Ecole Supérieure de la Santé Techniciens en Analyses Biomédicales ES

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1 Ecole Supérieure de la Santé Techniciens en Analyses Biomédicales ES Séverine Gillioz 47 ème volée Stage d hématologie Laboratoire ICHV, Martigny Responsable : Philippe Godon

2 Sommaire Ce mémoire traite de la transmission à l hématologue des lymphocytoses en valeur absolue découvertes au laboratoire. Une statistique a été effectuée afin de connaître le pourcentage de pathologies lymphocytaires malignes de type non-hodgkinien découvertes au laboratoire ICHV de Martigny par rapport aux affections non-tumorales. Nous avons également tenté d établir des critères utilisables au laboratoire, qui permettent aux techniciens en analyses biomédicales ES (TAB ES) de discriminer les lymphocytoses tumorales et réactionnelles. Mots-clés : lymphocytose absolue, lymphome, lymphocytose de stress, lymphocytose réactionnelle, lymphocyte, morphologie lymphocytaire Keywords : absolute lymphocytosis, lymphoma, transient stress lymphocytosis, infectious lymphocytosis, morphology

3 Table des matières INTRODUCTION BUT GENERALITES LES LYMPHOCYTES Lymphocyte Lymphopoïèse Fonctions des lymphocytes a. Immunité humorale b. Immunité cellulaire Lymphocytoses a. Valeurs de référence en fonction de l âge b. Lymphocytose relative et absolue c. Etiologies Lymphocytoses réactionnelles ou secondaires a. Etiologies b. Aspects morphologiques au microscope c. Aspect du scattergramme de l automate Lymphocytoses tumorales ou primaires a. Classification b. Fréquence des différents lymphomes MATERIEL ET METHODES Automate HmX a. Principe de fonctionnement b. Principes de mesure c. Modes opératoires d. Numération et répartition leucocytaires e. Interprétation des résultats Matériel biologique Etude statistique

4 RESULTATS Statistique Critères décisionnels DISCUSSION CONCLUSIONS REMERCIEMENTS BIBLIOGRAPHIE Références bibliographiques Liste bibliographique LEXIQUE ANNEXES Tableau Récolte de cas de lymphocytoses absolues H. Diem T. Nebe B.Bain

5 Introduction L Institut Central des Hôpitaux Valaisans est une fondation faisant partie du Réseau Santé Valais, et qui regroupe les laboratoires de l hôpital de Sion ainsi que des hôpitaux régionaux de Brigue, Viège, Sierre, Martigny, Monthey et Aigle. Chaque laboratoire exécute principalement des analyses de chimie clinique et d hématologie ; ces dernières sont supervisées, pour les sites de Martigny et Monthey, par le même hématologue responsable. Dans un réseau tel que l ICHV, l un des objectifs primordiaux est l unification des procédures de travail pour tous les sites. Cela est normal, dans la mesure où l on considère tous les laboratoires précités comme une seule et même entité, l ICHV. Des différences importantes dans la prise en charge des analyses et des résultats doivent, lorsqu elles sont découvertes, être corrigées! Néanmoins, il apparaît certaines différences entres les laboratoires. La découverte d une lymphocytose absolue n implique pas les mêmes conséquences d un laboratoire à l autre. Ce travail de diplôme a donc été mis sur pied dans l objectif de normaliser cette situation

6 But Actuellement, le laboratoire ICHV de Martigny est dans l obligation de téléphoner à l hématologue lors de chaque découverte d une lymphocytose absolue. Cette procédure a été mise en place dans le but de détecter efficacement des pathologies malignes lymphocytaires telles que les lymphomes non-hodgkiniens. Cette exigence n est pas appliquée à tous les laboratoires ICHV supervisés par l hématologue responsable. Dans un souci d unification et de gain de temps, le site de Martigny souhaite trouver une solution alternative à celle appliquée actuellement, et qui puisse être la même pour tous les laboratoires ICHV supervisés par l hématologue responsable. L objectif de ce travail est, dans un premier temps, de réaliser une étude statistique afin de quantifier le nombre de pathologies lymphocytaires malignes découvertes au laboratoire de Martigny. Dans un second temps, nous chercherons à déterminer de nouveaux critères décisionnels, qui permettraient, directement au laboratoire, de limiter les suspicions de lymphomes. Nous avons choisi une approche se basant en grande partie sur la récolte d informations sur les lymphocytes et leurs pathologies. Nous chercherons à savoir comment les auteurs préconisent de traiter les lymphocytoses absolues découvertes au laboratoire, puis nous tenterons d en déduire des critères utilisables au laboratoire ICHV de Martigny

7 Généralités Les lymphocytes 1. Lymphocyte Les lymphocytes sont des leucocytes qui tiennent un rôle majeur dans le système immunitaire. Selon leur structure et leur fonction, on distingue le type B (Ly-B), le type T (Ly-T) et le type NK (Ly-NK). Au microscope, le lymphocyte apparaît comme une petite cellule ovoïde, à noyau rond entouré d une fine bordure de cytoplasme sans granulations, d un diamètre d environ 8 à 10 µm. Son rapport nucléo-cytoplasmique est élevé. La chromatine est condensée, souvent d aspect motté. Cette morphologie décrit des lymphocytes «en repos», appelés également lymphocytes de standard puisqu ils servent d étalon à l évaluation de la taille érythrocytaire. On ne peut pas différencier les lymphocytes -B et -T sur un frottis sanguin. Figure 1 : Lymphocyte normal dans le sang périphérique. (Pochet, 2007) Les lymphocytes sont présents dans le sang, la lymphe, les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse et thymus) et secondaires (ganglions, rate, îlots lymphoïdes périphériques tels que les amygdales, les plaques de Peyer). Ils ont la capacité de circuler du sang vers la lymphe, puis de la lymphe vers le sang, en passant par le canal thoracique et la veine sousclavière gauche. Cette propriété augmente leurs «chances» de rencontrer un antigène sur leur passage pour pouvoir amorcer la réponse immunitaire. (Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998) - 7 -

8 2. Lymphopoïèse Les cellules souches lymphoïdes sont issues de la moelle osseuse. Il semblerait que les deux types lymphocytaires -B et -T soient issus d une seule et même cellule souche totipotente, mais qu au cours de la différenciation, ils évoluent vers l un ou l autre type fonctionnel selon le milieu où ils sont formés et les influences auxquelles ils sont soumis. Au cours de la différenciation, la cellule souche lymphoïde va donner naissance à trois cellules : Un progéniteur lymphoïde B, qui restera dans la moelle osseuse. Sous l influence notamment de l interleukine 7 (IL-7), il va proliférer et se différencier. On définit 4 stades de différenciation : o Pro-B : les gènes codant pour les chaînes lourdes µ, puis pour les chaînes légères κ et λ sont réarrangés. o Pré-B : présence de chaînes µ intra-cytoplasmiques, sans chaînes légères. o B immature : expression d immunoglobulines de type M (IgM) de surface o B mature : expression d IgM et d immunoglobulines de type D (IgD) de surface. Cette maturation se poursuit tout au long de la vie, sous le contrôle des cellules du micro-environnement médullaire (cellules épithéliales, endothéliales) et des cytokines (IL-7). Lors de la différenciation médullaire, les Ly-B présentant un réarrangement génétique non fonctionnel ou qui sont auto-réactifs (défaut de la reconnaissance du soi), sont éliminés par apoptose

9 Les Ly-B matures vont quitter la moelle osseuse pour la circulation sanguine. Ils coloniseront les zones B des organes lymphoïdes secondaires et formeront des follicules, où ils achèveront leur maturation par l acquisition de marqueurs membranaires spécifiques, de récepteurs au fragment Fc des immunoglobulines et d immunoglobulines de surface. C est notamment au sein des organes lymphoïdes secondaires que le contact entre les lymphocytes B et les antigènes s établit. Un progéniteur lymphoïde T, qui va migrer de la moelle osseuse vers le thymus, où auront lieu une forte prolifération et la maturation. On décrit trois étapes de maturation : o Thymocytes corticaux : comme leur nom l indique, on les trouve dans la zone corticale du thymus. Ils sont en division active, et se différencient en deux stades appelés thymocytes précoces, plus immatures, et thymocytes communs. Les thymocytes corticaux sont soumis à une sélection par les molécules du complexe majeur d histocompatibilité (CMH), qui conduit à l élimination d environ 95% des lymphocytes formés dans le thymus. La sélection est à la fois positive et négative : les thymocytes immunocompétents, capables de reconnaître les antigènes présentés par les molécules CMH-I et CMH-II, franchissent l étape de la sélection positive, alors que les Ly-T non fonctionnels (auto-réactifs notamment) sont éliminés par la sélection négative. L objectif de cette sélection est donc de ne conserver que la minorité de cellules qui pourra reconnaître le propre système HLA de l hôte sans réagir avec ses propres antigènes tissulaires. o Thymocytes médullaires : ils se trouvent dans la medulla corticale. Ce sont des thymocytes matures et fonctionnels, qui expriment à leur surface soit le CD4, soit le CD8, qui vont quitter le thymus pour passer dans la circulation sanguine

10 o Lymphocytes matures : ils expriment soit le CD4, soit le CD8 et sont répartis entre les zones T des organes lymphoïdes secondaires et la circulation. Les lymphocytes circulants se déplacent de façon continue entre le sang et la lymphe. Lymphocytes NK (natural killer) : ces cellules portent le CD8, mais pas le récepteur TCR, spécifique de la lignée T. Jusqu à aujourd hui, les livres d hématologie décrivaient les Ly-NK comme dérivant d un précurseur commun aux cellules T. Certains ouvrages, notamment Hoffbrand, Pettit, Moss & Hoelzer, semblent penser qu un précurseur commun existe bien, mais qu il est moins différencié, et à l origine des cellules -B, -T et -NK. Les Ly-NK entrent dans la classe morphologique des grands lymphocytes granuleux, ou LGL. Ce sont des cellules mononuclées, qui ne possèdent pas tous les marqueurs spécifiques de la lignée -B ou -T (notamment le TCR). Les granulations correspondent à des organelles ressemblant à des lysosomes. Les Ly-NK portent les marqueurs CD16, CD57 ainsi que le récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines. Elles sécrètent des cytokines telles que IL-1, IL-2 et δ-if. Elles agissent principalement au niveau de la surveillance immunitaire anti-tumorale et antivirale. Ces cellules cytotoxiques sont capables d induire, sans immunisation préalable, la lyse des cellules cibles selon deux voies : o La cytotoxicité dépendante des anticorps (ADCC), déclenchée par le CD16, efficace pour lyser des cellules cibles recouvertes d anticorps. o La cytotoxicité naturelle, efficace pour lyser les cellules cibles n exprimant pas le CMH-I. (Zandecki, 2007 ; Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998 ; Fuchs, 2004)

