Köhler 3) Rendre nette cette tâche en jouant sur la hauteur du condenseur (bords polygonaux) L'éclairage de Köhler permet un éclairage homogène et contrasté. 1) Mettre au point une préparation à faible grossissement, les deux diaphragmes grands ouverts 4) Centrer ce polygone dans le champ à l aide des vis de centrage condenseur 2) Fermer le diaphragme de champ pour visualiser une tache lumineuse polygonale, floue et non centrée. Réglages de Köhler Disposition des diaphragmes Boîtier lumière transmise àlampe halogène (HAL) 5) Ouvrir le diaphragme de champ juste à la limite de non perception dans l oculaire. Diaphragme de champ 6) Fermer légèrement le diaphragme d ouverture si besoin est, pour contraster. Filtres gris et colorés Vis de centrage du condenseur Diaphragme d ouverture Mise au point du condenseur Condenseur Trajet optique un myocyte illumination de Köhler détection illumination Réglage optimal de lampe + collecteur diaphragmes condenseur objectif oculaires 5 μm 2

3 Principe: éclairage rasant Principe du fond noir Fond clair vs. fond noir Via l objectif Par réflexion visualisation des bords Contraste de phase image d'un objet = image directe issue des parties uniformes de l'objet + diffraction due aux irrégularités. Zernike a donc eu l'idée de produire artificiellement un décalage de phase entre ces deux images en apportant grâce à une lame de phase une avance de la phase de la première image. Il faut un diaphragme annulaire sous le condenseur dont l'image se superpose exactement à un deuxième situé dans la partie arrière de l'objectif. image directe = + diffraction 3

4 Contraste de phase Contraste Interférentiel Différentiel lampe illumination ordinaire contraste de phase polariseur Wollaston condenseur échantillon objectif Wollaston analyseur image Le prisme de Wollaston sépare les polarisations perpendiculaires et parallèles. Lorsqu elles sont recombinées par l analyseur, elles donnent une lumière grise si le trajet optique a été le même, et blanche ou noir s il a été différent, donnant l illusion d un éclairage rasant. Contraste de Normaski Differential Interference Contrast Contraste de phase & DIC Illumination ordinaire DIC -> Techniques complémentaires, selon échantillon et détails d intérêt. Comparatif Fond clair Fond noir Contraste de phase Informations sur l objectif 4

5 Microcopie à fluorescence Principe de la fluorescence Diagramme de Jablonski simplifié S 1 S 1 Etats excités fluorochrome e = hν = hc/λ Intensité de fluorescence FITC 490 nm 520 nm Excitation (état stable) Emission (état excité) Energy S 0 hv ex hv em Etat de base Longueur d onde (1/énergie) Le fluorochrome Filtres de fluorescence Choix du Fluorochrome Ex: FITC photoblanchit beaucoup plus rapidement que d autres fluorochromes comme Alexa 488, ou, plus récemment développés, les quantums dots. La longueur d onde d excitation n affecte pas le spectre d émission mais uniquement l intensité de l émission de fluorescence. L intensité de l émission correspond à l amplitude du spectre d absorption. 5

6 Différents types de filtres transmission longueur d onde passe-haut longueur d onde passe-bande longueur d onde passe-bas Filtres et cube pour la fluorescence Imagerie par fluorescence marquage spécifique Marquage spécifique avec plusieurs couleurs Image 3 couleurs canal rouge canal vert image fusionnée (+bleu) -Bactéries GFP en vert -Actine en rouge -Golgi en bleu Colocalisation??? 6

7 Image 3 couleurs Trajet de la lumière dans le microscope Observateur Lampe blanche Echantillon Cube fluorescent Lampe fluorescente Bactéries GFP en vert Actine en rouge Golgi en bleu Sources de lumière pour la fluorescence Cube simple pour la fluorescence : Rhodamine Ex: HBO 50 W (lampe arc à vapeur de mercure) Cube simple LongPass Cube double pour la fluorescence : FITC/TxRed Protéines autofluorescentes Cube double GFP 7

8 Ala 72 Structure et photophysique de la efp N-terminal Leu 68 Tyr 203 C-terminal Fluorophore : Gly65,Tyr66, Gly acides amines λ abs, max = 514 nm λ em, max = 527 nm extinction (cm -1 M -1 ) 8 ecfp egfp efp 6 DsRed flavin x Spectres de protéines autofluorescentes fluorescence x QE (ebfp) ecfp egfp efp DsRed flavin wavelength (nm) 11 feuillets β organisés en tonneau une hélice α centrale 4 nm wavelength (nm) efp Plasmide : brin d ADN circulaire Transfection noyau mélange & incubation membrane plasmique cytoplasme Imagerie par fluorescence sondes environnementales agent de transfection ex : lipides spéciaux (poly-cations) ADN enrobé de lipides protéine efp produite Signal dépendant de l environnement local : potentiel, ph, [Ca] Utilisations de la GFP Marquage de cellules fixées Fixation + perméabilisation => structures intracellulaires accessibles Fluorochromes couplés à des marqueurs spécifiques, anticorps en général (IF: Immuno-Fluorescence) bovine pulmonary artery endothelial cells that have been stained with an anti-β-tubulin mouse antibody with BODIP FL goat anti mouse IgG for microtubules, Texas Red-X phalloidin for F-actin and DAPI for nuclei. 8

9 Marquage de cellules vivantes Vidéo-microscopie Marquage de surface (membrane plasmique) RE de racines d Arabidobsis Trafic intracellulaire Micro-injection Transfection avec GFP Chimiotaxie d amibes Dictyostelium Synapses & récepteurs 9