Régulation GAL4 chez S. cerevisiae. Annie Sainsard-Chanet

Transcription

1 Régulation GAL4 chez S. cerevisiae Annie Sainsard-Chanet

2 Contrôle de l expression génique Mécanismes qui régulent, augmentent ou diminuent l expression d un gène donné suivant le milieu, le tissu, le stade de développement Chez eucaryotes, l expression d un gène peut être régulée aux mêmes étapes qu un gène bactérien, mais aussi à des niveaux supplémentaires

3 Chez les bactéries: Le niveau de régulation le plus utilisé est la transcription, tout particulièrement l initiation de la transcription Promoteur (séquences consensus) Complexe fermé/complexe ouvert

4 Les promoteurs varient beaucoup entre eux selon leur affinité pour la RNP Beaucoup de promoteurs sont faibles ou «imparfaits». En absence de protéines régulatrices activatrices : expression constitutive (basale, non régulée) faible L expression de ces gènes peut être augmentée en présence de protéines activatrices ou diminuée en présence de protéines répresseurs Les activateurs agissent par «recrutement» de la RNP ou par «changement allostérique» Les répresseurs agissent par inhibition directe

5 Un gène est il transcrit ou non? l ARNm est il présent? Northern RT-PCR Si non: est il transcrit et instable?: expériences de run-on Caractérisation des séquences cis-régulatrices Footprint= Protection à la DNAse I Retard sur gel Chromatine Immunoprécipitation= ChIP Expériences fonctionnelles avec gène reporter

6 Clonage d un fragment d ADN Marquage d une extrémité Un échantillon incubé avec la protéine, l autre non Digestion DNAse I (coupure au hasard, une fois/molécule) Electrophorèse des fragments Comparaison footprint et séquence Footprinting Et aussi: Expériences fonctionnelles avec gène reporter CHIP,..

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9 Sélection de mutants constitutifs F. Jacob et J. Monod, Prix Nobel, 1965: 2 types de mutants différents

10 Mutations «perte de fonction» du répresseur Le répresseur (protéine diffusible) agit en trans I: gène actif en trans Mutations I- : mutations trans-récessives

11 Mutations de l opérateur qui empêchent la fixation du répresseur L opérateur est une séquence d ADN, séquence cis-régulatrice (qui est la cible de protéines régulatrices actives en trans) O: séquence active en cis Mutations Oc= mutations cis-dominantes

12 Chez les eucaryotes, la régulation de l expression génique peut se faire 1) aux mêmes étapes que chez les bactéries et 2) à des niveaux supplémentaires 1) Niveau transcriptionnel: complexité + grande que chez bactéries. Organisation du génome eucaryote en nucléosomes Séquences et protéines régulatrices beaucoup + nombreuses chez eucaryotes 2) Niveau posttranscriptionnel Structure des gènes différente: gènes morcelés : épissage Stabilité des ARNm 3) Niveau traductionnel: complexité + grande que chez bactéries 4) Niveau posttraductionnel Régulation épigénétique Modifications de la structure de la chromatine (niveau transcriptionnel) Rôle central de petits ARNs responsables de la répression de l expression de gènes spécifiques (niveau transcriptionnel et posttranscriptionnel)

13 Chez eucaryotes, la machinerie de transcription est beaucoup plus complexe: ce sont les facteurs généraux de transcription qui se fixent au niveau du promoteur (TATA box/tfiid) et qui recrutent la RNPolII Presque tous les gènes eucaryotes ont besoin de protéines activatrices pour être transcrits et possèdent de nombreuses séquences cis-régulatrices sur lesquelles viennent se fixer ces activateurs. Les sites sur lesquels se fixent les protéines activatrices sont appelés enhancers, ils peuvent se trouver à des milliers de pb du promoteur Les activateurs ont une structure modulaire avec un domaine de fixation à l ADN et un domaine d activation de la transcription Promoteur minimal Enhancer

14 Pratiquement tous les gènes eucaryotes sont régulés par les effets combinés de répresseurs et d activateurs La plupart des activateurs agissent par «recrutement» et stabilisation du complexe d initiation de la transcription

