CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
Tranchant J., 1995, Manuel pratique de chromatographie en phase gazeuse, Masson, Paris, 700 pages. Grob K., 1986, Classical split and splitless injection in capillary GC, Huethig, Heidelberg, 324 pages
Introduction Chromatographie sur colonne de silice Chromatographie sur papier 1940 Chromatographie sur plaque 1950 Chromatographie d exclusion 1960 Chromatographie en phase gazeuse 1960 Chromatographie liquide haute pression 1970 Les points communs : une phase fixe une phase mobile
Introduction Chromatographie en phase gazeuse - 1941 : l idée - 1952 : premiers résultats - 1955 : 40 publications - 1966 : 10 000 publications
Principe
Grandeurs chromatographiques tr t r l σ Injection Air (méthane) ω
Grandeurs chromatographiques Temps de rétention réduit Volume de rétention : Vr = tr x D Volume de rétention Absolu, Spécifique
Grandeurs chromatographiques Temps de rétention Indépendant, dans la limite des concentrations faibles - de la quantité injectée - de la nature et abondance des autres constituants Dépendant - du couple composé-phase - du volume mort - du débit de gaz - de la masse de phase stationnaire - de la température
Grandeurs chromatographiques Indices de Kovats i 700 800 900 1000 d La position du composé n est pas donné en temps ou distance (d), mais par rapport aux 2 hydrocarbures qui l entourent (i)
Grandeurs chromatographiques Indices de Kovats 700 800 100 x 900 1000 t T X = t 100 T X = t.100/t i = 800+(t.100/T )
Grandeurs chromatographiques Indices de Kovats si : Chromatographie isotherme et isobare, [ t'rpic - t'rhc(n) ] 100 log log i pic =i hc(n) + log t'rhc(n + 1) - log t'r hc(n) t r : temps de rétention réduit
Grandeurs chromatographiques Indices linéaires de rétention si : - Programmation linéaire de la température du four - vitesse du gaz vecteur proche de l optimum, i pic =i hc(n) + 100 tr [ pic hc(n) ] tr hc(n + 1) - tr - tr hc(n) Mais il faut : Gradient t. Lcolonne. Ephase Colonne. VitesseGaz = cst
Grandeurs chromatographiques tr t r l σ Injection Air (méthane) ω
Grandeurs chromatographiques Efficacité Nombre de plateau théorique : N = temps de rétention σ 2 Si le pic est gaussien : N = 5,54 temps de rétention Largeur pic à mi - hauteur 2 Hauteur équivalente à un plateau théorique : Hept = longueur de colonne/n
Grandeurs chromatographiques Efficacité Trennzahl, ou SN (separation number) :
Grandeurs chromatographiques Efficacité Influence du type et de la vitesse du gaz vecteur Courbe de Van Deemter
Colonne Open tubular column W.C.O.T. C.O.T. S.C.O.T. (à support imprégné) P.L.O.T. ( à couche poreuse) Capillaire remplie Micropacked
Colonne Propriétés de la silice : - Souplesse - Poli parfait - Inertie chimique - Groupements silanol en surface modifiables - Prix relativement élevé - Revêtement polyimide limité à 370 C - Diamètre et longueur imposés
Colonne p = r 2 /8 (Loi de Darcy) Perméabilité : décrit la facilité à laquelle le gaz traverse la colonne. Unité=cm 2 Colonne remplie: 2 m Colonne capillaire: 30 m Perméabilité Pression gaz 0,1 10-6 cm 2 2 bar 20 10-6 cm 2 0,4 bar
Colonne Perméabilité, conséquence en chromatographie capillaire : - Peu de décompression le long de la colonne - Vitesse du gaz optimum tout le long de la colonne - Vitesse du gaz très rapide Analyse courte Composés peu volatils seront élués plus facilement Chauffage modéré de la colonne
Colonne Rapport de phase β : Volume phase gaz Volume de phase liquide Colonne remplie : 20 Colonne capillaire : 100-1000 En capillaire : - Analyse plus rapide - Faible quantité injectée sinon saturation
Colonne Tester une colonne : mélange de Grob Grob K., Grob G. et K. Grob., 1978, "Comprehensive, standartized quality test for glass capillary columns", Journal of Chromatography, Vol: 156, p. 1-20.
