Prélèvements bactériologiques divers 1. Objet et domaine d application Ce mode opératoire décrit la réalisation des différents prélèvements bactériologiques, mycologiques et parasitologiques. 2. Documents associés Références bibliographiques : REMIC «5 ème édition 2015» RFL 1999 «L étape pré-analytique en parasitologie-mycologie» Cahier de Formation Biologie médicale N 31 2004 «les dermatophytes» 3. Responsabilités Les prélèvements sont réalisés sous la responsabilité du biologiste et sont pratiqués par le personnel autorisé et habilité. Au préalable la personne ayant pris en charge la demande d analyse aura la responsabilité de donner les préconisations aux patients La personne qui réceptionne le prélèvement à la responsabilité de vérifier l identité des échantillons apportés. La conformité des prélèvements est sous la responsabilité de la personne qui est présente à ce poste et qui est habilitée pour cette tâche. 4. Déroulement de l activité 4.1. Le matériel utilisé Voir la colonne «Matériel» du tableau suivant. Page 1 sur 14
4.2 Prélèvements bactériologiques, parasitologiques Le prélèvement doit être pratiqué avant toute antibiothérapie locale ou générale, sauf en cas de contrôle après traitement (L ECBU est traité avec les prélèvements urinaires) Selles pour Coproculture Code COPRO(inclut la recherche adénorotavirus) Si toxine de C. difficile : code CLOSD Si recherche isolée de levures : code SELMY Selles pour Parasitologie Code PARA Le prélèvement est réalisé si possible avant le début de l antibiothérapie, et lors des épisodes diarrhéiques. Il est souhaitable de faire cet examen à distance de tout traitement, avec un régime sans résidu la veille du recueil. la prescription d une seule coproculture est généralement suffisante. La recherche de Rotavirus et Adénovirus est faite systématiquement chez les enfants de moins de 3 ans. Remplir la fiche de renseignements (PLVMT/ENR009) «Renseignements parasitologiques». En fonction de la demande, la recherche de parasites peut se faire sur 3 prélèvements effectués 3 jours de suite. Recherche d amibes Le traitement de l analyse doit être immédiat : Délai d acheminement dans l heure (recherche doit être précisée sur l ordonnance). Échantillon de selles recueilli dès leur émission. Une aliquote du volume d une noix est prélevée à l aide d une spatule puis transférée dans le flacon stérile fourni par le laboratoire. Un écouvillonnage rectal peut se révéler utile notamment chez le nourrisson et le petit enfant et en particulier dans le cadre d un syndrome hémolytique et urémique. Échantillon de selles recueilli dès leur émission. Une aliquote du volume d une noix est prélevée à l aide d une spatule puis transférée dans le flacon stérile fourni par le laboratoire. Flacon stérile avec spatule Quantité : équivalent d une noix par recherche Flacon stérile avec spatule Quantité : équivalent d une noix par recherche T réfrigérée dans les 12h au maximum. Pour une recherche virale : T réfrigérée pendant 24 à 48h. T réfrigérée pendant 24h pour une analyse parasitologique standard Pour une recherche d amibes délais d acheminement <1h Page 2 sur 14
Cet examen est à réaliser 3 jours de suite. Recherche de sang dans les selles Code SGSEL Les échantillons ne doivent pas être prélevés pendant ou dans les trois jours suivant une menstruation. L'abus d'alcool, d'aspirine ou d'autres médicaments peut provoquer une irritation gastrointestinale entraînant une hémorragie occulte. Ces substances doivent être évitées pendant au moins 48 heures avant le test. Échantillon de selles recueilli dès leur émission. Une aliquote du volume d une noix est prélevée à l aide d une spatule puis transférée dans le flacon stérile fourni par le laboratoire. Prélèvement à renouveler pendant 3 jours Flacons stériles avec spatule Les