15 Les activateurs peuvent aussi modifier jouer sur l initiation de la transcription en changeant la structure de la chromatine : modifications covalentes des histones (acétylation) et remodelage des nucléosomes permettent aux promoteurs d être plus accessibles à la RNP

16 Les répresseurs eucaryotes présentent une variété de mécanismes d action Pas d inhibition directe par fixation au niveau du promoteur

17 LA CHROMATINE : ADN compacté X1 000 à X suivant les régions

18 Chez l homme: 25/ gènes et > 1 million d ARNms

19 Localisation des éléments cis régulant l expression d un gène de mammifère et d un gène de levure

20 GAL2 GAL1 GAL7 GAL5 transporteur kinase transférase mutase Galactose ext Galactose int Gal-1-P Glu-1-P Glu-6-P MEL1 α-galactosidase UDP-Glu UDP-Gal glycolyse Melibiose epimérase GAL10

21 Sélection de mutants (gal - ) Mutants récessifs 7 groupes de complémentation: gal1, gal2, gal3, gal4, gal5, gal7, gal10 Les mutants gal3 présentent un phénotype particulier: LTA (Long Term Adaptation) WT: induction in présence of galactose (gal +ind ) (>1000 pour GAL2, GAL1,GAL7,GAL10, X100 pour MEL1) Mutants gal1, 2, 5, 7, 10: (gal - ) déficients spécifiquement pour une activité enzymatique Mutant gal4, : non inductibles sur galactose: (gal -R ) Mutants gal3:(gal LTA ) Mutants gal3gal1: (gal -R ) Les mutants gal4 présentent un phénotype particulier: déficients pour toutes les activités

22 Localisation génétique G A L 7 G A L 1 0 G A L 1 G A L 2 M E L 1 I I X I I X V I G A L 4 G A L 3 X I I I G A L 8 0 GAL2 GAL1 GAL7 GAL5 transporteur kinase transférase mutase Galactose ext Galactose int Gal-1-P Glu-1-P Glu-6-P MEL1 α-galactosidase UDP-Glu UDP-Gal glycolyse Melibiose epimérase GAL10

23 Quelles sont les fonctions de GAL3 et GAL4? Sélection de mutants constitutifs (gal +C ) Recherche de révertants (gal + ) à partir de gal3 - gal1 - (gal -R ) 1) Mutations dominantes dans gal4 (gain de fonction?) Gal4 + / Gal4 C = constitutifs, gal4 C = (gal +C ) 2) Mutations récessives dans gal80 (= i - ) (perte de fonction?) gal80/gal80 c = inductible 3) Mutations dominantes dans gal3 (gain de fonction?) Gal80 c gal4 + =(gal +C ), gal80 + gal4 - =(gal -R ), gal80 c gal4 - =(gal -R ) Gal3 + gal80 + gal4 + = (WT: inductible), gal3 - gal1 - gal80 + gal4 + = (gal -R ) Gal3 + gal80 c gal4 + = (gal +C ),, gal3 - gal1 - gal80 c gal4 + = (gal +C ) Le contrôle se ferait via 3 protéines GAL4: activateur Gal80: répresseur GAL3, senseur du galactose, responsable de la transduction d un signal d induction en présence de galactose

24 Autre crible pour sélectionner des mutants constitutifs: système reporter: gène HIS3 sous contrôle du promoteur-uas Gal1 intégré dans une souche his3 - Recherche de (his) + sur milieu sans galactose

25 En faveur du modèle: Mutations responsables d un phénotype constitutif (gal +c ) mutations dans gal80: récessives (perte de fonction) mutations dans gal4 : dominantes (gain de fonction) mutations dans gal3: dominantes (gain de fonction) La surproduction de GAL4 (clonage sur un plasmide multicopie) La surproduction de GAL3 (ou GAL1) (clonage sur un plasmide multicopie): GAL3 pourrait passer d une forme inactive à une forme active qui se fixerait sur GAL80 ou sur le complexe GAL80/GAL4 Mutations responsables d un phénotype (gal -R ) (non inductible) (mutants (gal - ) chez lesquels les gènes gal1, gal7, gal10 ne sont pas exprimés même en présence de galactose) mutations dans gal4 : récessives (perte de fonction) mutations dans gal80: dominantes (gain de fonction = «superrépresseurs») mutations dans gal3: récessives (perte de fonction)