Ordre de sortie des composés du mélange de Grob sur quelques phases chromatographiques
Phase Propriétés - Inertie chimique - Affinité différente pour les composés à séparer - Limites inférieure et supérieure de température - En film stable, fin et régulier
Phase Polysiloxanes : -Si-O-Si-O-Si-O-Si-O- 100% méthyl OV1, SE30, DB1 5% phényl OV5, SE52, DB5 Apolaire 20 /250-60 /325 Apolaire 50 /230-60 /325 5% phényl 1% vinyl SE54 Apolaire 50 /220 7% phényl 7% Cyanoprop. OV1701, DB1701 Intermed. 20 /275-20 /260
Phase Polyethyleneglycol: HO-CH 2 -CH 2 -O-CH 2 -CH 2 -O-... Carboxax 20M Carboxax 20M + acide 2- nitrotéréphtalique C20M, Superox, DBwax SP1000, FFAP, DBFFAP Polaire 20 /250 40 /225 Polaire 50 /250 40 /250
Phase Phase chirale : Importance en biologie, herbicides, pesticides, arômes Comportant souvent des cyclodextrines perméthylées ou persylilées Parfois en mélange ou greffée avec des polysiloxanes (OV1701)
Phase Greffage (bounded phase) : -Si-O-Si-O-Si-O-Si-O-H H-O
Réticulation (crosslinked phase) : CH 3 CH 3 CH 3 -Si-O CH 3 Phase -Si-O-Si-O-Si-O-Si-O- -Si-O-Si-O-Si-O-Si-O- CH 3 CH 3
Injection Le problème de l injection : - Vaporiser l échantillon, donc chauffer - Dans un volume suffisamment grand 0.5 ml, pour ne pas «retro-polluer» le tube d arrivée du gaz vecteur - Le transporter à l entrée de la colonne avec un débit faible, 2 ml/min - Temps de dépôt sur la colonne 15 secondes - Déposer une faible quantité sur la colonne pour éviter la saturation de la phase - Diluer l échantillon
Injection Injection split : Gaz vecteur Split de 50 ml/min Théoriquement 0.6 secondes pour transporter l échantillon Colonne 2 ml/min
Injection Injection split : - Pics fins, bien résolus, de faible surface mais de grande hauteur Largeur pic en secondes : 0.75 2.4 5 20 débit vers le split, ml/min : 70 20 8 0
Injection Injection split : Echantillon liquide A demi évaporé Haut point de fusion Composés évaporés Présence possible d aérosol ou de gouttelettes liquides de composés à haut point d ébullition!
Injection Injection split : - Les composés évaporés se répartiront entre split et colonne en fonction du débit vers le split et vers la colonne - Les composés liquides se répartiront en fonction de la surface de l entrée de la colonne et de la surface du fond de l injecteur Discrimination entre composés à haut et bas point de fusion Analyse quantitative peu fiable Précaution : - Chauffer suffisamment, - Distance suffisante entre aiguille et colonne pour évaporation complète - Insert avec chicane, laine de verre, etc
Injection Injection splitless : Injection Transfert Purge Temps de transfert vers la colonne trop long Effectuer en tête de colonne un piégeage à froid ou l effet solvant
Injection Injection splitless : effet solvant
Injection Injection splitless : effet solvant Plusieurs paramètres influenceront la qualité de l effet : - Durée de fermeture du split - Débit de gaz dans la colonne - Polarité et point ébullition du solvant - Volume d échantillon liquide injecté
Injection Mode d utilisation de la seringue : Aiguille froide Aiguille chaude
Injection Injection on-column : Aiguille L échantillon est déposé liquide dans la colonne Colonne
Injection Comparaison des 3 types d injection Split Splitless On column - Supporte impuretés peu volatils - Supporte impuretés peu volatils - Quantification fiable - Evite les dégradations thermiques -Echantillon concentré - Risque de discrimination composés lourds/légers - Pgm température du four obligatoire - Temps de rétention peu reproductibles en début de chromato. - Ne supporte pas les impuretés peu volatils - Pgm température du four obligatoire
Détection Détecteur répondant en concentration de soluté : l influence du débit du gaz vecteur est nulle (catharomètre). Si le débit double, la hauteur du pic ne change pas - Mais sa largeur diminue de moitié - Donc sa surface diminue de moitié Détecteur répondant en débit de soluté : la réponse est proportionnelle au débit du gaz vecteur (FID). Si le débit double, la hauteur du pic est doublée - Mais sa largeur diminue de moitié - Donc sa surface ne change pas
Détection Détecteur à ionisation de flamme (FID) Electrode : - de collecte -de polarisation Electromètre Enregistreur Hydrogène Gaz vecteur
Détection Détecteur à ionisation de flamme Cracking dans la zone centrale : CH, CH 2, CH 3 Oxydation en périphérie : CH + O = CHO + + e - Réaction avec l eau : CHO + + H2O = H3O + + CO
Détection Bruit de fond : détecteur en équilibre Perturbations dues : - aux irrégularités du gaz vecteur, - aux parasites électroniques - aux molécules de phases dégradées -etc Bruit de fond Bruit de fond + autre perturbation
Détection Sensibilité : Rapport- signal électrique/concentration ou - signal électrique/débit massique Quantité minimale détectable : Quantité injectée qui donne un signal double du bruit de fond, dans des conditions définies - FID : 2-4 pg carbone dans conditions optimum
Détection Lorsque des quantités croissantes sont injectées, au delà d un plafond, la réponse du détecteur n est plus linéaire. Réponse 10 10 7 11 = 10 4 10-11 10-9 10-7 10-5 Minimum détectable Quantité injectée
Détection Zone de linéarité : Domaine de concentration dans lequel la réponse du détecteur est proportionnelle à la concentration FID : 10 7
Détection Détecteurs universels : ionisation de flamme, catharomètre, Spectromètre (masse ou infra-rouge) Détecteurs spécifiques: capture d électron, thermoionique Détecteurs sélectifs :photomètrie de flamme, olfactomètre
Détection Olfactomètrie (sniffing) : montage chromatographique
Détection Olfactomètrie et détection F.I.D.