échantillons peuvent être conservés pendant 3 jours au réfrigérateur Il est recommandé d adresser les flacons au laboratoire au fur et à mesure. Aucune restriction alimentaire n'est nécessaire avant de réaliser cette recherche. Quantité : équivalent d une noix Cas particulier : Scotch test ou test à la cellophane adhésive Code SCOTC Ce test permet de mettre en évidence les œufs d Oxyures (vers intestinaux), très fréquents chez les enfants et très contagieux, entraînant des démangeaisons et troubles du sommeil. A effectuer au lever avant la toilette et les premières selles. Décoller le scotch de son support. Appliquer le coté adhésif sur les plis de la marge anale et le maintenir en appuyant quelques secondes. Retirer le scotch et l étaler sur la lame support en le maintenant bien tendu. Renouveler l opération avec un second scotch Placer les 2 lames dans l étui et l identifier avec le nom et prénom Lame Cellophane adhésive L'étui doit être acheminé au laboratoire dans les plus brefs délais. T ambiante pendant 24H Prélèvement Urétral Le prélèvement doit être fait si possible le matin avant le premier jet d urine en recueillant le pus ou l écoulement du méat urétral. Code URET Si mycoplasmes code URETM Si Chlamydia code CHLAM (à réaliser en systématique chez l homme) Si ce n est pas possible il doit être fait au moins 3 à 4 heures après la dernière miction. Recherche de germes dont le gonocoque Prélever le pus urétral à l aide d écouvillons et les placer dans leur milieu de. 2 écouvillonnages (1 pour la culture + 1 pour l examen direct). (germes sensibles au froid : Neisseria gonorrhoae) Page 3 sur 14
Recherche de Chlamydiae trachomatis Utiliser 1 écouvillon fin, l introduire à 3-4 cm dans l urètre et le déposer dans le milieu de adapté. spécifique T réfrigérée dans milieu de spécifique fourni (kit à disposition) Cette recherche peut aussi s effectuer sur le 1 er jet d urines (10 ml) obtenu sans toilette, ni désinfection préalable. Quantité : 10 ml T réfrigérée pour une durée maximale de 24h. Prélèvement Vaginal Code PV Si mycoplasmes code PVM Si Chlamydiae code CHLAM Stérilet Code STERI Remplir la fiche de renseignements (PLVMT/ENR010) «Fiche de Renseignements Prélèvement vaginal». Eviter toute toilette intime, tout traitement local (crème, gels, savons ) ainsi que tout rapport sexuel dans les 24 heures précédant l examen. Il est conseillé d'éviter le prélèvement pendant la période menstruelle car la flore est modifiée (sauf avis contraire du prescripteur). Le prélèvement doit être réalisé avant ou à distance de tout traitement antibiotique (> 15 jours pour les chlamydiae, > 5 jours pour les germes banals). Pour les stérilets, le placer dans un bouillon ou du sérum physiologique stérile et ensemencer à partir du liquide. Après mise en place d un spéculum à usage unique, et en présence d un éclairage adapté, les prélèvements sont réalisés à 2 niveaux : Le cul de sac vaginal postérieur : Pour la recherche d un déséquilibre de la flore vaginale (vaginose bactérienne) ou d une vaginite (Trichomonas vaginalis, par exemple) voire d une mycose et des mycoplasmes (si indiqués) L endocol : Après nettoyage de la glaire cervicale au niveau de l endocol pour la recherche de gonocoque 1 écouvillonnage du col. Noté Endocol Lésion visible : 1 écouvillonnage de la lésion visible. Noté lésion et localisation (germes sensibles au froid : Neisseria gonorrhoae) Page 4 sur 14