11 Au sein des organes lymphoïdes secondaires, tels que les ganglions lymphatiques, les Ly-B et T présentent une organisation spatiale très particulière : La zone corticale, la plus externe, est composée en majorité de Ly-B. En son sein, ils sont organisés en follicules ; les follicules primaires sont nonstimulés et contiennent de petits lymphocytes mûrs, alors que les follicules secondaires sont stimulés, et composés d un centre germinatif (site de prolifération des Ly-B et de production d anticorps) et d une zone dite «du manteau». La zone para-corticale, plus interne, est composée de Ly-T. Ils ne se disposent pas en follicules. La zone médullaire, qui est la plus profonde, contient des Ly-B ainsi que des plasmocytes. Cette organisation spatiale est importante à relever pour bien comprendre la classification des lymphomes. En effet, les lymphomes qui se développent à partir de cellules matures montrent des caractéristiques similaires à une souspopulation lymphoïde présente dans les tissus lymphoïdes secondaires. Ainsi, le lymphome du manteau trouve son origine dans ces cellules de la zone entourant le follicule, qu on appelle «zone du manteau» ; ou on peut encore citer le lymphome folliculaire, composé de lymphocytes se trouvant dans les follicules. (Vuillemin, 2003)

12 3. Fonctions des lymphocytes Les lymphocytes sont les principaux agents de l immunité spécifique. Une étroite collaboration existe entre les Ly-B et -T, ainsi qu avec les cellules phagocytaires, afin de permettre la destruction des divers agents pathogènes. Lorsque toutes les barrières non spécifiques de l organisme ont été franchies par un quelconque pathogène, l immunité spécifique prend le relais, à travers les lymphocytes. L immunité spécifique se divise en deux grands groupes : l immunité humorale et l immunité cellulaire. (Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998) a. Immunité humorale Ce sont les Ly-B qui sont responsables de l immunité humorale. Ils sont capables de synthétiser des immunoglobulines spécifiques d antigènes solubles ou particulaires. Les antigènes sont phagocytés par les macrophages de la rate ou des ganglions, puis sont exposés à la surface membranaire de ces cellules : les cellules capables d exposer ainsi les antigènes s appellent des «cellules présentatrices d antigène» (CPA). Le déterminant antigénique est ensuite présenté à un Ly-T, qui va sécréter de l interleukine 1 (IL-1) ; cette dernière va activer les Ly-T CD4 (helper), qui vont à leur tour sécréter un facteur de croissance et de différenciation pour les Ly-B. Ces derniers se transforment en immunoblastes B, puis en plasmocytes. Chaque plasmocyte du même clone produit un seul type d anticorps, spécifique de l antigène ou d un déterminant antigénique particulier. Ce sont tout d abord des IgM qui sont produits, puis les IgG

13 Afin de pouvoir produire une population d immunoglobulines aux spécificités aussi diverses que les antigènes potentiels, les gènes codants pour les chaînes lourdes et légères sont réarrangés par rapport à leur configuration germinale au cours des premières phases de la maturation des Ly-B. Les exons des régions variable, hypervariable, de jonction et constante subissent une série complexe d épissages, de délétions et de juxtaposition d ADN ; l aboutissement de ces remaniements est une gamme d immunoglobulines extrêmement variée. Les anticorps produits sont amenés vers l endroit de la stimulation antigénique par les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Ils se lient à l antigène, et le complexe antigène-anticorps formé est détruit, soit par phagocytose, soit par opsonisation, soit par activation du complément. Un certain nombre de plasmocytes redeviennent des Ly-B à l état de repos, et conservent en mémoire le contact antigénique. Lors d un contact ultérieur avec le même antigène, ils seront capables de produire des anticorps de type IgG plus rapidement et en plus grande quantité. On appelle ce phénomène la réponse anamnestique. (Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998) b. Immunité cellulaire Les Ly-T sont chargés de la réponse immune cellulaire. D une façon générale, les différents sous-groupes de Ly-T sont dirigés contre le non-soi : virus, allogreffes, cellules tumorales. Après le contact avec l élément pathogène, les Ly-T sensibilisés migrent vers le ganglion le plus proche et se transforment en immunoblastes-t, qui vont à leur tour se diviser pour produire plusieurs types de Ly-T :

14 T helper : ils portent le marqueur CD4, et sont nécessaires à la reconnaissance de l antigène présenté par les macrophages. Activés, ils sécrètent des lymphokines, qui permettent le déclenchement de la réponse immune. Ces molécules interviennent dans plusieurs processus : o Transformation et prolifération des Ly-B o Augmentation de la synthèse d immunoglobulines par les plasmocytes o Activation des Ly-T cytotoxiques o Recrutement et activation des cellules phagocytaires T suppresseurs : ils portent le marqueur CD8 ; ce sont des régulateurs des réponses humorale et cellulaire. Lorsqu ils sont présents, la production d immunoglobulines diminue, jusqu à s arrêter. T cytotoxiques : ce type de Ly-T, qui exprime également le CD8, est capable de réagir directement avec l antigène, et de détruire la cellule indésirable par cytolyse. L action lytique est liée à la reconnaissance des antigènes du CMH, classes I et II. Il ne faut pas les confondre avec les cellules NK et K, qui entrent dans le groupe des LGL. T mémoire : une petite partie des Ly-T impliqués dans la réponse à médiation cellulaire conserve la mémoire de l antigène qui les a stimulés. Ils deviennent des Ly-T au repos, circulants, qui pourront reconnaître un antigène rencontré ultérieurement. (Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998)

15 En résumé : Lymphocytes-B : o Présentation et reconnaissance de l antigène o Production d immunoglobulines o Fonction de mémoire. Lymphocytes-T : o Reconnaissance de l antigène o Régulation de la réponse immunitaire o Fonctions effectrices o Fonction de mémoire. Lymphocytes-NK : o Cytotoxicité o Production de cytokines

16 4. Lymphocytoses La lymphocytose se définit par une élévation au-delà des valeurs de référence, du nombre de lymphocytes par litre de sang. a. Valeurs de référence en fonction de l âge Dans tout lymphocytose absolue découverte au laboratoire, il est extrêmement important de tenir compte de l âge du patient. En effet, les valeurs de référence de tous les paramètres sanguins varient fortement en fonction de l âge. Les leucocytes et les lymphocytes présentent eux aussi des taux variables, comme le montre le tableau ci-dessous : Age Leucocytes G/L Lymphocytes % Lymphocytes G/L (calcul) Nouveau-né mois ans ans ans ans Adulte Tableau I : Intervalles de référence en fonction de l age. (Roh, 2000) b. Lymphocytose relative et absolue Il est important de distinguer une lymphocytose relative d une lymphocytose absolue : Lymphocytose relative : Pour les Drs. Zenhäusern, Lovey et Stalder (2006), «la lymphocytose relative est définie par un pourcentage de lymphocytes supérieur à 50% des leucocytes.» Cette lymphocytose peut néanmoins être seulement apparente : le pourcentage de lymphocytes par rapport aux leucocytes totaux est augmenté, sans qu il y ait augmentation du nombre absolu de lymphocytes par litre. Dans les lymphocytoses relatives, le nombre de leucocytes est souvent compris dans les valeurs de référence ou diminué, et la lymphocytose apparente est le résultat de la diminution d un autre type cellulaire (neutrophiles par exemple)

17 Lymphocytose absolue : augmentation du nombre absolu de lymphocytes par litre au-delà de 4 G/L, accompagnée ou non d une modification du pourcentage de lymphocytes. (L Italien, 1998) Le tableau ci-dessous donne un exemple de lymphocytose relative et absolue, en tenant compte des valeurs de référence pour l adulte : Lymphocytose absolue WBC : 12 G/L Lymphocytose relative WBC : 4 G/L Ly % : 40 % Ly % : 60% Ly # : 12 G/L x 40% = 4.8 G/L, soit supérieur à l intervalle de référence adulte. Ly # : 4 G/L x 60% = 2.4 G/L, soit compris dans l intervalle de référence adulte. Tableau II : Lymphocytose absolue et relative. (L Italien, 1998) c. Etiologies Deux grands cadres étiologiques peuvent être mis en évidence lors d une lymphocytose : Lymphocytoses réactionnelles (ou secondaires), associées à un contexte infectieux ou viral Lymphocytoses tumorales (ou primaires), liées à une maladie lymphoproliférative. (Zenhäusern, Lovey & Stalder, 2006 ; Van den Neste, Scheiff & Michaux, 2002) L un des objets de ce travail de diplôme est de définir des critères qui pourront être utilisés au laboratoire afin de différencier les deux étiologies

18 5. Lymphocytoses réactionnelles ou secondaires Chez l enfant, comme nous l avons démontré précédemment, une lymphocytose supérieure à 4 G/L est la plupart du temps physiologique, et parfois réactionnelle. Il devient crucial de savoir distinguer une lymphocytose réactionnelle d une lymphocytose tumorale chez l adulte. a. Etiologies La lymphocytose réactionnelle traduit une réaction immunitaire spécifique à un antigène, qui est le plus souvent déclenchée par un agent infectieux viral, mais parfois également par une infection bactérienne ou une autre cause non -tumorale. Selon Van der Neste, Scheiff & Michaux (2002), diverses étiologies sont possibles : Syndromes mononucléosiques : EBV, CMV, toxoplasmose, HIV, Herpes simplex / zoster, hépatites virales, rubéole, adénovirus, allergies médicamenteuses. Infections sans syndrome mononucléosique : coxsackie, rougeole, oreillons, coqueluche, brucellose, tuberculose. Lymphocytose persistante (chronique) : maladies auto-immunes, lymphocytose polyclonale du fumeur, inflammation chronique, hyposplénisme, splénectomie, sarcoïdose, thymome, granulomatose de Wenger, maladies endocriniennes. Lymphocytose de stress. Dans ce cadre réactionnel, les lymphocytoses de stress doivent être citées. En effet, une étude publiée en 2002 a évalué 52 cas consécutifs de lymphocytose absolue découverte au laboratoire. Chaque cas était associé à des conditions médicales hautement stressantes pour le patient. Les auteurs ont constaté que la numération des lymphocytes s élevait dans un intervalle de 4 à 10.4 G/L ; parallèlement, les leucocytes, les neutrophiles ainsi que les thrombocytes augmentaient. Pour les cas étudiés, les lymphocytoses retournaient dans des valeurs normales dans les 7 à 569 H suivant le diagnostic, avec une moyenne à 32 H

19 L étude immunophénotypique a révélé une augmentation absolue des Ly-B, -T et -NK similaire à celle qui se produit lorsque de l épinéphrine est administrée. Les lymphocytes présentaient une morphologie distincte de celle observée dans les syndromes viraux classiques ; bien que caractéristique, elle n était néanmoins pas pathognomonique. Il n a malheureusement pas été possible de trouver des données précises sur la morphologie de ces lymphocytoses de stress ; de plus, de nombreux auteurs (dont Mme Barbara J. Bain, auteur de «Blood Cells», 2006) citent cette étiologie dans leurs ouvrages. Nous avons contacté Mme Bain par , mais il ne lui a pas été possible de nous donner une explication précise et documentée sur le sujet (annexe 4). b. Aspects morphologiques au microscope i. Morphologie Certaines formes morphologiques sont caractéristiques d une lymphocytose réactionnelle. Ainsi, cette étiologie doit être évoquée devant des lymphocytes présentant les particularités suivantes : Cytoplasme hyperbasophile, pouvant présenter quelques granulations azurophiles regroupées Grande taille, 2 à 3 fois plus grand que le petit lymphocyte Rapport nucléo-cytoplasmique faible Noyau rond, parfois incurvé Chromatine dense Figure 2 : Lymphocyte activé, coloration Un ou plusieurs nucléoles Archoplasme proche du noyau. MGG. (Pochet, 2007) Les lymphocytes présentant ces caractéristiques se nomment également lymphocytes activés ou stimulés. (Schillinger, 2006)

