Place des nouvelles techniques dans l'optimisation diagnostique et thérapeutique des infections nosocomiales en réanimation Laurence ARMAND Service de bactériologie CHU Bichat-Claude Bernard Schéma classique pour le diagnostic microbiologique J0 J1 J2 Examen direct après coloration de GRAM Morphologie : cocci, bacille Regroupement GRAM + ou GRAM- Culture pour obtenir des colonies isolées : De 18 h à 48h (ou plus) Identification phénotypique Antibiogramme AMX TIC PIP CF CAZ AMC CTX MA MOX ATM IPM FOX FOS TET TZP CXM ATBiothérapie probabiliste ATBiothérapie probabiliste corrigée par culture ATBiothérapie adaptée 1
Qu y a-t-il de mieux à ce jour? Innovation pour l identification La spectrométrie de masse : Maldi-Tof J0 J1 J2 Examen direct après coloration de GRAM Morphologie : cocci, bacille Regroupement GRAM + ou GRAM- Culture pour obtenir des colonies isolées : De 18h à 48h (ou plus) Identification Par spectrométrie de masse Antibiogramme AMX TIC PIP CF CAZ AMC CTX MA MOX ATM IPM FOX FOS TET TZP CXM ATBiothérapie probabiliste ATBiothérapie probabiliste corrigée par Identification ATBiothérapie adaptée 2
Une innovation qui : - Réduit le délai de rendu de l identification à partir de la culture de 18 à 24h à moins de 10 minutes - Démarche universelle quelque soit l espèce bactérienne ou fongique MALDI-TOF Spectrométrie de Masse : Principe Acceleration Drift + + + + + + Electrodes Laser Desorption/Ionization Detector Time-of-Flight Intensity Modified from: Lottspeich, Zorbas, eds Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, 1998 m/z 3
Applicabilité à tous les microorganismes cultivables = identification universelle 2500 2000 Escherichia coli 1500 1000 500 Intens. [a.u.] 8000 0 Bacillus subtilis 6000 4000 2000 0 1.0 0.8 Candida albicans 0.6 0.4 0.2 Intens. [a.u.] 0.0 3000 Aspergillus fumigatus 2000 1000 0 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z Workflow très simple, résultat automatisé Identification donnée Range Description Symbols Color 2.300... 3.000 highly probable species identification ( +++ ) green 2.000... 2.299 secure genus identification, probable species identification ( ++ ) green 1.700... 1.999 probable genus identification ( + ) yellow 0.000... 1.699 no reliable identification ( - ) red Comparaison avec base de données Obtention d un profil Dépôt d une colonie sur une des positions de la cible Microorganisme inconnu? 4
Avantages / limites de l identification par spectromètrie de masse Avantages : Cout élevé de l automate mais faible de l identification (vite rentabilisé) Simplicité d utilisation Rapidité de rendu impact sur la thérapeutique Limites : Mauvaise identification des streptocoques alphahémolytiques : à ce jour, pas de différence entre Streptococcus pneumoniae et autres Streptocoques «oraux» Ne sait pas différencier Shigella spp et E. coli Application de l identification par spectrométrie pour les hémocultures positives Prétraitement 20 à 100 min Spectre Hémoculture positive Plaque MALDI-TOF Identification 5
Etudes des performances et impact de la spectrométrie sur hémocultures Identification : 61% à 97% Meilleure pour les bactéries à Gram négatifs que pour les Gram positifs Ferroni et al, J Clin Microbiol. 2010; Prod'hom et al, J Clin Microbiol. 2010 Stevenson et al, J Clin Microbiol. 2010; Christner et al, J Clin Microbiol. 2010 Ferreira et al, Clin Microbiol Infect. 2011; La Scola et al, PLoS One. 2009 2012 + 11% appropriate - 10% inappropriate 6
Huang et all, CID 2014 501 patients with bacteriemia or candidemia n = 256 n = 245 Huang et al, CID 2014 7
Tests phénotypiques prédictifs de résistance Test colorimétrique : LACTA test (Biorad) Prédiction de la résistance aux C3G Principe : clivage d'une céphalosporine chromogénique (jaune rouge) en présence d enzymes de type BLSE ou AmpC acquises Test réalisable sur colonies bactériennes : - sensibilité de 96% pour E. coli et K. pneumoniae -Mais, sens de 67.4% chez Eb. du groupe 3 hyperproductrice d AmpC Test réalisable sur prélèvement : - Culots urinaires avec Eb productrices de BLSE (Sens 94% Spé 100%) - Hémocultures positives à BGN (Sens 97% Spé 100%) Mauvaise prédiction de la résistance aux C3G chez Eb gr 3 déréprimé Renvoisé et al, J. Clin Microb., 2013 Gallah et al, J. Clin. Microb, 2014 Amzalag et al, RICAI 2014 Waleski et al, RICAI 2014 Tests phénotypiques prédictifs de résistance Test : Clearview PLP2a (Alere) Prédiction de la résistance à la méticilline chez Staphylococcus Principe : test immunochromatographique recherchant la présence de la PLP2a, témoin de la résistance à la méticilline Test réalisable sur colonies bactériennes : - sensibilité de 96.6% et spécificité de 100% Test réalisable sur hémocultures positives : - sensibilité de 94.4% et spécificité de 100% Nonhoff et al, J. Clin Microb., 2012 Shim et al, Diag Microb Inf Dis., 2010 8