Recherche de Chlamydiae trachomatis Nettoyer correctement l exocol puis prélever l endocol avec 1 écouvillon spécifique. Pour augmenter les chances de trouver C.trachomatis, on peut faire 1 écouvillonnage vaginal dont l écouvillon est placé dans le même milieu de. Kit recherche Chlamydiae spécifique (kit à disposition) T réfrigérée dans milieu de spécifique fourni PV chez la femme enceinte Recherche du portage de Streptococcus Agalactiae (Strepto B) L emploi d un spéculum n est pas recommandé. Prélèvement à faire de préférence au laboratoire En cas d antécédents d accouchement prématuré Prélèvement à faire de préférence au laboratoire 1 écouvillonnage du tiers vaginal inférieur (34 ème 35 ème semaine) Sa présence permet de mettre en place une antibio -prophylaxie au moment de l accouchement. Effectuer un frottis vaginal à l écouvillon en début de grossesse pour rechercher systématiquement une vaginose. Pas de spéculum + milieu de Recherche de mycoplasmes Si recherche isolée code MYCOP Ils sont très sensibles à la dessiccation, il faut utiliser des milieux de adaptés En cas d urétrite Prélèvement avec des cellules car le mycoplasme adhère aux cellules Recherche effectuée sur le 1 er jet d urine spécifique tige en Dacron et non en bois placé dans un milieu de spécifique adapté < 2h T réfrigérée Flacon < 2h Si milieu de liquide spécifique T réfrigérée pendant 24h maximum Recherche de tréponème Au centre de la lésion, recueil de la sérosité. Etalement sur une lame Ne pas fixer Quantité : 1/3 flacon 1 lame mise dans un étui porte-lame Envoi laboratoire spécialisé Ulcération génitale Code Plaie Recherche d une surinfection bactérienne ou d Haemophilus Ducreyi Bordure de la lésion : recueil du pus Recherche d Herpès simplex virus Diagnostic d orientation Sur le plancher de la lésion : grattage des cellules 1 lame pour examen par Immunofluorescence (kit à disposition) Envoi laboratoire spécialisé Page 5 sur 14
Culture virale Sur le plancher de la lésion: grattage des cellules 1 écouvillon spécifique placé dans le milieu de spécifique (kit à disposition) T réfrigérée Envoi laboratoire spécialisé Sperme pour Spermoculture Code SPERC Toilette soigneuse avant le recueil (savon + rinçage abondant à l eau) L idéal est d apporter le prélèvement au laboratoire dans les 15 minutes (au plus tard une demiheure) après le recueil. Se laver les mains Uriner Recueil par masturbation (uniquement) après une désinfection locale. Recueil de la totalité de l éjaculât 1 flacon stérile Quantité : totalité de l éjaculât : < 2h Conservation au minimum à (>20 C Surtout l hiver) Peau, phanères Code PEAU, PEAU2 si 2 niveaux (codes valables pour bactério associée à myco) Utiliser 1 écouvillon préalablement imbibé d eau physiologique. de < 48 h < 2h Suppurations closes Code PUS Prélèvement effectué par le médecin Les liquides de ponction en seringue doivent être transférés dans des systèmes hermétiquement clos (seringue avec bouchon sans l aiguille) 1 flacon stérile ou 1 seringue de liquide de ponction (fermée hermétiquement sans son aiguille) Prélèvement liquide : < 2h sinon, utiliser un milieu de Prélèvement biopsique solide : < 2h sinon, utiliser un milieu de permettant la survie des bactéries fragiles et des aérobies. Page 6 sur 14
liquide d épanchement (ascite, dialyse péritonéale, pleural, kyste) code PONSC Prélèvement effectué par le médecin Les liquides de ponction en seringue doivent être transférés dans des systèmes hermétiquement clos (seringue avec bouchon sans l aiguille) < 2h Prélèvement liquide : < 2h sinon, utiliser un milieu de liquide articulaire code PONC si chimie associée, code PONSC sans chimie Prélèvement effectué par le médecin 1 flacon stérile + 1 tube citraté < 2h Prélèvement liquide : < 2h sinon, utiliser un milieu de Infections cutanées : Plaie, escarre, ulcère, écoulement purulent Code PLAIE Du fait de la diversité des infections cutanées, l identification précise du type d infection et sa localisation sont s Les escarres ne devront être prélevées qu au stade III ou IV, c est à dire lorsque la perte de la substance atteint ou dépasse le fascia : les écouvillonnages des escarres sont à bannir car ils reflètent la colonisation bactérienne