20 ii. Polymorphisme Selon Schillinger (2006) : «La coexistence de ces cellules [hyperbasophiles] avec d autres, moins basophiles et moins caractéristiques, présentant tous les intermédiaires entre le petit lymphocyte et le plasmocyte, définit le caractère hétérogène et polymorphe de ces lymphocytoses réactionnelles, auquel on oppose souvent le caractère plutôt homogène d une population monoclonale». Une lymphocytose réactionnelle se traduit donc par une image lymphocytaire polymorphe, comprenant des lymphocytes classiques ainsi que des lymphocytes activés. Figure 3 : Lymphocytes polymorphes au MGG : lymphocyte normal en haut à gauche, lymphocytes atypiques sur les autres images. Homme de 21 ans atteint de mononucléose infectieuse. (Zandecki, 2006)

21 iii. Large Granular Lymphocytes (LGL) Ces cellules, caractérisées par leur grande taille et la présence de grains azurophiles nets dans un cytoplasme abondant et pâle, peuvent se trouver à l état physiologique en faible quantité (10 à 15%). Figure 4 : Un LGL au MGG, avec son noyau mature et de nombreuses granules azurophiles dans le cytoplasme. (Maslak, 2004) Selon Schillinger (2006), «ils peuvent excéder 15% [des lymphocytes totaux] dans les infections virales et bactériennes, dans les suites de greffes de moelle, et en réaction à un syndrome lymphoprolifératif. Dans tous les cas, l augmentation du nombre de LGL est temporaire et polyclonale.». Au cours de l étude statistique, nous avons remarqué une erreur récurrente : lors de la répartition manuelle, les LGL étaient souvent comptés comme des lymphocytes stimulés. Les TAB ES doivent être particulièrement rigoureux avec les critères cités plus haut pour bien différencier les deux types de cellules!

22 c. Aspect du scattergramme de l automate Dans les cas de lymphocytoses réactionnelles, le scattergramme montre une population lymphocytaire augmentée, d aspect hétérogène. La grappe des lymphocytes est plus grande, et plus étalée que dans une situation normale. Figure 5 : Cas de mononucléose infectieuse. Figure 6 : Cas d infection par un virus. (Figures 5 & 6 : CD-Rom Beckman-Coulter VCS-Workshop, 2006) Figure 7 : Scattergramme DF1, mononucléose infectieuse. Les grands lymphocytes basophiles ont été comptés dans la zone monocytaire, ce qui explique la traînée qui s étire vers le haut. (Beckman Coulter, 2000)

23 6. Lymphocytoses tumorales ou primaires Ce type de lymphocytose est caractérisé par une prolifération lymphoïde tumorale, à partir du tissu lymphoïde ; on l appelle aussi lymphome. Les cellules lymphoïdes tumorales peuvent se disséminent dans le sang, et ainsi être vues sur le frottis. a. Classification Il existe plusieurs dizaines de types de lymphomes, très hétérogènes, qui sont répertoriés dans la classification actuelle de l OMS. Cette classification prend en compte plusieurs critères : morphologie, clinique, immunologie et génétique moléculaire. Les lymphomes trouvent leur origine dans le tissu lymphoïde normal ; on assiste à un développement monoclonal de cellules lymphoïdes bloquées à un stade de maturation donné. Les cellules clonales se trouvent surtout dans les tissus et organes lymphoïdes. (Sébahoun, 2005 ; L Italien, 1998) Tous les lymphomes ne présentent pas de phase dite leucémique, qui correspond au passage des cellules tumorales dans le sang. Certains lymphomes sont mêmes totalement aleucémiques, comme la maladie de Hodgkin, le plasmocytome ou la plupart des lymphomes à cellules précurseurs. (Theml, Diem & Haferlach, 2002) Trois grandes catégories peuvent être mises en avant : les lymphomes T (15% de tous les lymphomes), les lymphomes B (75%) et la maladie de Hodgkin. (Zenhäusern, Lovey & Stalder, 2006 ; Lovey, Anchisi, Stalder & Zenhäusern, 2006)

24 La classification officielle de l OMS sépare les lymphomes de la manière suivante : Lymphomes B Lymphomes à précurseurs B Leucémie aiguë/ lymphome lymphoblastique B Lymphomes à cellules B matures Leucémie lymphoïde chronique B/ lymphome à petits lymphocytes Lymphome prolymphocytaire B Lymphome lymphoplasmocytique Lymphome splénique des zones marginales Leucémie à tricholeucocytes Myélome plasmocytaire Plasmocytome Lymphome extraganglionnaire des zones marginales des tissus lymphoïdes annexés aux muqueuses Lymphome B ganglionnaire des zones marginales (± B monocytoïde) Lymphome folliculaire Lymphome à cellules du manteau Lymphome diffus à grandes cellules B Sous types : médiastinal, primitif des séreuses, intravasculaire Lymphome de Burkitt Lymphomes T Lymphomes à précurseurs -T Leucémie aiguë/ lymphome lymphoblastique T

25 Lymphomes à cellules -T ou NK matures Leucémie lymphoïde chronique T Leucémie prolymphocytaire T Leucémie à LGL Syndrome de Sézary Leucémie à cellules NK Lymphome T/NK extraganglionnaire nasal et type nasal (lymphome angiocenrique) Mycosis fongoïde Lymphome cutané primitif à grandes cellules anaplasiques Lymphome T sous-cutané de type panniculite Lymphome T intestinal type entéropathique Lymphome T hépatosplénique Lymphome T angio-immunoblastique Lymphome T périphérique non-spécifié Lymphome T anaplasique à grandes cellules Lymphomes de Hodgkin Maladie de Hodgkin à prédominance lymphocytaire nodulaire Maladie de Hodgkin classique Lymphome de Hodgkin sclérosant nodulaire Lymphome de Hodgkin classique riche en lymphocytes Lymphome de Hodgkin à cellularité mixte Lymphome de Hodgkin en déplétion lymphocytaire Tableau III : Classification OMS des lymphomes. (Jaffe, Harris, Stein & Vardiman, 2001) Dans le cadre de ce travail, les différents sous-types de lymphome de Hodgkin seront volontairement écartés. Les auteurs consultés soulignent que l on ne trouve généralement pas de lymphocytose sanguine dans les lymphomes de Hodgkin. Les signes évoqués sont la neutrophilie, l éosinophilie ainsi que la lymphopénie ; cela signifie qu un lymphome de type Hodgkin ne sera pas détecté sur un frottis sanguin, le diagnostic est posé uniquement sur une biopsie ganglionnaire. Il n y a donc pas d intérêt à traiter de cette pathologie dans le cadre de ce travail de diplôme. Nous nous limiterons donc aux lymphomes non-hodgkiniens (LNH). (L Italien, 1998 ; Sebahoun, 2005 ; Bain, 2006 ; Hoffbrand, 2003)

26 Il faut encore relever que tous les LNH ne se comportent pas de la même façon. On distingue les entités suivantes : Lymphomes indolents ou de bas grade de malignité : o 30-40% des lymphomes o Evolution lente, survie de plusieurs années même sans traitement o Pas de traitement curatif o LLC, lymphome folliculaire, lymphome à tricholeucocytes, Lymphomes agressifs ou de haut grade de malignité o 50% des lymphomes o Evolution rapide, survie courte qui se compte en mois ou en semaines sans traitement o Traitement potentiellement curatif. o Lymphome à cellules du manteau, plasmocytome, myélome plasmocytaire, lymphome diffus à grandes cellules B, lymphome B médiastinal, lymphome de Burkitt (

27 b. Fréquence des différents lymphomes Figure 8 : Incidence des différents lymphomes. (Jaffe, Harris, Stein & Vardiman, 2001) Le nombre de LNH différents répertoriés rend impossible la description détaillée de la morphologie sanguine et des critères cliniques de chacun. Néanmoins, la formule sanguine et le frottis d un patient atteint de LNH feront suspecter une pathologie ; la présence de cellules très jeunes ou encore l aspect très monotone du frottis sanguin doit éveiller la vigilance du TAB ES

28 Matériel et Méthodes 1. Automate HmX a. Principe de fonctionnement Figure 9: Analyseur HmX, Beckman Coulter (Beckman Coulter, 2007) L analyseur d hématologie HmX, de la maison Beckman Coulter, est utilisé au laboratoire ICHV de Martigny pour toute la routine hématologique. Il permet d effectuer les FSS, les FSC et le comptage des réticulocytes en des temps courts, de manière totalement automatique. Les paramètres suivants sont analysés : Formule simple : WBC RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW PLT, MPV Graphiques RBC et PLT. Formule complète : WBC et répartition leucocytaire en 5 populations (neutrophiles, lymphocytes, monocytes, éosinophiles, basophiles) RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW PLT, MPV Graphiques RBC et PLT Scattergrammes WBC DF1, DF2, DF3. (Beckman Coulter, 2001)

29 b. Principes de mesure i. Volumétrie Le passage de cellules en suspension dans un liquide conducteur à travers un orifice calibré modifie la résistance électrique entre deux électrodes. On appelle cette méthode le «principe Coulter», du nom de son inventeur, Wallace Coulter, ou encore «mesure par variation d impédance». Electrode interne Vide régulé Electrode externe Liquide conducteur Orifice Flux de diluant Figure 10 : Principe Coulter. (Vieillefont, s.d.) A chaque passage d une cellule à travers l orifice, la modification de la résistance électrique entre les électrodes est enregistrée sous forme d impulsion. La hauteur du pic de l impulsion est proportionnelle au volume de la cellule détectée, et le nombre de pics correspond au nombre de particules ayant traversé l orifice. U Temps Figure 11 : Enregistrement des impulsions : passage de deux cellules de tailles différentes. (Vieillefont, s.d.)

30 Le nombre d impulsions enregistrées pour chaque volume défini (Figure 12, à gauche) correspond au nombre de cellules qui sont passées à travers l orifice durant un intervalle de temps défini (4 secondes). Les cellules sont ensuite classées en fonction de leur volume dans différents canaux (Figure 12, à droite), ce qui permet de construire des histogrammes érythrocytaires et plaquettaires. Figure 12 : construction des histogrammes, répartition des impulsions dans les canaux (Vieillefont, s.d.) Une résolution élevée correspond à un nombre de canaux élevé, qui traduit avec précision la réalité. Si la résolution est trop faible, la répartition volumétrique vraie des cellules est faussée. L automate HmX possède 256 canaux pour chacune des trois dimensions, soit un total de = 16'777'216 canaux. Une distribution mathématiquement exploitable est ainsi obtenue. Ce sont ces histogrammes, extrapolés, que l on retrouve sur la feuille de résultat que nous rend l automate. Si deux cellules traversent en même temps l orifice, elles ne génèrent qu une seule impulsion de grande amplitude : c est le passage en coïncidence. La fréquence de la coïncidence étant statistiquement prévisible en fonction du nombre de cellules, l analyseur effectue automatiquement la correction nécessaire

31 Les impulsions sont triées, de façon à ne garder que celles qui correspondent à un trajet standard à travers l orifice. Figure 13 : enregistrement de l impulsion en fonction du passage de la cellule à travers l orifice. (Vieillefont, s.d.) Afin d empêcher les cellules de retourner dans la zone de détection après leur passage à travers l orifice, un système de flux de balayage existe ; le diluant passe à la sortie de l orifice. Ce dispositif est particulièrement utile pour le comptage plaquettaire, qui peut être perturbé par des micro-impulsions. (Beckman Coulter, 2001) Zone de détection Sans flux de balayage Flux de balayage en vert Figure 14 : Action du flux de balayage sur le trajet des cellules. (Vieillefont, s.d.)