Détection Olfactomètrie : Comparaison d extraits de vin
Analyse quantitative La relation fondamentale :? Surface du pic = k. Quantité injectée k coefficient de réponse est : - Dépendant du composé - Dépendant du détecteur - Dépendant du système chromatographique
Analyse quantitative Normalisation interne : Surface : 140 40 220 Total : 400 En % : 35 10 55
Analyse quantitative Normalisation interne : - Le résultat n est pas en poids/poids - Si un composé augmente, les autres diminuent -Tous les composés doivent être élués de la colonne - Utilisé pour quantifier les proportions des composés d une même famille (acides gras), pour suivre l évolution d une réaction... - Le volume injecté n a aucune importance
Analyse quantitative Normalisation interne avec facteur de réponse: 1 2 Référence Masse mg : 5 5 7 Surface : 340 285 440 D après la référence, 1 unité de surface = 7/440 mg Donc le pic 2 correspond à 7/440 x 285 = 4,53 mg Pour retrouver 5 mg, il faut appliquer un facteur de réponse qui est : k = 5/4,53 = 1,1
Analyse quantitative Normalisation interne avec facteur de réponse: Surface : 140 40 220 Fact. Rép. k : 0.9 1,1 1 Surface corrigé : 126 44 220 Total = 390 En % : 32 11 57
Analyse quantitative Normalisation interne avec facteur de réponse: - Le résultat n est pas en poids/poids - Si un composé augmente, les autres diminuent - Tous les composés doivent être élués de la colonne - Utilisé pour quantifier les proportions des composés d une même famille (acides gras), pour suivre l évolution d une réaction - Le volume injecté n a aucune importance - k, coefficient de réponse, corrige les distorsions entre composés dues à l appareillage mais seulement par rapport à un composé référence
Analyse quantitative Etalonnage externe : Etablissement d une droite d étalonnage Surface S = k Q Quantité
Analyse quantitative Etalonnage externe : - Très dépendant du volume injecté - Ne tient pas compte de la préparation de l échantillon - Résultats en poids/poids - Résultat pour un composé indépendant des autres composés
Analyse quantitative Etalonnage interne : 1 3 Etalon 2 Choix de l étalon : - Etre élué seul - Etre proche chimiquement des composés à doser - Etre inerte
Analyse quantitative Etalonnage interne : 1 3 2 Masse mg : 6 Surface : 140 40 220 190 1 unité de surface correspond à 6/190 mg Le pic 3 correspond donc à 6/190 x 220 = 6,9 mg
Analyse quantitative Etalonnage interne : - Suppose que, lors de la préparation de l échantillon, l étalon réagit de la même façon que les composés à doser - Résultats en poids/poids, exprimés en équivalent étalon/poids d échantillon - Peut être corrigé par un facteur de réponse - Indépendant du volume injecté - Résultat pour un composé indépendant des autres composés - l étalon informe de l état du système chromatographique
Analyse quantitative Ajouts dosés : 1 3 Etalon 2 L augmentation de surface du pic 2 est due au rajout de ce composé
Analyse quantitative Ajout dosés : SurfaceCom posé SurfaceEta lon QuantitéComposé QuantitéEtalon
Analyse quantitative Ajout dosés : - Relativement long à mettre en œuvre - Suppose que le composé rajouté réagit comme le (même) composé à l origine dans le milieu à doser - Indépendant du volume injecté - Résultats en poids/poids
Analyse quantitative Isotope stable : Plutôt que le composé lui-même, un isotope stable du composé (contenant un atome plus lourd : D, C 14 ) est ajouté - Suppose que le composé isotope rajouté réagit comme le composé à l origine dans le milieu à doser - Suppose un spectre de masse - Indépendant du volume injecté - Résultats en poids/poids
Analyse quantitative Traitement du signal : Détection de début et fin de pic Localisation de la ligne de base Mode d intégration Conversion analogique-digitale Identification du composé Calcul avec étalon Edition de rapport
Fast chromatography
GC2D et GCxGC Colonne 1 Colonne 2
GC2D et GCxGC CO2 1 er injection CO2 CO2 Etc. Colonne 1 Colonne 2
GC2D et GCxGC Rétention, minutes, colonne 1
Saturés Mono-aromatiques Rétention, minutes, colonne 1 Di-aromatiques GC2D et GCxGC Rétention, secondes, colonne 2
Conclusion - Pouvoir de séparation très important - Faible quantité d échantillon - Applicable à de nombreux composés - Technique simple et fiable - Résultats qualitatifs et quantitatifs précis, d interprétation simple - Equipement peu coûteux, à durée de vie longue - Automatisation possible