qui est souvent massive.les ulcères veineux ne seront prélevés qu en cas d infection. Au préalable une détersion au sérum physiologique de la zone à prélever et éventuellement une désinfection des zones proximales sont nécessaires. Prélever 2 échantillons à l aide d écouvillons préalablement imbibés d eau physiologique. On réalise 2 écouvillons dont l un sert à effectuer un étalement sur lame, l autre étant destiné à la mise en culture. de :< 48h Pus auriculaire Code ORL Otite moyenne Otite externe Le prélèvement est en général effectué à l aide de 2 écouvillons fins, l un servant à réaliser un étalement sur lame, l autre étant destiné à la mise en culture Eliminer les débris et croûtes présents dans le conduit auditif externe à l aide d un 1 er écouvillon humidifié, puis 2 écouvillonnages successifs sont réalisés, l un servant à réaliser un étalement sur lame, l autre étant destiné à la mise en culture. fin en Dacron Page 7 sur 14
Le recueil des crachats doit se faire le matin, au réveil, lors d un effort de toux, aidé si besoin d une kinésithérapie. Il faut éviter la présence de salive. Expectoration Code EXPE Fermer hermétiquement le flacon, l identifier très précisément. L adresser le plus rapidement possible au laboratoire accompagné de l ordonnance et de l heure du prélèvement. Le prélèvement doit être acheminé le plus rapidement possible au laboratoire Procéder au recueil, directement dans le flacon Fermer hermétiquement le flacon, l identifier très précisément et noter l heure du prélèvement. < 2h (Germes sensibles au froid : S.pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis) Un formulaire PLVMT/ENR007 : «Fiche de renseignements Prélèvement d expectoration» est remis au patient avec un questionnaire à compléter le jour du recueil. Quantité : une expectoration complète Nasal, Rhinopharyngé Code ORL 1 écouvillonnage des 2 narines avec le même écouvillon qui peut être humidifié préalablement avec de l eau stérile. On réalise 2 écouvillons dont l 1 sert à effectuer 1 étalement sur lame, l autre étant destiné à la mise en culture. Pus de sinus Code PUS Prélèvement effectué par un médecin (ORL) 1 flacon stérile et/ou 1 écouvillon de < 48h Buccal Code MYCO si recherche isolée de levures Code ORL si bactério associée Recherche de Candida spp, Le prélèvement s effectue au niveau de la langue, du palais et de la face interne des joues Page 8 sur 14
Gorge Code ORL La toilette faciale doit être évitée avant l examen pour conserver le maximum de secrétions. Il est conseillé d éviter l utilisation de produits de maquillage qui peuvent rendre la lecture de l examen direct difficile. L émission du son «A» par le patient a pour but de diminuer le réflexe nauséeux. Il peut être utile d abaisser la langue pour dégager le pharynx et éviter tout contact salivaire. Procéder à l écouvillonnage des amygdales (ou de l amygdale atteinte en cas d amygdalite unilatérale) ou, en leur absence, des piliers du voile du palais. Réaliser 2 écouvillons dont l 1 sert à effectuer 1 étalement sur lame, l autre étant destiné à la mise en culture Quelques points particuliers, fonction du contexte : En présence d une ulcération ou d un exsudat, le prélèvement doit s effectuer à leur niveau. Pour la recherche de Candida spp, le prélèvement s effectue au niveau de la langue, du palais et de la face interne des joues. Lors d une suspicion de diphtérie, le prélèvement doit porter sur la périphérie ou sous les fausses membranes Recueil des secrétions et / ou du pus conjonctival dans l angle interne de l œil à l aide d un écouvillon. On réalise 2 écouvillons dont l 1 sert à effectuer 1 étalement sur lame, l autre étant destiné à la mise en culture. Abaisse langue Oculaire Code OEIL Recherche de Chlamydia : En cas de suspicion de conjonctivite à Chlamydia, envoi BIOMNIS. Prélèvement impérativement réalisé après lavage de l œil avec du sérum physiologique stérile si de la fluorescéine ou de l oxybuprocaine ont été utilisées pour l examen. En cas de diagnostic par amplification génétique, il faut porter des gants sans talc. Il est réalisé par grattage conjonctival par 4 aller / retour (paupière inférieure et supérieure après retournement), recueillir le maximum de secrétions. Kit recherche Chlamydiae spécifique (kit à disposition) T réfrigérée dans milieu de spécifique fourni Envoi laboratoire spécialisé. Page 9 sur 14