32 ii. Cytométrie multidimensionnelle La cytométrie mutidimensionnelle est une méthode qui permet de caractériser les cellules. L échantillon est mélangé à un agent lysant, qui détruit les érythrocytes ; puis un agent stabilisant est ajouté, ce qui stoppe la lyse et permet de conserver les leucocytes dans une condition proche de l état in vivo. Le mélange est ensuite envoyé dans la cellule de mesure. Un gainage fluidique oblige les cellules à se présenter les unes après les autres : c est la focalisation hydrodynamique. Cellule de mesure Flux de gainage Flux échantillon Flux de gainage Figure 15 : Architecture de la cellule de mesure. (Vieillefont, s.d.) Au niveau de la cellule de mesure se trouve un point unique de mesure : des électrodes enregistrent les variations d amplitude et de fréquence d ondes électromagnétiques, et un banc optique, dont la source lumineuse est un canon laser hélium néon à 633 nm, émet un rayon qui est focalisé, verticalement et horizontalement, pour produire un faisceau elliptique qui assure l illumination constante des cellules

33 Les leucocytes, lorsqu ils traversent la cellule de mesure les uns après les autres, sont soumis à trois mesures physiques simultanées : Mesure du volume : comme précédemment, la variation d impédance est mesurée (principe Coulter). Figure 16 : mesure du volume par le principe Coulter. Mesure de la diffraction laser : le faisceau laser hélium néon est diffracté de façon caractéristique en fonction de la structure interne, de la nature des granulations et de la surface membranaire du leucocyte ; plus le leucocyte est granuleux, plus il diffracte la lumière. Cette diffraction varie entre des angles allant de 10 à 70 degrés. Figure 17 : mesure de la diffraction laser. Mesure de la conductivité : un courant haute fréquence traverse le leucocyte ; ce dernier va modifier le courant en fonction de la structure de son noyau (forme, densité chromatinienne, nucléoles) et de la composition chimique de son cytoplasme ; plus le noyau est lobé et le cytoplasme riche, plus le passage du courant est freiné. Cette mesure permet de différencier des leucocytes de même volume mais de contenus différents par leur rapport nucléo-cytoplasmique. Figure 18 : mesure de la conductivité. Les trois mesures sont effectuées simultanément sur chaque cellule, et leur combinaison permet l identification de chacune. On nomme ces mesures «technologie VCS», pour Volume/Conductivité/Scatter light. (Document de qualité MAX M, ) Figure 19 : mesures simultanées. (Figures 11,12,13 & 14 : Beckman Coulter, 2007)

34 c. Modes opératoires iii. Prise en charge des échantillons Lorsque le sang est aspiré dans l automate, il est segmenté en 3 aliquotes : Un échantillon pour la mesure par volumétrie : numération et distribution érythrocytaires et plaquettaires. Un échantillon pour la mesure par volumétrie et photométrie : numération leucocytaire et dosage de l hémoglobine. Un échantillon pour l analyse cytométrique multidimensionnelle : formule leucocytaire et réticulocytes. (Beckman Coulter, 2001) d. Numération et répartition leucocytaires Les numérations et distributions éythrocytaires et plaquettaires ne seront pas expliquées dans ce travail, pour permettre de se concentrer sur les paramètres leucocytaires. Le nombre de leucocytes est obtenu par analyse de l échantillon selon le principe Coulter, à partir d une suspension où les érythrocytes ont été lysés. La dilution est au 1/250 ème. Les mesures sont enregistrées à partir d un volume de 20 fl, mais la population leucocytaire est comptée seulement à partir de 35 fl. Une vérification d éventuelles interférences est effectuée entre 30 et 35 fl. (Document de qualité MAX M, ) La répartition leucocytaire est effectuée par cytométrie multidimensionnelle, selon le principe expliqué plus haut. L automate effectue sa répartition sur plus de 8'000 cellules. Le HmX distingue 5 populations leucocytaires : Les neutrophiles Les lymphocytes Les monocytes Les éosinophiles Les basophiles

35 Chaque type cellulaire est exprimé en pourcentage ainsi qu en valeur absolue ; ce résultat est obtenu à partir de l analyse multidimensionnelle. Les résultats sont également rendus sous forme graphique en trois dimensions : le scattergramme. Chaque cellule analysée est placée dans un cube, en fonction du résultat de chacun des paramètres mesurés par la cytométrie : volume, conductivité et diffraction laser. Chaque type cellulaire présentant des caractéristiques VCS propres, des grappes de cellules se forment sur le scattergramme. Ces populations cellulaires peuvent être identifiées par leur position sur le graphique. BA LY M NE EO Sur les scattergrammes présentés : Les lymphocytes sont codés en bleu Les monocytes sont codés en vert Les neutrophiles sont codés en violet Les éosinophiles sont codés en orange Les basophiles sont codés en gris clair. Figure 20 : Vision schématique en 3 dimensions du scattergramme DF1 normal (Berard, 2004) V o l u m e Conductivité noyau Diffraction : Surface,granulations Figure 21 : Vue en 3D du scattergramme normal, avec légende des axes. (Vieillefont, s.d.)

36 Il n est bien sûr pas possible, sur les feuilles de résultat que nous rend l appareil, de représenter des graphiques en trois dimensions. Ils sont donc représentés en deux dimensions, et on peut obtenir plusieurs graphiques différents selon quelle face du cube on observe. Ces différents graphes se nomment DF1 (ordonnée : volume ; abscisse : diffraction), DF2 et DF3. (Hoogendijk, 2004) Figure 22 : Vue DF1, DF2 et DF3 d un scattergramme normal. (Coulter, 1997) e. Interprétation des résultats Pour interpréter les résultats des formules rendues par le HmX, les TAB ES doivent prendre en compte plusieurs éléments : Les scattergrammes, qui doivent montrer des populations cellulaires bien différenciées. Lorsque ce n est pas le cas, le TAB ES doit tirer un frottis et l examiner au microscope, quelles que soient les valeurs de la répartition données par l automate. Les messages affichés par le HmX peuvent être de trois types différents : o Les messages globaux, qui qualifient le bilan des différentes lignées cellulaires (normales ou anormales). o Les messages quantitatifs, qui indiquent que les résultats obtenus se situent hors des intervalles de référence établis par l utilisateur. o Les messages de suspicion, qui signalent des anomalies morphologiques. Il n y a pas de limite établie par le laboratoire pour ces messages, c est le système lui-même qui les génère

37 Les alarmes sont données par l automate sous forme de codes, lorsqu une anomalie survient lors du comptage des échantillons. Les résultats précédents doivent être pris en compte pour les patients connus du laboratoire. Il est important, lors de la validation, de tenir compte des résultats des dernières analyses si ces dernières ne dépassent pas 72h (critère propre à l ICHV!). Si la différence entre les résultats est trop importante, il faut faire une répartition manuelle. (Documentation Beckman Coulter, Messages et alarmes HMX, s.d. ; Documentation Beckman Coulter, 1999) 2. Matériel biologique Les échantillons utilisés pour la statistique ont été recueillis aux laboratoires ICHV de Martigny et Monthey entre début septembre 2007 et fin janvier Il s agissait d échantillons de sang complet prélevé sur EDTA. L EDTA-K 2, ou acide éthylène-diamine-tétraacétique dipotassique, est l anticoagulant de choix selon les recommandations de l International Council for Standardization in Haematology (ICSH). C est l anticoagulant utilisé pour toute la routine hématologique des laboratoires ICHV. L EDTA empêche la coagulation, en chélatant le calcium et en l empêchant ainsi de s ioniser et de provoquer la formation d un caillot. L EDTA permet de conserver intacts les érythrocytes et les leucocytes. Il faut néanmoins respecter un délai de 20 à 30 minutes avant de passer le tube sur l automate lorsqu une FSC est demandée ; en effet, un excédent de potassium est apporté par l anticoagulant dans le tube de sang. Pour tenter de rétablir la pression osmotique, les leucocytes rejettent leur eau et absorbent du potassium, ce qui se traduit par une diminution du volume cellulaire. L équilibre entre les cellules et le plasma est retrouvé en minutes, et à ce moment les leucocytes ont à nouveau un volume proche de l état in vivo. (L Italien, 1998 ; Beckman Coulter, 2006)

38 3. Etude statistique Afin de récolter un nombre suffisant de cas, les TAB ES ont reçu les directives suivantes pour résultat de lymphocytose absolue : La routine hématologique est passée sur l automate HmX, en mode primaire L automate rend un résultat de lymphocytes supérieur à 4 G/L Tirer un frottis sanguin supplémentaire Identifier le frottis par son NLab Colorer le frottis, puis le ranger dans la boite de collection prévue à cet effet Téléphoner au service duquel vient le patient pour obtenir des renseignements cliniques Téléphoner à l hématologue responsable pour savoir si le frottis doit être envoyé à Sion pour des examens complémentaires et noter sa réponse sur la feuille de résultats de l automate Photocopier la feuille de résultats de l automate, avec les renseignements récoltés. Nous avons ainsi pu récolter 74 cas de routine documentés entre septembre 2007 et janvier 2008, sur un total de 4306 FSC demandées. Nous avons répertorié les cas dans un fichier Excel (annexe 1). Dans un second temps et grâce à l aide du Docteur Lovey, nous avons pu obtenir des diagnostics précis pour chacun des cas. Nous avons ensuite établi une statistique avec les données obtenues. Il faut relever que cette statistique n est pas le reflet exact de la réalité ; les raisons en sont expliquées dans la conclusion de ce travail. De plus, nous avons été confrontés à l obligation d écarter un cas de la statistique ; en effet, la répartition leucocytaire de l automate ne correspondait absolument pas à la répartition manuelle. Il est possible qu il y ait eu une erreur lorsque le frottis a été confectionné, et que la lame soit celle d un autre patient

39 Etant donné la complexité de la classification des lymphomes et la volonté de définir des critères utilisables au laboratoire, nous avons choisi de classer les cas récoltés en deux catégories seulement : Cas présentant une pathologie lymphocytaire de type non-hodgkinien Cas présentant une autre étiologie. Sous cette dénomination sont donc regroupées les lymphocytoses réactionnelles, quelle qu en soit l origine précise, ainsi que les cas qui n ont pas suscité d inquiétude à l hématologue responsable lorsque le cas lui a été exposé par téléphone, et pour lesquels nous considérons qu un LNH est exclu

