Comment les virus usurpent les voies de transport cellulaires?

Comment les virus usurpent les voies de transport cellulaires? Fabienne Rayne Laboratoire Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité UMR5234 7 novembre 2013

Cours non exhaustif Quelques exemples pour illustrer ce thème

Les voies de transport cellulaire : voies d entrée, de sortie et trafic Entrée = Endocytose internalisation de molécules et de grosses particules dans la cellule Trafic intracellulaire dans le cytoplasme : transport vésiculaire (cytosquelette) dans le cytosol : transport de molécules (cytosquelette) Sortie = Exocytose transport par des vésicules de sécrétion libération de molécules dans le milieu extérieur ou exposition à la surface D après Trafficking Inside Cells: Pathways, Mechanisms and Regulation

Les voies de transport cellulaires : fonctions principales Répondre aux signaux extérieurs (ex : facteurs de croissance, stress mécanique), transduction de signal Régulation négative du signal (ex : récepteur aux facteurs de croissance ) : internalisation du complexe récepteur /ligand pour diminuer exposition à la surface désensibilise la cellule une fois le signal transmis Entrée de nutriments sous forme de macromolécules (ex : cholestérol par LDL, fer par la transferrine) Transcytose : passage de molécules de la partie apicale à la partie basolatérale des cellules polarisées Tri, recyclage, dégradation, stockage, maturation de molécules dites «CARGO» Trafic intracellulaire pour cibler les protéines cellulaires vers leur compartiment de destination ex : protéine résidant dans le RE, protéines membranaires enchâssées dans la membrane plasmique Exocytose de molécules ex : neurotransmetteurs, hormones

Les voies de transport cellulaires : réseau complexe Réseau complexe de voies de transport : mouvements de l extérieur de la cellule vers l intérieur ET mouvements du RE vers l extérieur de la cellule Implication de différents compartiments (RE, Golgi, endosomes, lysosomes) Existence d interconnections entre les voies Voies utilisées par les virus pour passer la première barrière de la cellule : membrane plasmique D aprèsle livre Molecular biology of the cell, 2002, 4ème édition

Les voies d endocytose : caractéristiques et classifications possibles Récepteurs Radeaux lipidiques «rafts» Actine Dynamine Clathrine Cavéoline Mayor et al, 2006, Nat Rev Mol Cell Biol

Les voies d endocytose : caractéristiques et classifications possibles TPA induces macropinocytosis in A431 cells. Phagocytose et macropinocytose Merceret al, 2010, Ann RevBiochem TPA = ester de phorbol Grimmer et al, 2002, J Cell Science Formations d extensions vers le milieu extérieur Phagocytose - Cellules spécialisées (macrophages, polynucléaires éosinophiles et neutrophiles) - Formation d un phagosome dans la cellule Macropinocytose - En théorie toutes les cellules -Ne dépend pas de la présence d une particule -Non spécifique mais peut être induite par des facteurs de croissance par ex - Entrée massive de fluide et solutés - Remodelage actine et formation d un macropinosome - Macropinosome mature en endosome précoce, puis tardif et fusionne avec lysosome

Les voies d endocytose : caractéristiques et classifications possibles Récepteurs Autres voies Radeaux lipidiques «rafts» Clathrine Dynamine 2-5 min Rapide Dynamine Cavéoline Lent (>60 min) ph neutre 10-15 min ph acide 30-60 min Schütze et al, 2008, Nat Rev Mol Cel Biol

Endocytose par les puits recouverts de clathrine Voie dépendante de la clathrine -La mieux connue Autres voies -Dépend de la liaison d un ligand sur son récepteur (ex: transferrine sur Rctransferrine; EGF sur le Rcà l EGF) - Caractérisée par la formation de puits recouverts d un manteau de clathrine caractéristique -Dépend de la clathrineet de la dynamine - Endosome précoce, de tri, tardif (ph acide) et fusion avec lysosome (ph acide/enzymes de dégradation) UBC, Vancouver, Canada a : Tf -or dans les puits recouverts de clathrine b : Cryomicroscopieet visualisation du manteau de clathrinesur la face interne de la membrane Mayoret al, 2006, Nat RevMol CellBiol

