Biologie du développement (2) Aspects cellulaires et moléculaires du développement précoce chez l amphibien

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1 Biologie du développement (2) Aspects cellulaires et moléculaires du développement précoce chez l amphibien Frédéric TOURNIER Maître de Conférences Université Paris Diderot Paris 7

2 INTRODUCTION Etude du développement des organismes (nombreux modèles) embryologie Prolifération / différenciation / migration / mort cellulaire spécialisations tissulaires Données physiologiques Données physiopathologiques Chez l adulte Renouvellement des tissus altérations Réparation: Prolifération / différenciation / migration / mort cellulaire

3 CHOIX DU MODELE! En fonction de la question posée. Invertébrés Vertébrés Caenorhabditis elegans (nématode) drosophile xénope Poisson zèbre poulet Mammifères souris homme

4 Propriétés communes entre des modèles, même très éloignés évolutivement Mais. aussi propriétés différentes dans des modèles «proches»!! Voir plus loin: comparaison de la fécondation chez la souris et chez l homme

5 Le plan d organisation de l embryon est commun à différentes espèces de Vertébrés

6 fécondation 1 2 segmentation 3 gastrulation 4 métamorphose neurulation et organogenèse

7 Les principales étapes Fécondation: - Rétablissement de la ploïdie - Réaction d équilibration et réaction corticale - Divisions embryonnaires (opposées à somatiques) Segmentation: - Permet de passer du stade unicellulaire (ovocyte fécondé = zygote) au stade pluricellulaire (blastula) - Mise en place d une cavité (le blastocèle).

8 La gastrulation: - mise en place des 3 feuillets fondamentaux: ectoderme, mésoderme, endoderme. La neurulation: - mise en place d un tube creux (le tube neural) dans la région dorsale. - début du «modelage» de l embryon, allongement selon l axe antéro-postérieur. Et... L organogenèse: - exemple de la formation des muscles

9 Ovogenèse - Dans l ovaire: Ovogonies: entrée en méiose ovocytes I (blocage en prophase de 1ère division de méiose) hormone: progestérone reprise de la méiose blocage en métaphase II ponte Rappel: fécondation interne chez les mammifères! Externe chez l amphibien

10 1) La fécondation Un pôle animal (région pigmentée): PA Tâche de maturation Ovocytes II pondus Un pôle végétatif (région non pigmentée): PV PA Donc un axe animal / végétatif - Les ovocytes sont orientés dans tous les sens - Gonflement des gangues au contact de l eau PV

11 Ovocyte non fécondé: distribution hétérogène des constituants

12 rôle du spermatozoïde lors de la fécondation acrosome noyau haploïde centriole proximal flagelle Ovocyte Métaphase II centriole distal

13 Fécondation: apport d un centrosome par le spermatozoïde Centriole: 9 triplets puis 9 doublets de microtubules et nombreuses protéines associées! Centriole père Matériel péri-centriolaire Centriole fils

14 Cycle de duplication du centrosome ATTENTION! Cycle somatique = croissance + division 4 phases: G1, S, G2, M

15 La question des centrioles du spermatozoïde! Conversion fonction axonémale (établissement d un cil ou d un flagelle) et fonction centrosomique (organisation du réseau microtubulaire) Centriole distal (9+0) Zone de transition > rupture après fécondation axonème du flagelle (structure 9+2) Centriole proximal spermaster duplication 4N

16 N N 4N - Migration des noyaux - Duplication de l ADN - Duplication des centrioles du spermatozoïde xénope.. homme 1ère division de segmentation 2 blastomères (2N)

17 Mais pas chez la souris! Probablement pas chez les rongeurs. Divisions acentriolaires (sans centrioles) jusqu au stade 16/32 cellules

18 Deux questions - non résolues - se posent: 1) Comment apparaissent les centrioles au stade 16 ou 32 cellules chez la souris? 2) Comment les centrioles disparaissent dans toutes les espèces au cours de l ovogenèse? Intérêt? Duplication du centrosome => mitose «normale»

19 Réaction d équilibration Rotation corticale Réaction d équilibration: après fécondation, le décollement de la membrane de fécondation de la membrane plasmique de l ovocyte fécondé lui permet d être libre dans sa gangue orientation tel un «culbuto», due à la densité des plaquettes vitellines dans l hémisphère végétatif tous les ovocytes fécondés sont orientés PA vers le haut.

20 Réaction corticale, formation du croissant gris spermatozoïde ovocyte non fécondé Pôle animal Rotation d environ 30 ovocyte fécondé Pôle animal V Croissant gris D Pôle végétatif Pôle végétatif Etablissement d un nouvel axe: dorso-ventral

21 Réaction corticale: rôle du spermaster Interprétation: Le croissant gris (ou dépigmenté) apparaît à la suite de la rotation du cytoplasme par rapport au cortex. Le spermaster («lourd») serait responsable de ce mouvement relatif.