Technique classique au dispositif à ailettes : Retirer les capes de protection repositionnables des flacons Hémoculture Code HEMO Noter les renseignements nécessaires sur la Fiche de prélèvement ou de transmission: l heure du prélèvement, température du patient au moment du prélèvement ainsi que le traitement éventuel (antibiotique). Prendre 2 flacons au moins à chaque ponction: Réaliser le prélèvement de préférence lors d'un pic fébrile, ou pendant des frissons à l aide du dispositif à ailettes après une désinfection soignée des mains, du site et du bouchon. Désinfecter les bouchons ainsi que la peau du malade avec un produit approprié (Il est recommandé d utiliser des antiseptiques alcooliques). Ne plus palper la veine après cette étape Prélever la veine avec l aiguille à ailettes. Remplir les flacons 10 ml dans chaque flacon A la fin du prélèvement, pendant le temps de contention, désinfecter à nouveau les bouchons Homogénéiser le flacon par 2 ou 3 retournements. Identifier correctement l ensemble des flacons et noter dessus l heure. 2 flacons spéciaux : - 10 ml de sang dans chaque flacon T environ 35 C (le plus rapidement possible) En attendant laisser les flacons à (ne surtout pas les positionner à +4 ) Les flacons sont incubés dès que possible à environ 35 C. Page 10 sur 14
Recherche de BMR : bactéries multirésistantes code : RBMR Prélèvements de dépistage ou portage : Sites de Prélèvements: Nasal : nage nasal avec 1 seul écouvillon pour les 2 cotés Rectal : nage de la marge anale afin de récupérer sur l écouvillon des matières fécales visibles à l œil nu. (Ce prélèvement peut être remplacé par un prélèvement de selles) Liste des BMR : 1 s avec milieu de 1 s avec milieu de ou 1 Flacon stérile 60 ml (Quantité : équivalent d une noix) T AMBIANTE 20 C de : < 2h de : 48h SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline Entérobactéries avec BLSE Pseudomonas aeruginosa Résistant à la ceftazidine (PARC) T +4 C : < 12 heures maxi Si matières fécales Acinetobacter baumannii multirésistant aux B Lactamines (ABMR) Enterocoque Résistant à la vancomycine (ERV) Entérobactéries Acinétobacter, Pseudomonas producteurs de carbapénémases. Page 11 sur 14
4.3. Déroulement du prélèvement pour une recherche de champignons Chez le sujet immunocompétent, les lésions peuvent se situer : Sur la peau glabre : herpès circiné, dermatose dyschromique Dans les plis : atteinte des grands plis (plis inguino - crural, inter- fessier, sous-mammaire, abdominal) ou des petits plis (lésions interdigitales et inter-orteils). Sur les ongles (onyxis ou périonyxis) Sur le cuir chevelu et les zones pileuses : teignes tondantes ou suppurées, favus, folliculite, dermite séborrhéiques, piédra. Dans d autres sites : lésions nodulaires, papuleuses, verruqueuses et lésions tumorales Chez le sujet immunodéprimé : Mêmes lésions de la peau et des phanères que chez les sujets immunocompétents La dissémination cutanée d une mycose systémique : cryptococcose, mycose d importation, par exemple pour les prélèvements Dans tous les cas, les prélèvements doivent s accompagner d un interrogatoire détaillé : remplir la fiche «Renseignements : prélèvements mycologiques» Il faut s assurer que le patient n est pas sous traitement antifongique local ou général. Si c est le cas, il faut arrêter le traitement et attendre au moins (selon le cahier Bioforma «les dermatophytes») : 15 jours avant d effectuer 1 prélèvement cutané ou de cheveux 2 mois pour 1 prélèvement unguéal Page 12 sur 14
