Analyse d article Benjamin Richard & Nadine Ajzenberg M1 UE8b 21/3/2013 Pubmed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Structure d un article original Titre Résumé structuré : Contexte scientifique, objectifs, résultats, conclusion Mots clefs Introduction Matériel et méthodes Résultats Discussion Remerciements Références bibliograhiques Tableaux Légendes des figures figures
(fig 1BC)
(fig 2A) (fig 3)
(fig6d) Fig6E
(fig 7) Interprétation des résultats
1 2 Western blot (fig 1BC) - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide Transfert sur membrane + 3 Immunoréaction et révélation substrat Traceur = HRP (Horseradish Peroxidase) signal anticorps secondaire anticorps primaire Film photographique Caractérisation de la PN1 plaquettaire (fig 1BC) 1B: Après activation par la thrombine, PAR-1 collagène ou convulxine: PN-1 détectée uniquement dans la fraction secrétée 1C: Si inhibition de l activation plaquettaire par PGE1 avant stimulation par la thrombine: PN-1 détectée dans les extraits plaquettaires PN-1 plaquettaire secrétée par un mécanisme dépendant de l activation plaquettaire
QuickTime and a Fig 2A La PN-1 est stockée dans les granules α plaquettaires Plaquettes lavées de donneurs sains versus GPS ± activées par PAR1-AP PN-1 non détectée dans les lysats de plaquettes dépourvues de granules-α decompressor are needed to see this picture. Protéine de ménage membranaire Protéine de ménage cytosolique PN-1 non détectée dans les surnageants de plaquettes activées dépourvues de granules-α Activité catalytique de la thrombine (fig 3) Plaquettes (hum/souris activées par PAR1-AP 50 µm ou PAR4-AP 250 µm) Plaquettes PN1-/- ou WT 30 min 37 C Contrôles : plaquettes +tampon centrifugation Surnageant incubé Avec IIa0.25 nm ±anti-pn1 Ou ± anti-pai1 S2238 Activité thrombine résiduelle Mesurée à405nm
(fig 3) Effet de la PN1 secrétée sur l inhibition de l activité catalytique de la thrombine Plaquettes normales hum Sd des plaquettes grises plaquettes souris PN1/-/- et WT Surnageant plaq activées+polybrene en présence de surnageant des plaqau repos pas d inhibition de la IIa En présence de surnageant de plaqactivées inhibition de la IIa: plaqsecrètent un inhibiteur Anti-PN1 bloque cette inhibition. PN-1 principal inhibiteur de la II libérée par les plaqactivées (3B) et liée aux GAG (3D) AGREGATION PLAQUETTAIRE MESUREE PAR TURBIDIMETRIE (fig6d) Principe de mesure : enregistrement graphique de la transmission d un faisceau lumineux àtravers une suspension de plaquettes lavées agitées à37 C. Les plaquettes en suspension empêchent la transmission du signal lumineux. Après ajout d un inducteur, les plaquettes s agrègent, le milieu s éclaircit et la quantitéde lumière transmise est proportionnelle àcet éclaircissement. On obtient une courbe d agrégation. Plaquettes lavées PN1-/- ou WT 3x10 8 /ml + thrombine Agrégation augmentée chez les souris PN1- /-en présence de faibles concde IIa
1-CoatingCollagène Collagen-induced thrombus formation under flow conditions 1000 sec-1 (fig 6E) 2-Incubation en chambre humide à4 C O/V 3-Saturation de la plaque en BSA 10µg/ml 4-Lavage de la plaque en tampon de flux Sang total de sourisincubéavec rhodamine6g Acquisition sur microscope Enregistrement d un film sur 2min Shear1000s -1 Quantification de la surface couverte par les plaquettes Images pour quantification sur Collagène 30sec 1min 2min
Quantification de l adhésion plaquettaire sur collagène Fig 6E Après 2 min de perfusion sur collagène, thrombiformés en présence de FT, plus gros chez les souris PN1-/-que chez les WT En présence de PPACK (inhibiteur de IIa), pas de différence d adhésion plaquettaire Effet de PN-1 dépendant de la thrombine Thrombose in vivo chez la souris. Anesthésie des souris. Marquages des cellules sanguines à la rhodamine 6G, 3.3mg/kg..Lésions au FeCl 3 500mM des artères/veines mésentériques.microscopie intravitaleen temps réel (artérioles/veinules mésentériques)
Formation de thrombus in vivo (fig 7) Après 20 min, occlusion complète des des veines du mésentères des souris PN1-/- 2xplus rapide que chez WT Résultats comparables dans les artérioles Rôle anti-thrombotique de PN-1 plaquettaire dans les veines et les artérioles Discussion-conclusion Lieu de stockage et sécrétion de la PN-1: PN-1 stockée dans les granules alpha des plaquettes PN-1 relarguéeaprès activation plaquettaire par thrombine (non fixée sur les plaquettes P-selectine) Activités de la PN-1: Inhibe directement la thrombine Inhibe l activation et l agrégation plaquettaire dépendante de la thrombine Inhibe la formation d un thrombus in vitro et in vivo PN-1 nouvelle cible anti-thrombotique