La microscopie multi-photons Ou microscopie non linéaire Théorie & applications F. Brau FP CNRS Avril 2009
Absorption multi-photonique Maria Göppert-Mayer Principe E hc 1931 Prédiction théorique Un atome peut être excité par l interaction de deux quanta de lumière abs E abs nphotons nphotons E n x abs abs monophoton monophoton
Principe Probabilité d absorption simultanée de 2 photons Au soleil, une molécule de Rhodamine B absorbe 1 photon/sec contre une paire de photons simultanément/10 millions d années. L absorption simultanée de trois photons n est pas statistiquement envisageable durant l âge total de l univers!!!! = extrêmement faible Probabilité d absorptionξ section efficace 1p-abs 2303 16 2 10 cm 2p abs abs abs t N a 1 GM = 10-50 cm 4 s Comment augmenter cette probabilité?
Les conditions de la réussite Absorption 10-15 s e Principe 10-10 s à 10-7 s Relaxation Vibrationnelle Temps de vie de l état excité S 1 Conversion interne 10-12 s à 10-10 s 10-10 s à 10-7 s 10-11 à s 10-9 s g t 10-15 s Concentrer la lumière d excitation 1) Temporellement Pour provoquer l absorption Pour entretenir le phénomène
Principe Obtenir une densité temporelle de photons élevée : Les lasers pulsés continu pulsé Pour une Pmoyenne identique Pcrête>> en pulsé T t 1961 Kaiser&Garett : Mise en évidence du phénomène sur un cristal de CaF2
Power (W) Principe Gain avec un laser pulsé 3.0 Titan-Sapphire spectra 2.5 2.0 Excitation Emission 1.5 1.0 0.5 0.0 700 750 800 850 900 950 1000 Wavelength (nm)
Spectres d absorption des molécules Principe D après Zipfel et al. Nat. Biotech, 2003 Multimarquages
Structure d un laser pulsé Principe
Lasers pulsés commerciaux Principe
Principe Probabilité d absorption et caractéristiques de l excitation Probabilité d absorption Ex: Laser Ti:Saphir Facteur d augmentation par rapport à un laser continu T 10 ns t 100 fs Femtoseconde g 10 5 1 tf R n 1 T 10 ns t 10 ps Picoseconde g 10 3 La probabilité =f(puissance 2 ) : processus non-linéaire
Principe Les conditions de la réussite Concentrer la lumière d excitation 2) Spatialement Objectifs à forte ouverture numérique Focalisation Cette double excitation procure une résolution tri-dimensionnelle intrinsèque en microscopie de fluorescence à balayage laser. Watt W. Webb Denk W, Strickler JH, Webb WW (1990). Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science 248, 73-76
Microscopie et confinement de l excitation Conséquences : 1) sur la résolution Principe Création de la lumière uniquement dans le plan focal D après Dufour P et al. Med. Sciences, 2006 D après Zipfel et al. Nat. Biotech, 2003
La microscopie multi-photonique Application à la biologie Détection «Non Descannée» D après Zipfel et al. Nat. Biotech, 2003 D après Dufour P et al. Med. Sciences, 2006
La microscopie multi-photonique excitation beam Application à la biologie x/y-scanning device & dichroic mirror (DM) prisma for spectral analyse DM DM descanned PMT 1 & 2 non-descanned (NDD) PMT 3 & 4 objective specimen condensor DM trans-non-descanned (NDD) PMT 5 (with modification Oertner, 2002)
Application à la biologie Conséquences : 2) Restriction de la photo-toxicité (3D-FITC-dextran gel; irradiated area ~ 10 x 20 µm) single-photon absorbtion (488 nm; Ar) focal plane y x x z two-photon absorbtion (760 nm; Ti:Sa) focal plane 20 µm 10 µm (with modification Kubitscheck et al., 1996)
Application à la biologie La microscopie multi-photonique multi-points Le TrimScope
Profondeur de pénétration Application à la biologie Principalement limitée par la diffusion et l absorption du milieu. photons balistiques : trajectoire rectiligne photons diffusés : le photon dévie de sa trajectoire rectiligne
Biologie et longueurs d ondes utilisées Application à la biologie Ca peut quand même bouillir Absorption proche IR plus faible : Moins de diffusion Moins d auto-fluorescences parasites =Profondeur de pénétration plus grande
depth of ligh penetration (µm) 10 4 10 3 10 2 visible light UV Application à la biologie Profondeur de pénétration plus grande IR 10 1 10 0 wavelength (µm)
Application à la biologie Applications Imagerie de molécules endogènes (NAD(P)H, flavoprotéines) Imagerie en profondeur à haute résolution Imagerie intravitale (viabilté) Suivi de cellules, exploration fonctionnelle, suivi d interactions cellulaires, de signalisation Exemple : circulation de Lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques (M. Bajenoff (U924 Inserm).
Application à la biologie
Autres phénomènes non-linéaires La Génération de Seconde Harmonique Diffusion non-linéaire dans le sens de la source (voire plus ) À /2 Observation de structures ordonnées sans marquage
Conclusion Avantages Pouvoir de pénétration tissulaire Photo-toxicité confinée Accordabilité de la source Photoblanchiment réduit Inconvénients Lourdeur de la mise en œuvre Echauffement à maîtriser Gestion des multi-marquages