NATURE DU PRELEVEMENT CONDITIONS DE REALISATION MATERIEL Lésions de la peau glabre code : MYCO code : PYTIR Lésions cutanées : elles seront grattées avec une curette, un grattoir ou un scalpel mousse en périphérie de la lésion (sur le bourrelet inflammatoire) sur laquelle on appliquera ensuite un écouvillon préalablement humidifié avec de l eau distillées.. Recherche de Pityriasis Versicolor Réaliser un prélèvement à la cellophane adhésive transparente pour la mise en évidence rapide de Pityriasis versicolor. Cette technique n est réalisable ni sur les régions pileuses ni sur les lésions inflammatoires ou suintantes. Curette de Brocq Grattoir de Vidal ou vaccinostyle stérile Lésions des plis code : MYCO Lésions unguéales code : MYCO En l absence de recherche concomitante de bactéries, les lésions non inflammatoires sont désinfectées à l alcool à 70 C pour éviter le développement de la flore bactérienne en culture Selon l aspect des lésions : gratter à la curette ou au scalpel les squames en bordure de la lésion (lésion sèche et squameuse), frotter les sérosités successivement à l aide de 2 ou 3 écouvillons (lésion macérée et suintante) Il est également possible de percer les vésicules puis de prélever la sérosité à l écouvillon (lésion vésiculeuse) Faire réaliser un lavage des mains ou des pieds au savon suivi d un rinçage à l eau et d un séchage à l air. Onyxis : dans les lésions distales ou latéro-distales, la périphérie de l ongle sera coupée à la pince ou aux ciseaux, et éliminée, puis on prélèvera avec une curette ou un vaccinostyle la zone unguéale pathologique, à la lisière de la partie saine et de la partie malade (où le dermatophyte est le plus actif). Le lit de l ongle sera alors raclé pour recueillir la poudre En cas de leuconychie, on grattera l ongle à sa surface. Prélever le pus de périonyxis éventuel en pressant la lésion (écouvillon) Scalpel des ciseaux Pince à épiler 1 ou 2 s secs stériles Lampe de Wood si possible Page 13 sur 14
Lésions du cuir chevelu et des zones pileuses code : MYCO Teignes : on prélèvera dans la zone d alopécie les squames, les cheveux cassés et les croûtes avec une curette et une pince à épiler. Un écouvillon préalablement humidifié avec de l eau distillée stérile sera ensuite appliqué sur la plaque d alopécie. Folliculite et sycosis : les poils et les duvets seront prélevés à la pince à épiler, puis un écouvillon préalablement humidifié sera appliqué sur les lésions suintantes. Autres code : MYCO Lésions papuleuses, verruqueuses : le prélèvement s effectue par écouvillonnage Lésions d aspect tumoral : dans le cas de lésions d aspect tumorale fistulisées, prélever les grains ou le pus. En l absence de fistule, gratter les squames Les squames et les cheveux se conservent plusieurs jours 4.4. Déroulement des autres prélèvements Recherche de gale (code : GALE) Au niveau de la peau, au point de démangeaison, rechercher un point noir (Espaces inter- digitaux mains, sillons +++, lésions superficielles) Prélever à l aide d un vaccinostyle des squames s il y en a. Il est possible d utiliser la technique de la cellophane adhésive sur les points de démangeaison. Recherche de Demodex (code : DEMOD) pour le prélèvement Avant tout traitement Réalisation du prélèvement Au niveau de la paupière Le prélèvement consiste à arracher des cils à la pince à épiler, 8 à 10 cils par œil, en prenant soin de faire une bonne répartition des cils prélevés le long des paupières supérieures et inférieures. Déposer ces cils dans un récipient stérile ou boite de Pétri. Page 14 sur 14