Génération d anticorps monoclonaux par immunisation génique
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- Daniel Lapierre
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1 Génération d anticorps monoclonaux par immunisation génique Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010
2 Un partenariat Demandeur PADAM In Cell Art Projet Anticorps monoclonaux Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 2
3 PADAM : une plate-forme Plate-forme Automatisée e de Développement D d Anticorps d Monoclonux : Un savoir-faire reconnu dans la génération g d anticorps d monoclonaux et en culture cellulaire. Une plate-forme à la pointe de la technologie (automatisation des cultures, analyseur dynamique ). Une équipe à votre écoute qui vous conseille et vous accompagne dans vos projets. Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 3
4 In Cell Art : une société de biotechnologie Métier : développement de nanovecteurs synthétiques pour la formulation et la délivrance intracellulaire de macromolécules biologiques ARN ADN PROTEIN Délivrance intracellulaire Ciblage Efficacité Stabilité, biodisponibilité Nouvelles classes de vecteurs synthétiques Organisés à l échelle du nanomètre Dénués de toxicité Délivrance intracellulaire efficace INNOVATIVE DRUGS, VACCINES, ANTIBODIES Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 4
5 Technologies In Cell Art Vecteurs synthétiques pour le transfert de gène Lipides : transfection in vitro Nanospheres : transfection in vivo 50 nm Nanospheres Potentiel zéta <0 transfection in vitro inefficient Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 5
6 Technologies In Cell Art Vecteurs synthétiques pour le transfert de gène β-gal Nanospheres + Cytoplasme Plasmid DNA u uu u Naked DNA Nanospheres Naked DNA Nano Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 6
7 Du gène à l anticorps Immunisation conventionnelle Projet de développement d anticorps Immunogène protéique, peptidique, bactérie/virus inactivé Production, purification d un antigène recombinant, design de peptides Protéine Sérums : Ac polyclonaux Rate/ganglions : Ac monoclonaux Immunisation génique Projet de développement d anticorps Séquence informatique de l immunogène ADNc Sérums : Ac polyclonaux Rate/ganglions : Ac monoclonaux Production, purification, d un antigène recombinant, design de peptides Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 7
8 Du gène à l anticorps Les différentes étapes Etape 1: de la séquence au plasmide Séquence nucléique ou peptidique de l antigène Optimisation Synthèse / Clonage Production / Purification QC 2 constructions: -Plasmide d immunisation -Plasmide taggé pour cribles sérums Etape 2: du plasmide aux animaux immunisés * Formulation plasmide avec technologies Nanosphères IN CELL ART * Injections selon un protocole prime/boost (42 jours) + injection pré-fusion Injection 1 Injection 2 Injection pré-fusion J0 J21 J42 Sérums préimmuns Sérums J21 Sérums J42 Mise au point d une méthode de crible sur cellules transfectées Transfert des animaux vers la plateforme PADAM Antigènes intracellulaires : ELISA avec plasmide d immunisation Antigènes membranaires : WB / FACS avec plasmide taggé Antigènes secrétés : ELISA avec plasmide taggée Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 8
9 Exemples de projets Antigen Origin Bacterial enzyme Mycobacterium protein Recipients Mouse polyclonal, Dog polyclonal Mouse polyclonal Swine viral envelop protein Rhabdovirus Human Viral envelop protein Human retrovirus HCV Bovin protein Canine hormone Single pass type 1 membrane protein SHP-interacting leucine zipper protein, rat Dendritic cells Human B lymphocytes Human B lymphocyte receptor Human membrane receptor Mouse polyclonal Polyclonal rat (Neutralizing antibodies) Mouse polyclonal (Neutralizing antibodies) Mouse poly and monoclonal Mouse poly and monoclonal Mouse polyclonal Mouse polyclonal Mouse polyclonal Mouse polyclonal Rat poly Rat poly Rabbit polyclonal Mouse and Rabbit polyclonal Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 9
10 Du gène à l anticorps Les différentes étapes Etape 3: des animaux immunisés aux anticorps monoclonaux Protéine, peptide, etc. Fusion cellulaire Contrôle immunisation ADNc Criblages Etape 4: Congélations Production Caractérisation Amplifications Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 10
11 Les différentes étapes Caractérisation des anticorps générés Isotypage (IgG1, IgG2a, etc) Immuno-détection Immuno-précipitation Immuno-fluorescence Du gène à l anticorps Tests biologiques (Agoniste / Antagoniste) ELISA (dosage) Multiplexe (technologie Luminex) à partir d anticorps générés ET / OU commerciaux Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 11
12 Du gène à l anticorps Durée, modalités de réalisation et livrables d un programme Questionnaire Projet à compléter (séquence, utilisation finale de Ac, ) Durée Livrables Etape 1: Biologie moléculaire 4 à 6 semaines Plasmide et rapport QC Etape 2: Formulation plasmides, immunisations, suivi des réponses immunes 6 semaines Résultats ELISA/FACs/WB Échantillon de sérum Etape 3: Développement de l anticorps monoclonal (fusion cellulaire, amplification, congélations) 4 à 6 semaines Hybridomes et rapport complet de l ensemble du programme Etape 4: Production et purification de l anticorps Anticorps purifiés Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 12
13 Du gène à l anticorps Exemple 1 : anticorps anti-récepteur de cytokine Immunogène : récepteur membranaire de cytokine Transfert du plasmide à In Cell Art 5 souris C57BL6 de 8 semaines 3 injections de plasmide avec la technologie IN CELL ART Analyse des sérums 50 jours après la primo-injection par cytometrie de flux Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 13
14 Du gène à l anticorps Exemple 2 : Génération d anticorps dirigés contre une protéine virale Immunogène : Molécule virale humaine intracellulaire Contexte : faiblement immunogène, échec des approches conventionnelles Optimisation de séquence, clonage dans plasmide d immunisation, protocole 5 injections nécessaires Nombre d anticorps monoclonaux générés : 28 hybridomes Caractérisation par In Cell Art en WB/IF Sélection de 5 clones Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 14
15 Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 15
16 Du gène à l anticorps En résumé Pas besoin de protéine Anticorps dirigés contre antigène exprimé de façon native (conformation, glycosylation) Développement d anticorps dirigés contre des récepteurs, des canaux, des protéines virales, bactériennes 2 entrées, un processus, un produit Grand choix de criblage en fonction de utilisation finale des anticorps (FACS, ELISA WB) Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 16
17 Remerciements PADAM Gen2Bio 2010 Saint-Malo, mardi 30 mars 2010 Page 17
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