40 Résultats L objectif de ce travail est double : dans un premier temps, réaliser une étude statistique qui permette de quantifier le nombre de pathologies lymphocytaires malignes découvertes au laboratoire ICHV de Martigny. Dans un second temps, des critères décisionnels seront proposés, qui devraient permettre d exclure des suspicions de LNH dès le laboratoire, sans devoir passer par un hématologue. 1. Statistique Le résultat de l étude statistique est résumé dans le tableau ci-dessous : Total des cas Nombre de LNH LNH en pourcent Nombre d autres étiologies Autres étiologies en % % % Tableau IV : Résultats de l étude statistique. Sur les 73 cas récoltés, 20 proviennent du laboratoire de Monthey, et 53 du laboratoire de Martigny ; sur les 6 cas de LNH, 3 patients étaient déjà connus pour leur pathologie, et 3 ont été des découvertes au moment de la récolte de cas. Nous avons ensuite cherché à comparer les données des cas analysés : LNH Autre étiologie non-lnh WBC G/L Lymphocytes % Lymphocytes G/L (calcul sur la base du comptage manuel) Date de naissance Tableau V : Comparaison des données. Sur les 6 LNH compris dans les cas récoltés, trois, soit 50%, sont des cas de LLC

41 B. Les autres patients présentaient respectivement une leucémie à prolymphocytes T, un lymphome de la zone marginale ayant évolué en maladie de Hodgkin ainsi qu un lymphome lymphoplasmocytaire (maladie de Waldenström). 2. Critères décisionnels La découverte d une lymphocytose absolue au laboratoire impose de discriminer les deux étiologies principales : réactionnel vs tumoral. Selon Van den Neste, Scheiff & Michaux (2002), «le plus important est d exclure une monoclonalité qui signe généralement un processus lymphoprolifératif tumoral» (p.67). Lors de la prise en charge du patient dans sa globalité, de nombreux éléments entrent en ligne de compte. Le contexte et l examen clinique, l anamnèse, d autres anomalies biologiques associées, le frottis sanguin, l immunophénotypisation ainsi que la cytogénétique font partie de la démarche diagnostique totale. Une partie de ces éléments est disponible pour le laboratoire, mais certains critères ne sont pas accessibles aux TAB ES. Lorsque le laboratoire téléphone à l hématologue responsable du laboratoire ICHV de Martigny, pour lui signaler une lymphocytose absolue, il utilise les critères suivants pour différencier une lymphocytose tumorale d une lymphocytose réactionnelle : Age : au-delà de 40 ans, les risques de LNH augmentent. Contexte clinique : o Symptômes d infection virale o Stress (allergie, infarctus du myocarde) o Manifestations associées suggestives d un LNH, telles que adénopathies, état fébrile, perte pondérale, sudations inexpliquées, splénomégalie. Autre formule sanguine récente, afin de déterminer si la lymphocytose est persistante. Importance de la lymphocytose

42 Cytopénie associée : o Dérèglement auto-immun associé au lymphome o Infiltration médullaire lymphomateuse o Splénomégalie. Morphologie : o Lymphocytes monomorphes o Lymphocytes polymorphes. Scattergramme Autres examens réalisés : o Immunophénotypisation o Ponction biopsie de moelle. Selon ces critères, l hématologue responsable décide s il est nécessaire d exécuter d autres examens afin d éclaircir la situation. Certains des critères énoncés plus haut sont accessibles au laboratoire : La morphologie : lorsque l automate rend une lymphocytose, les TAB ES sont particulièrement attentifs à la morphologie des lymphocytes sur le frottis. L âge du patient : les étiquettes collées sur chaque tube ou feuille de résultat mentionnent la date de naissance complète. Résultats précédents : grâce au système informatique, les TAB ES peuvent avoir accès à des résultats antérieurs, s il y en a. Importance de la lymphocytose en valeur absolue : l automate rend une valeur numérique précise. Cytopénie associée : d autres cytopénies sont immédiatement visibles sur la feuille de résultat. Scattergramme : chaque résultat de FSC est accompagné du scattergramme des leucocytes. La morphologie est, d après certains auteurs, un critère de choix pour discriminer une lymphocytose tumorale ou réactionnelle. Ainsi, selon Van den Neste, Scheiff & Michaux (2002) :

43 L utilisation du modèle morphologique est vraisemblablement l attitude la plus utile en face d une hyperlymphocytose. Grâce au frottis sanguin, la gravité du problème est immédiatement définie. Ce n est que plus rarement qu il faut recourir à des techniques sophistiquées (immunomarquage, analyse génétique). Ces techniques sont néanmoins indispensables dans les maladies malignes du sang car elles confortent et précisent le diagnostic, orientent le type de thérapeutique, et fournissent des renseignements pronostiques. (p.71) De même, selon Zenhäusern, Lovey & Stalder (2006), «la laborantine ou l hématologue expérimenté reconnaissent les caractéristiques morphologiques suggestives d un état réactionnel (lymphocytes stimulés), de lymphoblastes ou d un syndrome lymphoprolifératif, et peuvent préciser les examens complémentaires à réaliser en cas de suspicion d hémopathie maligne.». Les auteurs cités placent donc la morphologie au premier plan. Puisque c est l un des critères dont dispose le laboratoire, il devient envisageable de l utiliser pour éliminer directement une suspicion de LNH

44 Discussion La statistique apporte des éléments dignes d attention, notamment : Le laboratoire ICHV de Martigny a traité, entre début septembre 2007 et fin janvier 2008, un total de 7081 cas d hématologie. Les FSC représentaient 4306 cas ; il est possible de découvrir une lymphocytose absolue uniquement dans une FSC. En tenant compte du fait que de nombreux patients reviennent à plusieurs reprises (patients hospitalisés notamment), il faut être conscient que le chiffre proposé n est pas absolument exact, mais il permet de se faire une idée de la situation : on peut estimer que les lymphocytoses découvertes au laboratoire représentaient, grossièrement, une proportion de 1.7%, et les LNH 0.16% des 4306 FSC demandées durant la période précitée. On constate, comme indiqué au tableau VI (p.43), que les comptes leucocytaires des deux groupes de patients se chevauchent sur une partie allant de 11.7 à 23.5 G/L. En dessous de la limite inférieure, on ne trouve que des étiologies non-lnh, alors que les patients atteints de LNH dépassent tous le seuil supérieur, jusqu à une limite de 49.1 G/L. Les pourcentages lymphocytaires manuels des patients non-lnh ne dépassent pas 75%, alors que les LNH montent jusqu à 94%. Dans la zone inférieure, les LNH présentent un minimum de 45% de lymphocytes, contre 19% pour les non-lnh. La répartition lymphocytaire manuelle présente des différences très importantes entre les deux groupes de patients : lors d une étiologie non-tumorale, on trouve un maximum de 9 G/L de lymphocytes, alors que dans le groupe LNH, le maximum est à 43.1 G/L. Les patients atteints de LNH étaient âgés au minimum de 66 ans, alors que le groupe non-lnh comptait des patients allant de 1 à 84 ans. Ces informations peuvent nous conduire à affiner les critères proposés par l hématologue responsable, et à les rendre éventuellement utilisables au laboratoire

45 Dans la mesure où les différents LNH sont très nombreux, et présentent des morphologies très éparses, nous proposons de procéder par exclusion au niveau du laboratoire: si la morphologie lymphocytaire et les critères décisionnels ne correspondent ni à une situation normale, ni réactionnelle, les TAB ES doivent contacter l hématologue responsable pour décider d éventuelles investigations complémentaires. Les critères décisionnels disponibles au laboratoire pourraient être appliqués de la manière suivante : Morphologie Normal petite cellule ovoïde, noyau rond entouré d une fine bordure de cytoplasme sans granulations diamètre +/- 7 µm Rapport N/C élevé Chromatine condensée, souvent d aspect motté. Réactionnel Grande cellule activée (ne pas confondre avec LGL!) Noyau rond, parfois incurvé Cytoplasme hyperbasophile avec possibles granulations azurophiles Rapport N/C faible Chromatine dense, présence possible de nucléoles Archoplasme Image lymphocytaire polymorphe. Résultats précédents Ancienne FSC (2 mois maximum, selon Van den Neste, 2002) ne montrant pas de lymphocytose

46 Scattergramme Leucocytes G/L Lymphocytes G/L Adultes : mois : ans : ans : ans : ans : Adultes : mois : ans : ans : ans : ans : Inférieurs à 20 G/L Inférieurs à 10 G/L Tableau VI : Critères décisionnels. Certains critères doivent être considérés comme éliminatoires ; si un seul d entre eux est rempli, le cas doit être transmis à l hématologue : Lymphocytose persistant depuis plus de 2 mois Image lymphocytaire monomorphe au frottis sanguin Présence de cellules lymphoblastiques Présence de cellules éclatées

47 Il faut impérativement tenir compte du fait que la statistique n est que partiellement interprétable : en effet, sur les 34 entités que compte la classification OMS, nous n avons eu que 5 pathologies représentées dans notre étude. Cela laisse à penser que certains critères auraient pu être très différents avec un plus grand nombre de LNH différents. De plus, comme expliqué dans la conclusion, il semble que tous les cas de lymphocytoses n aient pas été rigoureusement récoltés dans les laboratoires ICHV de Monthey et de Martigny ; cela fausse également la statistique

48 Conclusions Le but de ce travail était de tenter de définir, sur une base statistique, des critères morphologiques et cliniques qui permettent au laboratoire ICHV de Martigny de discriminer les causes de lymphocytoses. Ces critères avaient pour objectif d éviter que les TAB ES ne soient obligés de téléphoner à l hématologue pour chaque lymphocytose. Les critères proposés plus haut ne seront sans doute pas applicables ; en effet, il aurait fallu disposer d une statistique plus fiable du point de vue de la récolte, et d un nombre de cas plus élevé pour pouvoir définir des critères plus affinés. Il serait néanmoins possible, sur la base documentaire apportée par ce travail, d imaginer continuer une collecte de cas de lymphocytoses absolues pour un temps plus long, afin d avoir à disposition un plus large échantillon de pathologies de type LNH. J ai consulté une bibliographie abondante pour la rédaction de ce travail de diplôme, et force est de constater que les avis divergent fortement quant à la prise en charge d une lymphocytose découverte au laboratoire. Certains auteurs, cités plus haut dans le texte, soutiennent que la morphologie est un critère suffisant pour éliminer une pathologie lymphocytaire maligne, alors que d autres pensent que chaque lymphocytose absolue doit être investiguée par des examens approfondis (immunophénotypisation notamment). Il serait très utile pour le laboratoire ICHV de Martigny de pouvoir utiliser les critères décisionnels proposés plus haut. Néanmoins, il faut admettre qu il existe toujours un risque de passer à côté d une pathologie maligne : aucun critère morphologique n est absolu, des entités de LNH avec une morphologie proche de la normale peuvent toujours se présenter et ne pas être détectés. Mais cela est valable pour de nombreux types de pathologies. Ma proposition pour évaluer ce risque est d organiser un test microscopique avec tous les TAB ES du laboratoire de Martigny, sur la base de lames de contrôle de qualité externe par exemple. Nous pourrions soumettre une série de lames aux TAB ES, qui contiendrait des LNH, ainsi que des cas normaux ou