Les voies d endocytose : caractéristiques et classifications possibles Voie cavéoles/cavéoline Autres voies - Découverte en étudiant le virus SV40 (polyomavirus, non enveloppé, même famille BK et JC) - Riche en lipides particuliers (cholestérol et sphingolipides) qui forment les radeaux lipidiques «Rafts» - Forment des cavéosomes(ph neutre, absence des marqueurs des endosomes) -Cargo dans cavéosomespeut être dirigé vers le RE en passant par les endosomes -Dépend de la cavéoline, de la dynamine, de l actine et des rafts - Toxine cholérique connue pour utiliser cette voie d entrée dans certaines cellules (marqueur) Voies indépendantes de la clathrine et de la cavéoline Voie cavéoles (dépendante cavéoline, radeaux lipidiques) c : Cavéoles d : Toxine cholérique - péroxydase Voie indépendante de la clathrineet de la cavéoline e : Ancre GPI-GFP f : Toxine cholérique -péroxydase Mayor et al, 2006, Nat Rev Mol Cell Biol

Les voies d endocytose : des endosomes aux lysosomes Récepteurs Rafts Dynamine Cavéoline Actine Clathrine Endosome précoce ph acide Corps multivésiculaires Endosome tardif Tsg101 Hrs Dégradation Modifié d après Merceret al, 2010, Ann Rev Biochem

Voies d endocytose détournées pour l entrée des virus : avantages Avantages de l endocytose pour les virus : -ne laisse pas de trace de passage du virus sur la membrane (évite reconnaissance de la cellule infectée par le SI) -mécanismes pré-existantsdans la cellule : toute la machinerie cellulaire est là, prête à l emploi! -caractérisquesdes différents types d endosomes (ph par ex) utilisées par le virus pour atteindre le site de réplication Différentes étapes nécessaire à la libération du génome en fonction du site de réplication -Exemple ici avec schéma de virus animaux Marsh et al, 2006, Cell

Voies d endocytose détournées pour l entrée des virus Modifié d après Mercer et al, 2010, Ann Rev Biochem Etude des virus a participé à la découverte de nouvelles voies d endocytose (ex : SV40 et voie cavéoles) Voie d endocytose sont variables selon les virus Un même virus peut utiliser différentes voies en fonction de la cellule rencontrée Dépend de : taille, site de réplication, structure du virus,

Voies d endocytose détournées pour l entrée des virus Autre illustration Schelhaaset al, 2010, Cell Microbiol

Exemple d entrée de virus par macropinocytose Induction of macropinocytosis by filamentous influenza virions Virus vaccine Rossmanet al, 2012, JVirol Merceret al, 2010, Nat CellBiol

Exemples d entrée par les voie dépendantes de clathrine ou cavéoline Entrée West Nile virus par la voie clathrine Chu et al, 2004, J Virol(West Nile Virus = Flaviviridae) Marsh et al, 2006, Cell Entrée SV40 par cavéoles Pelkmanset al, 2001, Nature (SV40 = Polyomaviridae)

Modèles et outils expérimentaux Modèle d étude in cellulo: le plus souvent infections de cellules en culture (primaires ou plus souvent de cellules immortalisées, avec les biais que cela comporte) Suivant les virus et leur dangerosité, pas toujours facile de disposer des infrastructures adaptées pour les manipuler Les voies d endocytose ne sont pas toujours faciles à distinguer : interconnections possibles et virus qui utilisent des éléments de différentes voies à leur profit

Outils expérimentaux pour identifier les voies d endocytose Marqueursdont localisation connue : ex Rab pour les différents types d endosome, Tf pour la voie clathrine, la toxine cholérique pour les cavéoleset imagerie (microscopie confocale, immunofluorescence, utilisation de protéines fluorescentes [ex : GFP]) Critères d identification des voies d endocytose Mutants dominant négatifs qui inhibent la fonction d un facteur cellulaire endogène (ex : dynamine) sh/si RNA qui inhibent l expression de facteurs cellulaires spécifiques (que l on choisit!) Inhibiteurs spécifiques (ex : bafilomycine A1 qui inhibe l acidification des endosomes; dynasore pour la dynamine) Couplage des virus à des fluorophorespour suivre leur entrée dans la cellule en temps réel par microscopie à fluorescence Mayoret al, 2006, Nat RevMol CellBiol Criblage de sirnapour identifier les facteurs cellulaires nécessaires à l infection virale