26 Modèle confirmé par expériences de BM 1) Tous les gènes clonés 2) Présence de séquences UAS sur lesquelles se fixent GAL4 dans les régions promotrices de tous les gènes inductibles (CHIP, gel retard, footprint)

27 Caractérisation de la séquence UAS- GAL4 Induction des 2 gènes GAL1 et GAL10 de < 0,1 à > 50 transcrits /cellule en présence de galactose Expériences de gène reporter UAS-LacZ Dans une souche GAL4 + : Levures blanches en glucose Levures bleues en galactose Dans une souche gal4 - : Levures blanches en glucose Levures blanches en galactose Expériences de protection DNAse I (protection de 20-30pb) Selon les gènes: multiples séquences UAS (4 GAL1-10, 3 GAL7, 2 GAL2, 1 MEL1) Séquences UAS toujours en 5 du gène régulé à < 1 kb du +1 Footprint de GAL4 dans la région flanquante du gène gal2

28 Structure de GAL4: Localisation des domaines de liaison à l ADN et d activation

29 Structure modulaire de la protéine activatrice GAL4 Fixation directe de GAL4 sur la séquence UAS Purification de la protéine GAL4 à partir de levures exprimant GAL4 sur un plasmide multicopie: extraits protéiques passés sur colonne contenant la séquence UAS G : la protéine est retenue Protéine de 88O aa, motif de liaison à l ADN (doigt Zn), Localisation nucléaire, présente de façon constitutive

30 Effet répresseur de GAL80? Interaction GAL4/GAL80 Coimmunoprécipitation GAL80 répresseur transcriptionnel de GAL4? Effet répresseur par interaction directe? GAL80 synthétisée in vitro: (ARNm gal80 + lysat de réticulocytes de lapin+ (S 35 )Met Extrait protéique d une souche surexprimant GAL4 (plasmide multicopie) Anticorps antigal4 Les immunoprécipitats lavés, solubilisés et passés sur gel Interaction directe GAL4 (libre)/gal80 Extraits d une souche surexprimant GAL4, Gal80 S 35, anticorps antigal4 Même expérience avec des extraits gal4 c : pas d immunoprécipitat Lue NF et al, MCB, 1987

31 Mise en évidence d un complexe tripartite UAS/GAL4/GAL80 On connait interaction GAL4/UAS On connait interaction GAL4/GAL80 UAS/GAL4/GAL80? Expériences de retard sur gel Séquence UAS P 32 GAL4 synthétisée in vitro GAL80 synthétisée in vitro Gel d électrophorèse L addition de GAL80 à GAL4 en présence de l UAS conduit à l apparition d une bande + lourde dont l intensité augmente au détriment de la + légère en fonction de la concentration de GAL80 suggérant que la bande la + lourde dérive de la + légère GAL4 et GAL80 non marquées, séquence UAS P 32 Interaction directe GAL4 fixé sur UAS /GAL80 Lue NF et al, MCB, 1987

32 Interaction directe GAL3 /GAL80 Mécanisme d action de GAL3 (senseur galactose responsable de l induction) 1) produit un inducteur ou un coinducteur en présence de galactose qui lève l effet répresseur de GAL80? 2) interagit directement avec GAL80 pour lever son effet répresseur? Surexpression de GAL3 entraine l expression constitutive des gènes gal Surexpression simultanée de GAL3 et GAL80 supprime cet effet constitutif: Ces résultats montrent que la balance entre les 2 protéines est importante pour le phénomène d induction: arguments en faveur de 2) Coimmunoprécipitation GAL3 /GAL80: association faible non stable à concentration saline élevée NaCl (mm) Gal80 Gal3-HA Yano KI and Fukasawa T, 1997 Gal3-HA Gal80 Anti-HA