49 réactionnels. Il serait ainsi possible de se rendre compte réellement si les critères proposés permettent au personnel du laboratoire de reconnaître une morphologie lymphocytaire tumorale en excluant les étiologies normale et réactionnelle. Si le résultat du test s avère concluant, les critères pourraient être appliqués sans prendre le risque de manquer une pathologie maligne. Il faut également tenir compte du fait que les LNH découverts au laboratoire ne représentaient que 0.16% de toutes les FSC. Une autre proposition serait de développer une manière de travailler plus interdisciplinaire. Les médecins disposent de bien plus d informations sur le patient que le laboratoire ; lors d une forte suspicion de lymphome, ne pourraient-ils pas inscrire sur la feuille de demande un petit mot indiquant aux TAB ES qu il faut rechercher des lymphocytes pathologiques? Cela réduirait également les risques de manquer un LNH. Il faut encore relever un fait qui doit impérativement être pris en compte dans la réflexion. Lorsque l on diagnostique un lymphome indolent à un patient asymptomatique, une stratégie thérapeutique particulière est parfois mise en place : l abstention surveillée. Le patient ne reçoit pas de traitement sous forme de chimiothérapie ou de radiothérapie, mais doit simplement passer une visite de contrôle régulièrement. C est notamment le cas des trois patients présentant une LLC B relevée au cours de l étude statistique. Il faut absolument tenir compte de la dimension psychologique pour le patient : son médecin lui annonce qu il est malade, et il risque fort de ne pas bien saisir pourquoi on le laisse ainsi, sans rien tenter pour le soigner. Malgré toutes les explications données par le corps médical, ce doit être un fait plutôt difficile à accepter. Dès lors, une question surgit : si le laboratoire passe à côté d un lymphome indolent qui n aurait pas été traité, est-ce vraiment si grave? Quels seraient les dommages pour le patient? Sa qualité de vie ne serait-elle pas meilleure s il ignore qu il souffre d une maladie que le médecin ne traite pas? Quel est le risque réel de passer à côté d un lymphome agressif? Il faut également tenir compte d un aspect important : quel est l intérêt d entreprendre des tests extrêmement coûteux, tels que l immunophénotypisation, si ceux-ci débouchent sur une abstention thérapeutique pour le patient? N est-il pas plus intéressant de demander un contrôle de la formule sanguine à 2 ou 3 mois? (

50 L objectif de ce travail n est pas de se placer dans un axe éthique face aux traitements des lymphomes, mais ces questions doivent néanmoins être prises en considération afin d avoir un aperçu complet de la situation. La réalisation de ce travail de diplôme m a permis d approfondir mes connaissances hématologiques, et particulièrement les lymphocytes et leur pathologie. C est un domaine très vaste, pour lequel il existe une littérature très abondante. Il était compliqué de parvenir à synthétiser une telle masse d informations, d autant que tous les auteurs ne sont pas d accord sur certains détails. Néanmoins, cela m a permis de progresser en matière de recherche d informations et de sources fiables. J ai également pu me perfectionner dans la réalisation autonome d un projet conséquent, et notamment dans la gestion du temps imparti. La rédaction m a apporté de nouvelles connaissances dans le domaine informatique, notamment au niveau du traitement de texte. Une autre difficulté rencontrée était la récolte de cas. En effet, je doute fortement que toutes les lymphocytoses absolues découvertes aux laboratoires ICHV de Monthey et Martigny aient été mises de côté pour mon étude. Les laboratoires de ces deux hôpitaux traitent un volume plus ou moins semblable d analyses, et seulement 21 cas sur 74 nous sont parvenus de Monthey ; cela laisse à penser que des cas sont passés entre les mailles du filet, et que la statistique réalisée n est pas l exact reflet de la réalité. Lors de la rédaction, j ai été confrontée à la nécessité de structurer mon travail ; cela n a pas été évident, d autant plus que la partie théorique est très importante. J ai fourni un effort particulier afin d éviter que toutes les notions ne soient mélangées, et ai décidé de séparer très nettement la partie théorie de la partie analytique. Remerciements Je tiens à remercier tout particulièrement Emma Giroud, ainsi que Philippe Godon, le Docteur Pierre-Yves Lovey et toute l équipe du laboratoire ICHV de Martigny, qui m ont aidée et soutenue pour ce travail de diplôme

51 Bibliographie 1. Références bibliographiques Bain, B.J. (2006). Blood cells, A Practical Guide (4 ème édition). Oxford : Blackwell Publishing. Beckman Coulter. (20 novembre 2007). Beckman Coulter [Page Web]. Accès : mx_analyzer.asp (page consultée le 4 février 2008) Beckman Coulter. (11 septembre 2000). Coulter VCS Technology : Clinical Cass Studies [Page Web]. Accès : s.pdf (page consultée le 8 février 2008) Beckman Coulter. (s.d.). Instructions d utilisation : Coulter 5C Cell Control. [Page Web]. Accès : _FR.pdf (page consultée le 23 janvier 2008) Beckman Coulter. (s.d.). Instructions d utilisation : Coulter Latron Control and Latron Primer. [Page Web]. Accès : _FR.pdf (page consultée le 23 janvier 2008) Beckman Coulter. (s.d.). Instructions d utilisation : Coulter S-Cal calibrator kit. [Page Web]. Accès : FR.pdf(page consultée le 23 janvier 2008) Beckman Coulter. (24 avril 2003). Beckman Coulter [Page Web]. Accès : CS_Technology.pdf (page consultée le 13 novembre 2007) Beckman Coulter. (s.d.). Messages et alarmes HmX. Beckman Coulter. (2006). VCS-Workshop 21. Juni 2006 in Luzern. [CD- ROM]. Berard, R. (2004). Programmer un automate d hématologie. [Page Web]. Dijon : Institut Universitaire de Technologie. (page consultée le 20 février 2008)

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55 Lexique CD : Cluster of differenciation CMH-I : Complexe majeur d histocompatibilité de classe 1 CMH-II : Complexe majeur d histocompatibilité de classe 2 CMV : Cytomégalovirus CPA : Cellule présentatrice d antigène CSCQ : Centre Suisse de Contrôle de Qualité EBV : Virus Epstein-Barr FSC : Formule sanguine comlète FSS : Formule sanguine simple δ-if : Gamma-Interféron HCT : Hématocrite HGB : Hémoglobine HIV : Virus d immunodéficience humain ICHV : Institut Central des Hôpitaux Valaisans IL-n : Interleukine n (p.ex : IL-1 : Interleukine 1) Ig : Immunoglobuline IgD : Immunoglobuline D IgG : Immunoglobuline G IgM : Immunoglobuline M LGL : Large Granular Lymphocyte LLC B : Leucémie Lymphoïde Chronique B LNH : Lymphome non-hodgkinien Ly : Lymphocyte Ly % : Nombre relatif de lymphocytes Ly # : Nombre absolu de lymphocytes Ly-T : Lymphocyte T Ly-B : Lymphocyte B MCH : Hémoglobine corpusculaire moyenne MCHC : Concentration globulaire moyenne d hémoglobine MCV : Volume corpusculaire moyen MGG : Coloration May-Grümwald-Giemsa MPV : Volume plaquettaire moyen Nlab : Numéro de laboratoire

56 PLT RBC RDW TAB ES WBC : Thrombocytes : Red blood cells, érythrocytes : Indice de distribution des érythrocytes : Technicien(ne) en analyse biomédicales ES : White blood cells, leucocytes

57 Annexes 1. Tableau Récolte de cas de lymphocytoses absolues Nr. NLAB WBC en G/L G/L de Lymphos automate type d'automate rép. manuelle, % des lymphocytes age morphologie des lymphocytes résultats en % de Sion résultat antécédant ou suivant (lymphos) renseignements réponse téléphone du examen supplémentaire, diagnostic finale N.B. : les cas colorés en vert sont les cas qui nous sont parvenus du laboratoire ICHV de Monthey. syndrome lymphoprolifératif exclu; état réactionnel à un processus infectieux, HmX écrasées + 38% : Lc : 8.5 Ly 55% 4.7 début démence envoyé Sion une néoplasie ou une maladie inflammatoire G/L ou auto-immune. Flutter auriculaire avec décompensation cardiaque gauche HmX sp : Lc : 5.6 (FSS) problème cardiaque rythme à surveiller ; : Lc : 5.5 G/L Malaises avec vertiges sur fibrillation auriculaire et stéatose hépatique HmX écrasées +, stimulés +/ : Lc : 10.2 (FSS) douleurs au genou on ne fait rien ; aucune FS ensuite

58 HmX sp recherche Malaria; recherche positive le à contrôler ; : Lc : 7.2, Ly 32% 2.3G/L Malaria, éthylisme, insuffisance rénale HmX stimulés + ivre aux urg on ne fait rien ; aucune FS ensuite réactionnelle à OH, polymorphe HmX sp Lc : 15.8, Ly 16% 2.56 G/L malaise vertige si lympho polymorphes, réactionnel Affection démyélinisante débutante? HmX stimulés +/ : Lc : 11.5, ly 32% 3.7 G/L : Lc 9.2 Ly 58 % 5.4 G/L problème respiratoire, décomposation hyperventilation, pneumonie Klebsiella et à lymphocytose avec majorité de LGL,qqs. Éléments stimulés = réactionelle Bronchectasies du lobe moyen, prolapsus utérin Persiste HmX stimulés + depuis (1er ulcère scrotal, antipsoriasis on ne fait rien ; aucune FS ensuite Herpès psoriasis lombarthrose génital, sévère, résultat)

59 vomissement, HmX sp diarrhées, allergie céréales et poire, vient de manger un réactionelle,qqs LGL pain aux céréales HmX écrasées Lc 6.5 Ly 42.4% 2.8 G/L cholique néphrétique,douleur irradiante envoyé Sion lymphocytose réactionnelle au stress, corrigée dans la formule du HmX sp 50.5%, 5.9 G/L, qq LGL Lc 8.6 Ly 34.8% 3.0 G/L OH ++, hyperventilation Stalder : probablement réactionnel, envoyé Sion lymphocytose réactionnelle au stress Dr. Lovey: plusieurs Lymphocytose HmX sp 57.50% résultats tous aux environs de état fébrile à répition normale chez un énfant, envoyé à Sion, thrombocytose sur carence en fer. 50% car demande de Riand HmX sp 53% éthylisation aigue lymphocytose réactionnelle lymphocytose réactionnelle au stress de l'éthylisation HmX stimulés + chute suite à l'alcoolémie Dr. Lovey : on ne fait rien éthylisme chronique

60 Dr. Lovey: on HmX stimulés +/- Lc 5.4 Ly 34% 1.8 céphalées ne fait rien; Résolue le G/L HmX sp gène respiratoire douleur thoracique, 8 jours Dr. Robert, on ne fait rien; Résolue le Dr. Lovey : on HmX stimulés +/- Lc 8.9 Lc 7.2, Ly 35.9% alocoolémie chronique ne fait rien ; aucune FS Alcoolémie et tabagisme chroniques 2.6G/L ensuite Dr. Lovey : on HmX stimulés + règles douleureuses ne fait rien ; aucune FS ensuite Lymphocytose peu HmX % LGL Ly 42%,LGL : Lc 10.3, Ly 35% 3.6 G/L douleur bas cou, Hypothyroidie,pas signes infectieux Dr. Lovey : envoyé à Sion importante et polymorphe => origine réacionnelle (virus, stress); syndrome coronarien aigü