Exemple d étude de l entrée du virus Ebola Septembre 2010 Souche Ebola Zaïre la plus dangereuse (ZEBOV) : 90 % de mortalité Fièvre hémorragique Difficile à étudier : particules infectieuses en P4!!!!! Indispensable de trouver des modèles d études permettant une manipulation aisée, non dangereuse Peu de connaissances sur l entrée de ce virus : - données contradictoires avec des virus «hybrides» = pseudotypes - voies d entrée varient en fonction des modèles utilisés Dans cet article récent (Sept 2010): - virus infectieux (ZEBOV) et pseudoparticules(virus-like Particles = VLP)

Exemple d étude de l entrée du virus Ebola Effet de dominants négatifs sur l entrée des VLP (cellules Vero) Pas d effet des dominants néga3fs (Eps15 et Cavéoline) des voies clathrine et cavéoline Recherche colocalisation VLP avec marqueurs des 2 voies (IF sur cellules Vero) Pas de colocalisation

Exemple d étude de l entrée du virus Ebola Effet d un inhibiteur de la dynamine (dynasore) (voies clathrine et cavéoline) Infection cellules Véro avec virus infectieux exprimant une protéine fluorescente Effet d un dominant négatif de la dynamine et colocalisation Pas d effet du dynasore Entrée des VLP Colocalisation VLP et dynamine Pas d effet du dominant néga3f et pas de colocalisation avec la dynamine

Exemple d étude de l entrée du virus Ebola Implication des domaines lipidiques «Rafts» riches en cholestérol Recherche d une colocalisation avec un marqueur des rafts IF toxine cholérique et VLP fluorescentes dans cellules Vero Colocalisation des VLP avec les rafts Effet de drogues capables d extraire (MBC) ou de séquestrer (nystatine) le cholestérol Cellules Vero traitées puis infectées par virus infectieux codant la GFP Inhibi3on de l infec3on par les drogues Implica3on des ra5s et du cholestérol dans l entrée du virus Ebola

Exemple d étude de l entrée du virus Ebola Internalisation de solutés pendant l entrée du virus? Macropinocytose? Suivi de l entrée de dextran (rouge) et des VLP (vertes) Entrée de dextran après infection Colocalisation des VLP avec le dextran Augmenta3on de l entrée de dextran après infection Macropinocytose?

Exemple d étude de l entrée du virus Ebola Implication des endosomes précoces? Recherche colocalisation EEA1 (rouge) et des VLP (vertes) au cours du temps Colocalisation des VLP avec le marqueur EE1A des endosomes précoces

Exemple d étude de l entrée du virus Ebola Conclusions : -Entrée du virus Ebola : macropinocytose, nécessite les raftsde la membrane plasmique et les particules virales empruntent les endosomes précoces -Démonstration qu il n est pas si simple de déterminer les voies de transport utilisées par les virus -Illustration parfaite du détournement de toutes les machineries cellulaires disponibles par les virus Pas ausssi simple que dans les livres!!!!!!!!!!

Entrée du virus par endocytose et libération dans le cytosol Entrée par endocytose : particule virale dans vésicule Passage de la deuxième barrière membranaire pour libérer la particule/génome dans le cytosol -Est l «échappement endosomal» quand le virus se trouve dans les endosomes: évite la dégradation par lysosome Le plus souvent, utilisation des caractéristiques des vésicules pour l échappement -Ex : le ph acide des endosomestardifs Exemples d échappement endosomal -Virus Influenza (enveloppé) : ph acide changement de conformation de l HA exposition peptide fusogène insertion dans membrane fusion enveloppe du virus et membrane de l endosome - Adénovirus(non enveloppé) : endosome tardif désassemblage partiel de la particule protéine de capside VI libérée induction courbure de la membrane de l endosomeet rupture Quand génome/particule libéré dans le cytosol : transport vers le site de réplication Le plus souvent utilisant du cytosquelette (microtubules) Smith et al, 2004, Science

Entrée du virus par endocytose et libération dans le cytosol Virus Influenza Adénovirus VI VI VI Dimitrov, 2004, NatRevMicrobiol VI Modifié d après Nemerov, 2009, Virology

Echappement endosomal de l adénovirus filmé! Endosome lysé Virus