TD TRANSCRIPTION 1 I II III IV P σ. Radioactivité 125 cpm cpm 130 cpm cpm. α 2 ββ Marqueurs + + α 2 ββ. 3 kb.

Transcription

1 TD TRANSCRIPTION 1 Problème 1 A) Un chercheur a cloné, dans un vecteur plasmidique, un insert de 5 kb, correspondant à une très petite portion du chromosome d Escherichia coli (génome complet d E. coli : taille 4 x 10 6 pb 4 x 10 3 gènes). Le plasmide recombinant obtenu (pec) est ensuite utilisé comme matrice dans des expériences de transcription in vitro. Par ailleurs, il a purifié, chez ces bactéries, le noyau enzymatique (core-enzyme) de l ARN polymérase (α 2 ββ ), la sous unité sigma (σ) ainsi qu une protéine P dont il ignore le rôle. Dans un 1 er tube T 1, pec est incubé en présence du noyau enzymatique de l ARN polymérase pendant 15 minutes dans des conditions optimales (ph, ions, GTP, CTP, ATP, UTP ) pour une transcription in vitro efficace. Dans un second tube T 2, il procède de manière identique mais avec la sous unité sigma en plus. Les produits obtenus sont ensuite purifiés puis analysés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide dénaturant (figure 1). T 1 T σ Marqueurs + + α 2 ββ 3 kb 2 kb 1 kb 0,5 kb 1) Que doit-on faire pour visualiser les produits de transcription in vitro sur la figure 1? 2) Expliquez les résultats obtenus. B) Une seconde série de transcriptions in vitro (I à IV) est réalisée selon un protocole comparable à celui de la série précédente. Les seules différences sont indiquées dans le tableau ci-après. Après les 15 minutes d incubation, la radioactivité TCA précipitable est mesurée sur un aliquote de même volume pour chacune des quatre réactions réalisées. I II III IV α 2 ββ σ P Radioactivité 125 cpm cpm 130 cpm cpm 46

2 3) Quelles informations vous apportent ces résultats quant aux rôles de : a) Sigma? b) P? C) La région clonée de 5 kb du chromosome d E. coli a été complètement séquencée. Quatre gènes ont été caractérisés et appelés G1 à G4. Pour poursuivre cette étude, quatre mutants sont construits in vitro. Ainsi, le mutant pec-g1m est en tout point identique à pec à l exception des régions 35 et 10 du gène G1 qui ont été mutées. Il en est de même pour les mutants pec-g2m vis à vis du gène G2, pec-g3m vis à vis du gène G3 et pec-g4m vis à vis du gène G4. Une 3 ème série de transcriptions in vitro est alors réalisée comme précédemment en présence d ARN polymérase (conditions différentes indiquées en haut de la figure 2) et les produits sont analysés comme dans la 1 ère série. Matrice pec pec-g1m pec-g2m pec-g3m pec-g4m Sigma P kb 2 kb 1 kb A B C D 0,5 kb 4) Interprétez l ensemble des résultats de cette dernière expérience. Problème 2 A) L expérience suivante est réalisée : un fragment de 800 pb contenant un gène procaryote (Gp) pourvu de son promoteur (régions 35 et 10) et de son terminateur Tr rho-dépendant (figure 1), est pré-incubé pendant 5 min en présence d un excès d ARN-polymérase holoenzyme purifiée, dans des conditions de force ionique convenables (50 mm NaCl). Après cette pré-incubation, le mélange est séparé en quatre échantillons. Chaque échantillon est additionné des quatre nucléosides triphosphates (NTP). Une concentration différente en NTP sera utilisée pour chaque essai. On appellera 1x la concentration suivante de NTP : 0,05 mm ATP, GTP, CTP et [α- 32 P]UTP. Seront également utilisées des concentrations 0,5x, 2x et 4x, représentant respectivement la moitié, le double ou le quadruple de la concentration 1x. De l héparine est également ajoutée au mélange des NTP. Dans ces conditions, aucune réinitiation de la transcription n est possible (on observera donc un seul cycle de synthèse). La protéine Rho n est pas ajoutée. Après incubation pendant les temps indiqués sur le tableau 1, les produits de l incubation sont soumis à une migration dans des conditions dénaturantes en gel de polyacrylamide en présence d urée. Le gel est alors révélé par autoradiographie. On quantifie ensuite uniquement la bande radioactive située à environ 630 bases. C est cette valeur qui est portée sur le tableau 1. 47