22 2) La segmentation - passage du stade unicellulaire (zygote = ovocyte fécondé) au stade pluricellulaire, - les premières divisions aboutissent à la formation de la morula. A la fin de la segmentation, l embryon est au stade blastula micromères macromères

23 Cycles embryonnaires de segmentation Division mais pas croissance Pas de phases G1 et G2: alternance de phases de synthèse (S) et de divisions mitotiques (M) MPF (Maturation Promoting Factor) faible en S (synthèse de cycline B) et élevé en M (dégradation de la cycline B): phosphorylation de substrats. ex: -Histone H1 -Lamines Pas de transcription jusqu à la transition blastuléenne (environ 6000 cellules ou blastomères): reprise des phases G1 et G2

24 Application: Utilisation d extraits cytoplasmiques d ovocytes de xénope

25 MPF (activité) CyclineB er clivage (ARN ou protéine) Stade 2 blastomères 2ème clivage Stade 4 blastomères temps (min) fécondation

26 1) Extraits «mitotiques» -Au temps 0: à partir d ovocytes matures, pondus, bloqués en métaphase de 2ème division de méiose. - Activité MPF élevée constante 2) Extraits interphasiques - 10 min environ après «l activation» des ovocytes - Activité MPF faible constante MPF MPF t t 3) Extraits «cyclants» - 60 min environ après «l activation» des ovocytes - Activité MPF faible. Mais le niveau de cycline mitotique endogène permet l activation du MPF (cycle(s) «in vitro») MPF t Exemples d expériences?

27 En fin de segmentation se forme la blastula, creusée d une cavité, le blastocèle Pôle animal micromères blastocèle Cohésion des cellules? macromères Pôle végétatif

28 Rôle du cytosquelette et de la matrice extracellulaire

29 Macromères et micromères Cadhérines: permettent les jonctions inter-cellulaires, liens avec le cytosquelette.

30 Protéines de jonctions: Fusion entre membranes Passage des ions et petites molécules MEC: Laminine fibronectine Hétérodimères récepteurs à la fibronectine

31 Revenons à la mise en place de l axe dorso-ventral

32 Expérience: coupure viable du zygote avant la première segmentation Hans Spemann (1938) PA PA Les cellules sont séparées au stade 2 V D Cellules épidermiques, mésenchyme et cellules endodermiques. Mais en absence de croissant gris, pas d axe dorso-ventral, ni de système nerveux.

33 Expériences de Peter Nieuwkoop (1980) Conclusion: Au stade blastula, des cellules les cellules qui de «paraissent la zone marginale identiques ont déjà» ont reçu déjà une des destinées information différentes pour les orienter au stade vers blastula une différenciation en: - chorde (mésoderme dorsal) - cellules musculaires (mésoderme intermédiaire) - cellules sanguines (mésoderme ventral)

34 Régulations moléculaires complexes Inductions Cellules inductrices > cellules compétentes Mise en évidence par l expérimentation

35 Expérience: marquage des cellules avec un composé fluorescent Stade 32 blastomères PV 1- Si on marque les blastomères animaux: les cellules mésodermiques sont marquées 2- Si on marque les blastomères végétatifs: les cellules mésodermiques ne sont pas marquées

36 Expériences de Dale et Slack (1987)

37 Régionalisation de l induction (1)

38 Régionalisation de l induction (2) Conclusion: 1) les blastomères végétatifs induisent les cellules adjacentes à fonder les lignées mésodermiques. 2) La régionalisation de cette induction est déjà déterminée.

39 Carte des territoires présomptifs au stade blastula: Régionalisation des blastomères en fonction de leur devenir en fin de gastrulation.

40 En résumé: Des cellules inductrices envoient une information. Elle synthétisent et sécrètent une ou plusieurs molécules. Les blastomères végétatifs envoient une information vers des micromères de la zone marginale > Induction du mésoderme Des cellules compétentes sont capables de recevoir l information. Elles possèdent des récepteurs et des messagers intracellulaires capables d agir au niveau génomique.

41 3) La gastrulation mouvements de cellules à partir de la blastula qui aboutissent à la mise en place des 3 feuillets fondamentaux qui donneront tous les organes: - Ectoderme (et Neurectoderme) - Mésoderme - Endoderme Les cellules migrent en surface et rentrent à l intérieur de l embryon en constituant une nouvelle cavité: l archentéron (futur intestin)

42 Future région dorsale Future région ventrale

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45 Lèvre dorsale du blastopore Blastopore Stade du bouchon vitellin

46 Utilisation de la technique des marques colorées: pour mettre en évidence la mise en place des 3 feuillets et les mouvements de la gastrulation Coloration de quelques cellules dans des régions d intérêt. On repère à différents stades les cellules qui portent la coloration (coupes histologiques, observation au microscope) Les cellules commencent à entrer par la lèvre dorsale du blastopore (localisée dans la région du croissant gris) Stades du bouchon vitellin

47 4) La neurulation - Allongement selon l axe D-V - Dans la région dorsale, formation du tube neural

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49 Mouvements complexes des cellules: Interactions entre cellules et matrice extra-cellulaire (MEC) Rôle du cytosquelette Allongement et stabilisation des microtubules Contraction des faisceaux d actine Contractions à l apex des cellules > mouvement «d enroulement» du tube neural

50 Après la neurulation, le plan d organisation primaire commun à tous les vertébrés est réalisé. Ectoderme: peau, système nerveux Endoderme: intestin, foie, poumons Les 3 feuillets sont en place: Externe (ectoderme) Moyen (mésoderme) Interne (endoderme) Mésoderme: squelette, muscle, rein, cœur, vaisseaux Les 3 axes sont en place: - Antéro-postérieur - Dorso-ventral - Médiolatéral