Melatonin-Sulfate Urine ELISA

Fiche technique Melatonin-Sulfate Urine ELISA Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif à but de diagnostic in-vitro de la Mélatonine Sulfate (synonymes: 6-hydroxymélatonine sulfate, 6-sulfatoxymélatonine) dans les urines humaines. RE54031 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com

1. BUT DU TEST Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif à but de diagnostic in-vitro de la Mélatonine Sulfate (synonymes: 6-hydroxymélatonine sulfate, 6-sulfatoxymélatonine) dans les urines humaines. 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION La glande pinéale (corpus pineale) est nommée transductrice neuroendocrine du fait de son rôle important relatif au photopériodisme. L hormone majoritairement synthétisée dans la glande pinéale est la N-acétyl-5- méthoxy-tryptamine ou mélatonine, synthétisée à partir de l acide aminé tryptophane. La mélatonine présente ses valeurs les plus élevées dans le plasma pendant la nuit. Son pic nocturne caractéristique semble décoder l information temporelle comme la longueur de la nuit. La régulation de la sécrétion en mélatonine est sous contrôle neural. Une innervation sympathétique semble jouer un rôle majeur via libération de noradrénaline. Des disfonctionnements et/ou taux de sécrétion en mélatonine ont été corrélés avec des problèmes de sommeil, décalage horaire, dépression, stress, schizophrénie, aménorrhée hypothalamique, grossesse, anorexie nerveuse, quelques formes de cancer, désordres immunologiques ainsi qu avec le contrôle de la maturation sexuelle pendant la puberté. La plupart de la mélatonine circulante est métabolisée dans le foie en 6-hydroxymélatonine et ensuite en 6-sulfatoxymélatonine qui est excrétée dans les urines. La concentration de la 6-hydroxymélatonine sulfate dans les urines se corrèle bien avec le taux total de mélatonine dans le sang pendant la période de collecte. 3. PRINCIPE DU TEST Le test immuno-enzymatique sur phase solide (ELISA) est basé sur le principe de compétition. La quantité inconnue d antigènes présents dans l échantillon et une quantité fixe d antigènes conjugués à une enzyme entrent en compétition pour les sites de fixation des anticorps coatés dans les puits. Après incubation, les puits sont lavés pour arrêter la réaction de compétition. L intensité de la couleur développée suivant la réaction substrat est inversement proportionnelle à la quantité d antigène présente dans l échantillon. Les résultats des échantillons peuvent être déterminés directement à partir de la courbe étalon. 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Le personnel de nettoyage doit être formé par des professionnels en ce qui concerne les risques potentiels et la manipulation des produits. 9. Eviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées. 5. STOCKAGE ET STABILITE Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké entre 2 C et 8 C. À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants. Les barrettes de la microplaque sont stables jusqu à la date de péremption du kit en étant stockées entre 2 C et 8 C dans le sachet déjà ouvert, mais hermétiquement refermé. Version 2014-05 1 / 6