3 +1 Tr Région 35 Région 10 Tr : signal de terminaison rho-dépendant [NTP] 0,5x 1x 2x 4x Temps d incubation (min) 0,5 0,75 1 0,5 0,75 1 0,5 0,75 1 0,5 0,75 1 Bande 630 (intensité) Tableau 1 1) Commentez ces résultats. Quelle est l étape de la transcription qui est étudiée? Quelle est le paramètre cinétique de la réaction dont on mesure la variation dans cette expérience? B) En réalité, l allure générale de l autoradiogramme est celle donnée sur la figure 2 (les données obtenues pour les concentrations 1x et 2x sont présentées comme exemple). On estimera qu il y a sur toute la longueur du gel un bruit de fond de radioactivité qui n est pas visualisé ici (ce bruit de fond est surtout visible pour les concentrations faibles et les temps courts). 1x 2x Temps (min) 0,5 0,75 1 0,5 0, b 500 b 2) Que représente le «bruit de fond»? 3) Que représente d après vous la bande observable à environ 500 bases? C) Une série d expériences similaires est réalisée, avec les deux modifications suivantes : - présence pendant la réaction du facteur Rho purifié ; - pas d addition d héparine et temps d expérience de 15 minutes pendant lesquelles plusieurs cycles d initiation sont possibles. Ceci permet de mieux observer le phénomène (on admettra que l étape d initiation n est pas modifiée par les différentes conditions expérimentales). Différentes concentrations de NTP sont également utilisées, comme dans l expérience 1 (voir tableau 2). L intensité de la radioactivité présente sur le gel dans les bandes à 630 bases et 500 bases est quantifiée. Les valeurs du tableau 2 représentent les pourcentages de l une ou l autre de ces bandes par rapport à la somme des deux (prise comme 100 %). 48

4 [NTP] 0,25x 0,5x 1x 2x 4x Bande 630 b Bande 500 b Tableau 2 4) Quel phénomène mesure-t-on dans cette expérience? 5) Pouvez-vous proposer une explication rendant compte des différences observées? Problème 3 A partir d une banque d ADNc réalisée à l aide du vecteur λgt 10, on a isolé un clone contenant l ADNc (voir figure 1) codant pour la protéine X. Sur cette figure, la partie hachurée correspond au cadre de lecture de X. Dans le but de préparer de l ARNm codant pour X, on veut transcrire cet ADNc à partir du promoteur T 3 (prt 3 )du plasmide P A représenté sur la figure pb EcoRI ApaI BamHI HindIII ApaI EcoRI λgt 10 λgt 10 ATG Amp R P A (3500 pb) XbaI prt 3 EcoRI (la distance entre XbaI et EcoRI est extrêmement faible) 1) Décrire brièvement les différentes opérations permettant de transférer cet ADNc du phage λgt 10 dans le plasmide P A et d identifier les clones recombinants P A -X. 2) Dix de ces clones sont alors isolés. Décrire un test simple qui permettra de déterminer le sens d intégration de l ADNc dans le plasmide. 3) Sachant que la transcription sera réalisée in vitro par addition de l ARN polymérase du phage T 3, quel type de recombinant va-t-on choisir? Quelle modification va-t-on réaliser sur le plasmide afin d obtenir des ARNm ne contenant aucune séquence plasmidique? 49

5 4) Le mélange transcriptionnel in vitro comprend : Plasmide P A -X (0,2 µg/µl). 1 µl Tampon [T 3 -Pol ase ] 10x µl H 2 O (qsp 100 µl). 78 µl Mélange CTP, GTP, UTP (10 mm).. 5 µl ATP-γ 32 P (800 Ci/mmole).. 5 µl ARN Polymérase du phage T3 1 µl Après 10 min d incubation, on ajoute 2,5 volumes d alcool, on centrifuge, on lave plusieurs fois le culot qui est finalement séché puis dissout dans 0,1 ml d eau. La radioactivité est mesurée avec un rendement de 75 % sur une fraction aliquote de 5 µl 13,5 x 10 6 cpm. Elément radioactif COMPTAGE Mesure (dpm, Ci ou Bq) Rendement = C cpm / D dpm (coups par minute : cpm) [2,22 x 10 6 dpm (désintégration par minute) 1 µci 37 kbq (kilobecquerel)] a) Calculez la radioactivité totale en dpm puis en µci, correspondant aux ARN synthétisés in vitro. b) Sachant que chaque molécule d ARN synthétisée in vitro a incorporé (à son extrémité 5 ) une molécule d ATP[γ 32 P] (800 Ci/mmole), calculez le nombre de mole(s) d ARN synthétisés pendant les 10 minutes d incubation puis le nombre de mole(s) d ARN synthétisés par minute. c) Calculez le nombre de mole(s) de plasmide présente(s) dans le mélange transcriptionnel. (MM 1 pb = 660) d) Calculez l activité du promoteur T 3, en mole d ARN synthétisé par minute et par mole de promoteur. 50