61 lymphocytose chez sujet agé + morph des lymphos + adénopathies cervicales => HmX stimulés +, cellules écrasées +/- 37%, cellules ecrasées +, stim : Lc 17.4, Ly 76.5% 13.3 G/L ganglions suspects au cou envoyé Sion lymphome malin avec phase leucémique? Métastases ganglionaires cervicales d'un carcinome peu différencié de site primaire inconnu, mais probablement épidermoïde. Dr. Lovey : on HmX stimulés + suspicion lithiase rénale de ne fait rien ; aucune FS ensuite HmX sp : Lc 6.6, Ly 30.9% 2G/L douleur rénales Dr. Lovey: on ne fait rien. IVG médicamenteuse

62 3.4.07: Lc 11.4, Ly HmX sp 33% 3.7 G/L Lc 10.3, Ly réglé antalgie chute à domicile pour éthylisme LLC B connue depuis 1985, suivie par Dr. Lovey 48 % 4.9 G/L HmX sp : Lc 3.8, Ly 65% 2.5 allergie pomme Dr. Lovey: on ne fait rien. réactionelle G/L HmX sp : Lc 9.7, Ly 39% 3.8 Ethylisme Dr. Lovey: on ne fait rien. réactionelle G/L HmX stimulés ++ : Lc 9.1 Ly 38% 3.5 Angine EBV IgM positif, infection récente G/L HmX sp : Lc 15.5 (FSS) by-pass, diabète type 2, hypertension artérielle, lombalgie

63 : HmX stimulés ++ Lc 5.9, Ly 54% 3.2G/L sucpicion d'une mononucléose EBV IgM positif, infection récente stimulés + douleurs abdominales hautes, pas HmX sp : Lc 8.8 Ly 47% 4.1 G/L d'antécédants connus, pas d'oh, éventuellement stimulés +/- litiase, US abdominale normale HmX???? 1977 pas effectuée Lc : 9.1 Ly 4% 0.3 G/L douleurs flanc gauche, éventuellement calcul rénal. douleurs HmX sp : Lc 14.9 abdominales d'origine inconnue, allergie aux plumes, diabète douleurs HmX sp : Lc 11.5 abdominales, hématochésies, Dr. Lovey: on ne fait rien. rectorrhagies

64 HmX stimulés +/ Lc 8.5, Ly 35.4% 3G/L EBV IgM positif, infection récente HmX LGL +/ : Lc 11.4 (FSS) mal de dos, alcoolémie à 2.58 g/kg Dr. Lovey: on ne fait rien. Ethylisation aigue + hernie HmX stimulés +/ : Lc 12.3, Ly 24.4 % 3G/L céphalées + vomissements, afébrile , résolu HmX stimulés : Lc 6.6 (FSS) maux d'estomac HmX sp : Lc 8.2 (FSS) patient en hôpital psychiatrique HmX lymphocytes stimulés +/ : Lc 7.8, Ly 64% 5G/l vient pour saignée, hémochromatose hétérozygote vient en pré-op (32%) HmX lymphocytes stimulés : Lc 16, Ly 54% 8.6G/L pour by-pass. Déjà vue pas Dr. Lovey, qui avait suggéré un contrôle Obésité, hypothyroïdie prochainement

65 HmX stimulés : Lc 7.7, Ly 66% 5.1 G/L : Lc 6.7 G/L, Ly 39.4% 2.6 G/L tentamen Dr. Lovey: on ne fait rien. Abus médicamenteux HmX : Lc 11.9 Ly 23% 2.7 alcoolémie 3,70 g/kg, chute Dr. Lovey: on ne fait rien. G/L patiente du Dr HmX : Lc 14.2, Ly 8% 1.1 G/L Lovey en 2006 : trombocytopénie connue, spénectomie, opérée le Résolue Purpura thrombocytopénique idiopathique; résultat post-splénectomie HmX douleur fosse illiaque droite -> gastro? Dr. Lovey: on ne fait rien Act Diff suspicion allergie Dr Gehrke : on ne fait rien sera recontrôlée dans quelques temps

66 HmX stimulés +, cellules écrasées +/- : Lc 11.9, Ly 24% 2.9 G/L ; : Lc 16.3, Ly 49% 8 accident sur la voie publique => chir2, puis transféré aux soins continus pour crise d'épilepsie Dr. Lovey: on ne fait rien. Réactionnel G/L HmX stimulés : Ly 56.5 % : Lc 8.7 Ly 53% 4.6G/L syndrome mononucléosique HmX stimulés +/- : Lc 13.3, Ly 33.5% maladie de Horton 4.5 G/L HmX stimulés Lc : 11.5 (FSS) psychose, cannabis ++ lymphocytose d'aspect monomorphe, qui HmX stimulés : 73%, stimulés + le : Lc 8.8, Ly 29.6% 2.6 G/L impatience aux jambes, n'arrive pas à dormir envoyé Sion n'était pas présente à la prise de sang du mois de juillet; possibilité d'un sydrome lymphoprolifératif de

67 bas degré de malignité. A recontroler dans 4 semaines : Lc 7.9, Ly 66% 5.2 G/L. IPT le : lymphome lymphoplasmocytaire. Dr Lovey, ne HmX OH ++, état d'ébriété rien faire, probblement réactionnel à l'alcool. choc HmX anaphylactique, réaction allergique réactionnel importante lupus érythémateux HmX : Lc 10.8, Ly 26% 2.8 et polyarthrite connus, vient pour G/L pneumonie HmX sp : Lc 11.9 Ly dysphagie Résolue le G/L HmX : Lc 12.6, bronchopneumonie

68 Ly G/L patiente connue HmX Masses de Gumprecht +++ premier résultat le : Lc 32.3 Ly 69% 22.3 G/L le : Lc 27.7, Ly 95% 26.3 G/L pour leucémie à prolymphocytes T, non traitée Adénocarcinome pulmonaire diagnostiqué en suivie par le Dr. Stalder Leucémie prolymphocytes connue à T mars HmX douleurs rétrosternales Dr Robert : on ne fait rien lymphocytes d'aspect réactif, accompagné d'anisopoïkilocytose => souffrance hépatique, HmX sp alcoolémie 5.0 g/kg, éthylisme chronique, chute Dr. Robert : envoyé à Sion consommation d'alcool, déficit en vitamines ou myélodysplasie. Examens suggérés : B12/folates et substituer au besoin, recontrôler la formule d'ici 1 mois

69 HmX lymphos atypiques +, cellules écrasées : 81% le : Lc : 11.5 G/L, Ly 49% 5.6 G/L carcinome canalaire invasif du sein, ttt arimidex pour le carcinome, prothèse du genou envoyé Sion SLP versus réactionnel? IPT : LLC - B agressive sucpicion de sydrome lymphoprolifératif de bas grade, origine réactionnelle non exclue. Examens HmX Masses de Gumprecht : 79%, cellules écrasées ++ le : Lc : 13 G/L, Ly 23% 3G/L Démence, décharge familiale envoyé Sion suggérés : status lymphatique et recherche d'une splénomégalie, bilan hépatique (dont LDH et CRP), ifix plasmatique, séro (EBV, CMV, Toxo, HIV, HCV) et immunophénotypisation sur sang périphérique. IPT : LLC B kappa HmX : Lc 8.5, Ly 59% 5.0 G/L décompensation respiratoire Dr. Lovey : réactionnelle, ne rien faire Œdème aigü des poumous sur tachyarythmie, stase hépatique

70 HmX lymphocytes stimulés +/- : Lc 13.2, Ly 33% 4.3 rectorragie Dr. Lovey : on ne fait rien G/L HmX lymphocytes stimulés +/- : Lc 11.9, Ly 18.2% abus médicamenteux Dr. Lovey : on ne fait rien 2.1 G/L Mononucléose : cellules de taille moyenne à grande, HmX polymporphes, N/C 0.6, cytoplasme basophile, pas : Lc : 10.9 (FSS) Dr. Lovey : ne pas envoyer, décrire les lymphos Mononucléose infectieuse de nucléoles, présence de cellules de Pfeiffer HmX stimulés + Autres examens : recherche de facteurs allergiques HmX sp : Lc 6.1, Ly 14% 0.85 Douleurs abdominales, diarrhées Dr. Lovey : réactionnelle, ne rien faire

71 G/L HmX Cellules écrasées : Lc : 8.8 (FSS) Douleurs épigastriques, toux Dr. Lovey : réactionnelle, ne rien faire Pancréatite biologique HmX sp : Lc 15.4, Ly 15% 2.3 bronchopneumonie G/L HmX sp : Lc 10.3, Ly 36.5% Infection urinaire + flutter auriculaire 3.8 G/L HmX sp : Lc 8.5, Ly 45.5% 3.8 G/L Patient de Malévoz Crise épilepsie, dépendance OH et benzo HmX lymphocytes stimulés +/ : Lc 14.6 (FSS) Douleurs abdominales, pyélonéphrite

72 LMNH zone marginale diagnostiqué en TTT leukeran en 1995, 5jours/mois pdt HmX prolymphocytes +/-, cellules écrasées : Ly 41.5%, LGL++, stimulés +/ : Lc 10.9, Ly 55% 6 G/L mois.splénectomie le adénopathie axillaire D et sousclavière D, avec cas connu du docteur Lovey Hodgkin classique biopsie axillaire D du Diagnostic d'un lymphome de Hodgkin de type classique HmX lymphocytes stimulés +/ HmX lymphocytes stimulés +/- rétro- Douleurs sternales, alcoolémie Dr. Lovey : ne rien faire : HmX lymphocytes stimulés +/- Lc 11.6, Ly 55.5% 6.4 G/L

73 2. H. Diem Am um 15:16 schrieb Guten Tag Herr Diem, Ich melde mich wieder einmal bei Ihnen. Ich bekomme immer kompetente Antworten, die mir bisanhin immer behilflich waren. Vielen Dank. Es geht um folgendes: In unseren Labors müssen wir (Forderung eines unserer Hämatologen) alle über 4.0 G/L absoluten Lymphozytose (altersunabhängig) dem Hämatologen melden (das kann auch ein Wert von 4.1 G/L sein) und sie werden von ihm evtl. mikroskopiert oder nicht. In 1. Linie geht es um den Wert der absoluten Lymphozytose und in 2.Linie um die Morphologie, etc. Der Grund, warum wir das machen müssen, ist auf der einen Seite, dass man evtl. ein NHL im Anfangstadium bereits erkennen kann und deshalb nicht verpasst, auf der anderen Seite, Blasten nicht zu verpassen. Da ich sehr viel Mühe mit diesen Argumenten habe, müssen wir eine Arbeit schreiben, die natürlich von unserem Schüler als Diplomarbeit geschrieben wird, mit meiner Hilfe. Ich suche nun Literatur über dieses Thema. Kennen Sie evt. solche? Was mich auch am Meisten interessiert, ist Ihre Meinung zu diesem für mich heiklen Thema. Ich denke, dass Sie in Ihrem Labor sehr viele Proben analysieren. Wie gehen Sie vor? Ist es für Sie ein Thema?