6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Urine Il est possible d utiliser des urines spontanées ainsi que des urines de 24 h. Le volume total d urine excreté pendant une période de 24 h doit être collecté et mélangé dans une seule bouteille. Des conservateurs ne sont pas nécessaires. Déterminer le volume total pour le calcul des résultats. Stockage: 2-8 C -20 C (Aliquots) À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés. Stabilité: 4 jours 15 ans Pour plus de détails, lire: Griefahn et al. (2001). 7. MATERIEL FOURNI Quantité Symbole Composant 1 x 12 x 8 MTP 1 x 5 ml ANTISERUM 1 x 0.2 ml ENZCONJ CONC 1 x 7 x 0.1 ml CAL A-G 1 x 2 x 0.1 ml CONTROL 1+2 1 x 60 ml ASSAYBUF 1 x 50 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Microplaque Barrettes sécables. Coatée avec un anticorps IgG anti-lapin (chèvre, polyclonal). Mélatonine Sulfate Antisérum Prêt(e) à l emploi. Contient: Antisérum (lapin), Tampon Tris, 0.01 % Thimérosal. Conjugué Enzymatique, Concentré (40x) Contient: Mélatonine Sulfate, conjugués à de la peroxydase, tampon phosphate, 0.01 % Thimérosal. Étalon A-G 0; 1.7; 5.2; 15.6; 46.7; 140; 420 ng/ml 0; 5.2; 15.9; 47.6; 142; 427; 1281 nmol/l Prêt(e) à l emploi. Contient: Mélatonine Sulfate, Tampon Tris, 0.01 % Thimérosal. Contrôle 1+2 Prêt(e) à l emploi. Contient: 0.02 % Thimérosal. Consulter les concentrations / gammes acceptables sur le certificat CQ. Tampon pour Essai Coloré en rouge. Prêt(e) à l emploi. Contient: Tampon Tris, BSA, 0.01 % Thimérosal. Tampon de Lavage, Concentré (20x) Contient: tampon phosphate, Tween, 0.1 % Thimérosal. Solution Substrat TMB Prêt(e) à l emploi. Contient: TMB, Tampon, stabilisateurs. Solution d Arrêt TMB Prêt(e) à l emploi. 1 M H 2SO 4. 3 x FOIL Feuille Adhésive 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI 1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 10; 50; 100; 1000 µl 2. Tubes à essai en polystyrène et à fond rond (12 x 75 mm) 3. Portoir pour tubes à essai 4. Agitateur orbital (500 rpm) 5. Vortex 6. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs 7. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque 8. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 450 nm (longueur d onde de référence 600-650 nm) 9. Eau bidistillée ou désionisée 10. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre Version 2014-05 2 / 6

9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Quelques composants contiennent 250 µl solution. Assurez-vous que la solution soit complètement dans le fond du flacon avant son ouverture. 5. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 6. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque. 7. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et au même intervalle de temps. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter une même solution dans tous les puits. 8. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés provoqueront des résultats erronés. Il est recommandé d utiliser une pipette multicanaux ou un système de lavage de microplaque automatique. Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage ou l aspiration. Rincer et ajouter les réactifs avec précaution. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient régulièrement remplis avec le tampon de lavage, et qu aucun reste ne soit ensuite visible. 9. L humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n ait atteint la température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet refermé avec le dessiccateur. 10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Le contenu du kit pour 96 dosages peut être divisé en 3 analyses différentes. Les volumes indiqués ci-dessous sont pour un test avec 4 barrettes (32 dosages). 10.1. Préparation des composants concentrés Diluer / dissoudre Composant Diluant Relation Remarques Stockage Stabilité 15 ml WASHBUF CONC 50 µl ENZCONJ CONC jusqu à 300 ml avec 2 ml eau bidist 1:20 ASSAYBUF 1:41 Dissoudre les cristaux à 18-25 C. Préparer fraîchement et n utiliser qu une fois. 10.2. Dilution des Etalons, Contrôles et Echantillons Urinaires de Patient 2-8 C 18-25 C 4 semaines 30 minutes 1. Pipeter 10 µl de chaque Etalon, Contrôle et échantillon urinaire de patient dans des tubes en polystyrène, polypropylène ou en verre. Eviter l exposition lumineuse directe. 2. Pipeter 500 µl de Tampon pour Essai dans chaque tube. Vortexer. Les échantillons contenant des concentrations supérieures à celle de l étalon le plus concentré doivent être dilués de nouveau avec du Tampon pour Essai. Version 2014-05 3 / 6