33 Interaction directe GAL3 /GAL80 (et GAL1/GAL80) L association GAL3/GAL80 est stabilisée en présence d ATP et de galactose (même en concentrations salines élevées) Nécessité d ATP et galactose pour avoir un complexe GAL3/GAL80 stable S0,S1= mutations dominantes de GAL80 (gal-r) non inductibles

34 Modèle rendant compte de l induction galactose GAL3: senseur de galactose et transducteur du signal à GAL4 Le galactose entrant dans la cellule se fixe sur GAL3, changement conformationnel en présence d ATP et cette forme active se fixe sur GAL80 changeant son affinité pour GAL4 Une fois l étape d induction passée, il y aurait maintien via la phosphorylation de GAL4

35 Interactions GAL4/GAL80/GAL3 Est ce que l interaction GAL3/GAL80 permet à GAL4 de transcrire? Expériences de transcription in vitro (en présence d ATP et de galactose) et analyse des transcrits par extension d amorce: Gal80 G152D = mutant nul Gal80 S-2 = non inductible GAL4 active la transcription GAL80 réprime cette induction Des concentrations croissantes de GAL3 lèvent l effet répresseur de GAL80 Platt A and Reece RJ, 1998

36 L activation des gènes GAL en présence de galactose est corrélée à une diminution de liaison GAL4/GAL80 Expériences de «chromatin immunoprecipitation» (ChIP) L occupation du site UAS par GAL4 augmente en présence de galactose L occupation du site UAS par GAL80 diminue en présence de galactose L activation par Gal4 serait due à une diminution du taux de GAL80 dans le noyau Peng and Hopper, 2002 input GAL4 GAL80 GAL3

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38 En absence de galactose : Gal80 se fixe sur GAL4 et empêche l activation de la transcription En présence de galactose, Gal3 se fixe à GAL80 et il y a levée de l inhibition Questions: Gal4 est une protéine nucléaire Gal80 possède des signaux de localisation nucléaire (NLS), Quelle est sa localisation cellulaire? Gal1est une protéine cytoplasmique, quelle est la localisation de GAL3? Dans quel compartiment cellulaire se fait l interaction GAL3/GAL80?

39 GAL3 est une protéine cytoplasmique Cellules Δgal3 Δgal1 transformées avec plasmide GAL3, A) marquage anti-gal3 et anticorps secondaires marqués à fluorescéine B) DAPI GAL3 est localisée dans le cytoplasme et exclue du noyau GAL80 est une protéine à localisation nucléaire et cytoplasmique Cellules Δgal80 transformées avec plasmide GAL80-GFP Si l interaction GAL3/GAL80 a lieu dans le cytoplasme, quel est le signal qui transmet l effet de cette interaction au noyau? Peng G and Hopper JE, 2000

40 L association GAL3/GAL80 dans le cytoplasme active GAL4 dans le noyau? La séquestration de GAL3 dans le cytoplasme n empêche pas l induction des gènes GAL en présence de galactose Une interaction GAL3/GAL80 dans le cytoplasme est elle réellement capable de transmettre un signal à un complexe GAL4/GAL80 nucléaire et permettre l induction de la transcription? Sequestration de GAL3 dans le cytoplasme Myr: séquence d adressage aux membranes plasmiques et vésiculaires Mom: séquence d adressage mitochondriale Il n est pas nécessaire à GAL3 d entrer dans le noyau et d interagir directement avec le complexe nucléaire GAL4/GAL80 pour être responsable de l induction GAL3 peut exercer son induction en restant dans le cytoplasme Peng G and Hopper JE, 2002

41 Modèle de régulation des gènes GAL GAL3 est localisé dans le cytoplasme GAL80 est localisé dans le cytoplasme et le noyau H: La présence de galactose tirerait GAL80 hors du noyau favorisant la formation d un complexe GAL3/GAL80 dans le cytoplasme Le passage non transcrit/induction dépendrait de la translocation du répresseur d un compartiment cellulaire à l autre GAL4 agit en recrutant des coactivateurs et la machinerie générale de transcription.

42 Système double hybride

43 La technique UAS/Gal4 pour cibler l expression génique chez la drosophile