74 Ich habe keine Mühe damit, wenn das Alter, die Resultate des Automaten, die mikroskopische Differenzierung mit Morphologie, ein Hinweis für ein mögliches NHL geben. Vielen herzlichen Dank und freundliche Grüsse aus der Schweiz Emma Giroud ----Message d'origine---- De: Date: :08 À: Objet: Re: absolute Lymphozytenzahlen Ich sehe es ähnlich wie ihr Hämatologe. Alle Lymphozyten (aber die obere Grenze sollte altersabhängig betrachtet werden!) sollten mikroskopiert werden. Lymphom versus reaktiv. Das Argument mit den Blasten zählt für mich nicht. Es gibt zwar ALL mit so kleinen Blasten, dass diese von den Automaten bei den Lymph mit differenziert werden, die haben aber meist keine Lymphozytose oder aber fallen über die restlichen Werte auf, wo auch differenziert werden sollte: unklare Anämie, unklare Granulopenie, unklare Thrombopenie um nur einige der Fälle zu nennen. Und... Literatur gibt es hierüber sehr wenig. ausreichend? mit vielen Grüßen aus Gauting Heinz Diem

75 3. T. Nebe -----Ursprüngliche Nachricht----- Gesendet: Samstag, 29. September :08 An: Betreff: Medizinische Publikationen über absolute Lymphozytosen Guten Tag Herr Gutensohn, zuerst, wie geht es Ihnen? Ich möchte gerne eine kompetente Auskunft. Es geht um folgendes: In unserem Labor müssen wir alle absoluten Lymphozytosen über >4.0 G/L, altersunabhängig, dem Hämatologen zuweisen. Wir müssen die Anamnese einholen, ihm telefonieren, er fragt uns nach der Morpholgie, sind evtl,kernschatten vorhanden, etc und dann entscheidet er, ob er das Blutbild selber beurteilen möchte oder ob man das ganze im Auge behalten soll undevtl., falls der Patient längere Zeit hospitalisiert sein wird, kann man den Verlauf der Lymphozytenzahl beobachten. Ich habe Mühe mit diesem Vorgehen. Vorallem habe ich Mühe, wenn wir dann als Antwort, eine Stresslymphozytose (Patient hatte Kniebeschwerden, vielleicht aber auch ein Autounfall, etc) liege vor, bekommen. Ich habe durchaus keine Mühe, wenn es sich um ältere Patienten handelt, man sagt ja, dass ab 50 Jahren jede Lymphozytose pathologisch sei. Aus diesem Grund haben wir den Auftrag (meine Schülerin und ich) nun eine Arbeit vorzulegen, die als Form einer Diplomarbeit zu schreiben ist (gilt für meine Schülerin). Da ich ziemlich stark involviert bin, suche ich medizinische Publikationen, die vielleicht bereits einmal dieses Themabehandelt haben. Kennen Sie solche? Was sind Ihre Gedanken zu diesem Thema? Ich habe bereits im Internet nach Publikationen gesucht, ich

76 finde nichtunbedingt das, was wir gebrauchen. Die meisten handeln ja das Thema NHL ab. Bei unserem Thema kann es durchaus diese Publikationen touchieren. Und die Stresslymphozytose, gibt es die wirklich? Können die Lymphozyten genau so schnell mobilisert werden wie die Neutrophilen Granulozyten? Vielen Dank für das Lesen und vielleicht können Sie mir behilflich sein. Grüsse aus dem Wallis, es ist ziemlich kalt, die Sonne scheint etwas und der Schnee fiel auch bereits in dieser Woche. Emma Giroud Bremgartner -----Ursprüngliche Nachricht----- Von: Kai Gutensohn Gesendet: Sonntag, 30. September :06 An: 'Nebe, Thomas C.' Betreff: WG: Medizinische Publikationen über absolute Lymphozytosen Hallo Thomas, Du hast doch ein Riesen-Literaturnetz. Fällt Dir etwas außerhalb der NHL ein. Die Dame kommt ab und zu zur IGLD. Ist sehr nett und kümmert sich als Lehr-MTA um die Ausbildung. Liebe Grüße Kai

77 -----Ursprüngliche Nachricht----- Von: Gesendet: Freitag, 5. Oktober :46 An: Betreff: RE: WG: Medizinische Publikationen über absolute Lymphozytosen Sehr geehrter Herr Nebe, vielen Dank für die Hilfe. Ich habe bereits Herr Diem ein Mail zukommen lassen. Wir kennen uns von den "Schau mer Mal " - Weiterbildungen, die von Prof. Löffler, Diem und Prof Haferlach mit Hilfe von Beckman/Coulter organisiert werden. Er kennt keine Publikation, ist aber auch deren Ansicht, dass man das weiterverfolgen muss. Ich bin BMA mit der Spezialität Hämatologie. Ich unterstütze den weiteren Untersuch bei absoluten Lymphozytosen ab einem bestimmten Alter. Ich meinte immer, ungefähr ab 50 sei mehr oder weniger kritisch. Ich habe einfach Mühe, wenn ich bei einem jüngeren Patienten als Antwort Stresslymphozyose erhalte, und der Patient liegt auf der Notfallstation, weil er Knieschmerzen oder vielleicht zuviel Alkohol, etc hat. Ich kenne das nicht und ich denke, dass der Mechanismus für die sofortige Freisetzung anders verläuft als bei den Neutrophilen, die ja randständig in Warteposition im Reservepool sind, und somit sofort freigesetzt werden können. Für die medizinische Publikation habe ich selber gesucht und nichts gefunden, deshalb habe ich Kay Gutensohn (per Zufall kenne ich Ihn) angeschrieben. Wir werden versuchen, diese Arbeit zu schreiben. Ich bin gespannt, was wir für Schlussfolgerungen ziehen können. Vielleicht darf ich meine Meinung ändern und ich habe wiederum etwas dazu gelernt

78 Was mich aber trotzdem interessiert, wie sieht die statistische Auswertung, etc von diesen absoluten Lymphozytosen aus? Man sagt ja, dass wir seit den 80- Jahren ungefähr 80 % mehr NHL diagnostizieren. Haben Sie Literatur über MLUS? Mit besten Grüssen Emma Giroud Bremgartner ----Message d'origine---- De: [email protected] Date: :07 À: "'[email protected]'"[email protected] Copie: "Heinz Diem ( 2)"[email protected] Objet: AW: WG: Medizinische Publikationen über absolute Lymphozytosen Hallo Frau Giroud Wenn Sie pubmed aufrufen mit dem Begriff bekommen Sie einiges. Das mit den 80er Jahren fällt mit der EInführung der Hämaautomaten zusammen, die ein 5-teiliges Diff liefern und die asymptomatischen Patienten nach oben geschwemmt haben. Das Immunsystem hat mit 30 das meiste gesehen und reagiert nicht mehr über mit Lymphozytose. Die Zeitbeobachtung ist das beste Kriterium, weil die reaktiven Lymphozytosen nicht konstant sind. Es gibt Publikationen zu Fallsschirmspringern aus den 80ern, die Stressuntersuchungen gemacht haben (R.E: Schmidt et al). Die zirkulierende Lymphos sind quasi alle T, die zirkulieren von Blut über Lymphe über Blut über Lymphe über Blut wieder über Lymphe und in den postkapillären Venolen müssen sie raus aus dem Blut. Da ist ein Stellglied (CD44...). Da spielt sich aber alles im Normbereich ab. Den Speicher-Pool Thymus können SIe nur einmal mit Stress leeren (Lebensangst,

79 max. Stress, ungewohnte Belastungen). Literatur auch bei Sportmedizinern (Gabriel et al. und Psychosomatikern, meist aber mies. Westermann und Pabst in Hannover haben mal Literatur gesammelt (Review in Immunology TOday in den 90ern). ALles Theoretiker... Ich habe in der EDV seit Jahren einen Filter gesetzt und es sind wirklich nur wenige Erwachsene (1500 Betten + Ambulanzen). Der Delta-Check des Automaten-DiffBB in der EDV/im Kopf ist das einfachste und billigste Mittel. In den zwei Wochen stirbt keiner. Aber in 3 Monaten ist mir einer am T-NHL gestorben (Haut anschauen). Weil er von Arzt zu Arzt gewandert ist, türkischer Mauerer, kein Deutsch verstanden oder gesprochen. Alles in Stichworten, weil viel zu tun. Geschickte EDV-Abfrage in einem großen Labor(verbund) und publizieren. Gruß T. Nebe ----Message d'origine---- De: [email protected] Date: :25 À: "'[email protected]'"[email protected] Copie: "Heinz Diem ( 2)"[email protected] Objet: WG: Medizinische Publikationen über absolute Lymphozytosen Sehr geehrte Frau Giroud, Herr Gutensohn hat mir Ihre Frage weitergeleitet und in der Tat verwenden wir in der Klinik die gleiche Vorgehensweise. Die Altergrenze würde ich herabsetzen, obwohl natürlich mit höherem Alter die Wahrscheinlichkeit immer besser wird zugunsten der NHL. Über 3500/µl

80 Lymphozyten lohnt es sich auch schon (unsere Grenze). Eine gute Publikation dazu kenne ich auch nicht, aber deswegen hat Sie sicher ihr Hämatologe darauf angesetzt, weil er auch keine gefunden hat. Der durchflußzytometrische Ansatz für CD3/CD4/CD8 und CD19/kappa/lambda ist billiger als die Telefoniererei und Mutmaßungen nach morphologischem Ausschluß von Pfeiffer-Zellen (virale Reizformen der Lymphzyten, antivirale Immunantwort). Stesslymphozytosen kenne ich praktisch nicht (Steressleukozytose durch Neutrophile ja). Man wird auch einige monoklonale Lymphozytosen unklarer Signifikanz (MLUS) finden, die wir hier auch verfolgen und CLL-ähnliche Morphologie und Immunphänotyp haben oder polyklonale B-Lymphozytosen (V.a. Frauen, Raucher). Soweit meine über 15-jährige Erfahrung auf dem Gebiet, vielleicht hat Herr Diem noch einen besseren VOrschlag. Mit besten Grüßen Thomas Nebe

81 4. B.Bain -----Original Message----- From: Sent: 03 December :39 To: Bain, Barbara J Subject: Mechanism of absolutely lymphocytosis by stress Importance: High Hi, Let me give you an sent. I'm swiss laboratory technologist with expirience in haematology. Excuse me for my english. I read many, but writing... In one of your books, I have read to lymphocytosis by stress. To date, I knew this phenomenon and I do not know of other professional colleagues who also is not known. I am interested in the mechanism. I have read several books of haematology, had asked haematologist, search on the Intenet, in nobody can think of a plausible explanation. Therefore, in this issue. We need to write a thesis, on absolutely lymphocytosis > 4 G / L. In our laboratory, we all >4 G/L lymphocytosis under the microscope and we go to ask the internist for the reason for the hospitalization. After we go to phone at the hematologist and he will decide whether he wants to see blood smears or not. The goal is that we no NHL in the early stages miss. To them I would be very grateful if you could send me the statement for this mechanism by mail. Thank you very much and best wishes from Switzerland Emma Giroud Bremgartner

82 ----Message d'origine---- De: Date: :50 À: Objet: RE: Mechanism of absolutely lymphocytosis by stress Dear Emma, I am afraid that I do not know the mechanism. Maybe it is due to muscular contraction and greater return of lymph to the circulation or maybe they come from the spleen but I have never seen anything written about the mechanism. I would examine all high lympocyte counrs under the microscope but repeat the next day to see if lymphocytosis had disappeared if the blood sample was from someone suffering a severe acute illness. This saves doing unnecessary tests. Barbara Bain