11. PROCEDURE DU TEST 1. Pipeter 50 µl de chaque Etalon dilué, Contrôle dilué et échantillon de patient dilué dans les puits respectifs de la Microplaque. 2. Pipeter 50 µl de Conjugué Enzymatique fraîchement préparé dans chaque puits. 3. Pipeter 50 µl d Antisérum Mélatonine Sulfate dans chaque puits. 4. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 2 h à TA (18-25 C) sur un agitateur orbital (500 rpm). 5. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 4 x avec 250 µl de Tampon de Lavage dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. 6. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l ajout des Solutions Substrat et d Arrêt. Pipeter ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d air. 7. Pipeter 100 µl Solution Substrat TMB dans chaque puits. 8. Incuber 30 min à TA (18-25 C) sur agitateur orbital (500 rpm). 9. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 µl de Solution d Arrêt TMB dans chaque puits. Mélanger rapidement le contenu en agitant la plaque. 10. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm (longueur d onde de référence: 600-650 nm) dans les 60 min suivant l ajout de la Solution d Arrêt. 12. CONTROLE QUALITE Les résultats du test ne sont valides que si le test a été réalisé en suivant les instructions. De plus, l utilisateur doit strictement se conformer aux règles BPL (bonnes pratiques de laboratoire) ou directives comparables. L utilisateur et/ou le laboratoire doivent disposer d un système validé pour établir un diagnostic conformément aux principes de BPL. Tous les étalons et contrôles du kit doivent être trouvés dans les gammes acceptables indiquées sur les étiquettes et dans le certificat de Contrôle Qualité (CQ). Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non valide et il doit être répété. Chaque laboratoire devrait utiliser des échantillons connus comme contrôle supplémentaire. Il est recommandé de participer aux programmes de contrôle qualité appropriés. En cas de déviation des résultats, vérifier les origines éventuelles techniques: dates de péremption des réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d incubation et méthodes de lavage. 13. CALCUL DES RESULTATS Les densités optiques (DO) des étalons (axe y, linéaire) sont reportées en fonction de leurs concentrations (axe x, logarithmique) soit sur papier graphique semi-logarithmique soit en utilisant une méthode automatisée. Une bonne analyse est obtenue avec les méthodes cubic spline, Logistics 4 Paramètres ou Logit-Log. Pour le calcul de la courbe étalon, appliquer chaque signal des étalons (une valeur apparemment fausse d un double dosage peut ne pas être prise en compte et peut être remplacée par une valeur plus plausible). La concentration des échantillons peut être lue à partir de la courbe étalon. La dilution initiale a été prise en compte pour pouvoir lire les résultats à partir du graphe. Les résultats des échantillons ayant été davantage dilués doivent être multipliés par le facteur de dilution appliqué. Les échantillons montrant une concentration supérieure à celle de l étalon le plus concentré doivent être dilués de la façon décrite dans les PREPARATIONS PREALABLES AU TEST et testés de nouveau. Calculer la sécrétion de 24 h pour chaque échantillon urinaire: µg/24 h = µg/l x L/24 h Conversion: Mélatonine Sulfate (ng/ml) x 3.05 = nmol/l Version 2014-05 4 / 6

Courbe Etalon Typique (Exemple. Ne pas utiliser pour vos calculs!) Étalon Mélatonine DO Moyenne DO/DO max (%) Sulfate (ng/ml) A 0.0 1.805 100.0 B 1.7 1.741 96.5 C 5.2 1.536 85.1 D 15.6 1.185 65.7 E 46.7 0.773 42.8 F 140.0 0.341 18.9 G 420.0 0.164 9.1 OD 450 nm 6-Sulfatoxymelatonin ELISA 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 1 10 100 1000 ng/ml 14. VALEURS ATTENDUES Les résultats ne peuvent pas être l unique raison de conséquences thérapeutiques. Ils doivent être corrélés à d autres observations cliniques et tests diagnostiques. Des sujets apparemment sains ont montré les valeurs suivantes: Mélatonine Sulfate Age n 24h (µg)* fraction de nuit (µg/h) Moyenne 90% percentile Moyenne 90% percentile 20-35 26 36.8 15.6-58.1 2.8 0.9 5.6 36-50 17 29.6 9.9 52.9 2.1 0.6 3.6 51-65 16 20.4 12.3 32.8 1.5 0.9 2.5 > 65 16 15.8 7.5 32.7 1.0 0.3 2.3 * L excrétion de 24 h a été calculé comme la somme de quatre périodes de collecte. Pour plus de détails voir: Mahlberg R. et al. Normative data on the daily profile of urinary 6-sulfatoxymelatonin in healthy subjects between the ages of 20 and 84. Psychoneuroendocrinology (2006) 31, 634-641 Il est recommandé que chaque laboratoire établisse ses propres valeurs normales. 15. LIMITES DE LA PROCEDURE La collecte et stockage des échantillons a une influence significative sur les résultats du test. Voir le paragraphe COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS pour plus de détails. Pour les réactivités croisées, voir PERFORMANCE. 16. PERFORMANCE Spécificité Analytique (Réactivité Croisée) Substance Réactivité Croisée (%) Mélatonine Sulfate 100 Mélatonine 0.002 6-OH-Mélatonine 0.001 N-acétyl-L-OH-Tryptamine 0.0005 N-acétyl-L-Tryptophane < 0.0001 5-Méthoxy-Tryptamine < 0.0001 Tryptamine < 0.0001 5-HIA < 0.0001 Sensibilité Analytique (Limite de Détection) Précision Gamme (ng/ml) CV (%) Intra-Essai 5.8-204 5.2 12.2 Inter-Essai 12.4 220 5.1 14.9 Linéarité Récupération Comparaison de Méthode versus RIA 1.0 ng/ml Signal moyen (Etalon zéro) - 2SD Réactivité croisée d autres substances testées < 0.0001 % Gamme (ng/ml) Dilution en Série jusqu au Gamme (%) 96.5 248.8 1:32 80-116 Moyenne (%) Gamme (%) 105.8 91-122 % Récupération après enrichissement Essai IBL = 1.15 x RIA + 4.2 r = 0.96; n = 40 Version 2014-05 5 / 6

17. LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. Kondo, M. Tokura H., Wakamura T., Hyun KJ., Tamotsu S., Morita T., Oishi T., Influence of twilight on diurnal variation of core temperatuer, its nadir, and urinary 6-hydroxymelatonin sulfate during nocturnal sleep and morning drowsiness. Coll. Antropol. 33 (2009) 1: 193-199 2. Radwan P., Skrzydlo-Radomanska B., Radwan-Kwiatek K., Burak-Czapiuk B., Strzemecka J. Is melatonin involved in the irritable bowel syndrome? Journal of Physiology and Pharmacology (2009), Suppl 3, 67-70 3. Mahlberg R. et al. Normative data on the daily profile of urinary 6-sulfatoxymelatonin in healthy subjects between the ages of 20 and 84. Psychoneuroendocrinology (2006) 31, 634-641 4. Kunz et al. Melatonin in Patients with Reduced REM Sleep Duration: Two Randomized Controlled Trials. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 89(1): 128-134 (2004) 5. Mahlberg et al. Melatonin and age. Somnologie 7 (Suppl. 1): 9-88 (2003) 6. Griefahn et al. Melatonin production during childhood and adolescence: a longitudinal study on the excretion of urinary 6-hydroxymelatonin sulfate. J. Pineal Res. 34:26-31 (2003) 7. Bortkiewicz et al. The excretion of 6-hydroxymelatonin sulfate in healthy young men exposed to electromagnetic fields emitted by cellular phone an experimental study. Neuroendocrinology Letters 23(suppl 1):88-91 (2002) 8. Kunz et al. Exogenous Melatonin in Periodic Limb Movement Disorder: An Open Trial and a Hypothesis. SLEEP, Vol. 24, No. 2, 183-187, (2001). 9. Griefahn et al. Long-Term Stability of 6-Hydroxymelatonin Sulfate in 24-h Urine Samples Stored at 20 C. Endocrine, vol. 15, no. 2, 199-202, July (2001). 10. Kunz D et al. Melatonin as a therapy in REM sleep behavior disorder patients: an open-labeled pilot study on the possible influence of melatonin on REM-sleep regulation. Movement Disorders, 14: 507-511 (1999) 11. Pfluger DH, Minder CE. Effects of exposure to 16.7 Hz magnetic fields on urinary 6-hydroxymelatonin sulfate excretion of Swiss railway workers. J. Pineal Res., 21: 91-100 (1996) Version 2014-05 6 / 6

Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Tel.: +1 (416) 645-1703 Fax: -1704 E-MAIL: Sales@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20