Antibiogrammes réalisés directement sur prélèvements cliniques 88 LBA ou PDP - prélevés chez 66 patients suspects de PAVM - présentant un BGN à l examen direct - 3 services de réanimation Réalisation d un antibiogramme (méthode des disques) directement à partir du prélèvement avec standardisation de l inoculum selon l examen direct Le Dorze et al, soumis Clin Micr Inf Performance par comparaison à la méthode conventionnelle : Le Dorze et al, soumis Clin Micr Inf 9
Changements potentiels d antibiothérapie à J1 si l antibiogramme direct avait été rendu aux cliniciens 41,2% Principe: Rechercher la présence de gènes témoins de la présence de bactéries ou de certains gènes de résistance ou de virulence Techniques : Tests génotypiques Plusieurs techniques d amplifications (PCR classique ou en temps réel) ou de révélations (hybridation, micro-arrays, microfluidique ) En constante évolution 10
Recherche de la résistance à la méticilline dans une hémoculture positive à cocci Gram positif en amas par PCR temps réel automatisée : système GenExpert La cartouche 11 chambres réactionnelles Tube PCR S. aureus + gène meca (dès hémocultures +) Résultats rapides : total ~ 1h Facilité de mise en oeuvre Enlevez la cartouche et les réactifs de leur emballage Transférer une goutte de l hémoculture positive dans le flacon d élution Reboucher le flacon et le vortexer pendant 10 secondes Ajoutez la totalité du contenu du flacon dans la chambre de la cartouche marquée S Fermez le couvercle de la cartouche Insérer la cartouche dans l automate 11
S. aureus + gène meca (souches/hémocultures+) M. tuberculosis + résistance rifampicine C. difficile + toxine (selles) ERV (vana/vanb) Carbapénémases Très bonnes performances analytiques Facilité de mise en oeuvre + + + Rendu des résultats en 45 min à 2h Inconvénients : - Prix élevé de l automate (mise à disposition ) - Prix consommables ~ 40 Euros/test - Études médico-économiques nécessaires Impact du Dg rapide par PCR de SARM ou SASM dans les hémocultures Juin 2012 151 hémocultures positives à cocci Gram positif en amas Après le résultat du Gram de l hémoc : - 100% des patients avec SASM ont eu un traitement adéquat - 46% des patients avec un SARM ont eu un traitement adéquat Dès le résultat du Genexpert, au total : - 26 % des patients ont eu un switch d antibiothérapie - 16% des patients (tous Staph coag neg) ont eu un arrêt d antibiotique immédiat -Economie de 16 637 $ (151 patients sur 7 mois) 12
Impact du Dg rapide par PCR de SARM ou SASM dans les hémocultures CID 2010-156 Patients inclus avec hémoculture à S. aureus - 4 mois sans PCR (sept-dec 2008, n=74) - 4 mois avec Genexpert (mars-juin 2009, n=82) Switch pour 27 pts (33%) avec SASM et 4 (5%) avec SARM Switch 1,7 jours plus tôt en moyenne dans groupe PCR que non PCR Diminution durée d hospitalisation de 6,2 jours dans le groupe PCR (21.5 vs 15.3 p=0.07) Pas d impact sur la mortalité Economies 21 387 $ Perspectives (Ce qui va arriver / n arrivera pas?) 13
Les méthodes génotypiques pour la détection de pathogènes dans les sepsis 2 types de techniques : Celles visant à rechercher les germes directement dans le sang du patient avant culture Ex : Septifast (Lightcycler SeptiFast Test, Roche Dg) PCR en temps réel + sondes hybridant 25 pathogènes Chang et al, Plos One., 2013 Septifast Temps de rendu 6-8h 2 méta-analyses : Sens : 0,75 (95% CI : 0,65 083) 0,68 (95 % CI 0.63 0.73) Spé : 0,92 (95%CI: 0,90 0,95) 0,86 (95 % CI 0.84 0.89 positive likelihood ratio (10,10) moderate negative LR (0,27) Très mauvaise VPN Dark et al, Int Care Med., 2014 Chang et al, Plos One., 2013 14
Les méthodes génotypiques pour la détection de pathogènes dans les sepsis 2 types de techniques : Celles visant à identifier le germe (+/- résistances) après hémoculture positives Ex : Prove It Sepsis (Mobidiag) Détection de 28 pathogènes + gène meca 1807 of 2107 (86%) hémocultures contenant un pathogène présent dans le kit Se 94 7% (95% CI 93 6 95 7) Spé 98 8% (95% CI 98 1 99 2) Délais de rendu : différence de 18h par rapport à la méthode de référence Tissarit et al, Lancet, 2010 Lisenfeld et al, Eur. J. Micr. and Imm., 2014 15
Les méthodes génotypiques pour la détection de pathogènes dans les PAVM Pas grand-chose Inconvénients : 13 pathogènes identifiés dans les PAVM - Rendu des résultats en 4 à 6h 24 déterminants de - Manipulations encore lourdes résistances - Pas d exhaustivité des (Pénicillinase, résistances BLSE, carbapénémase, gène mec) - Prix élevé de l automate et des tests ++++ 16
Spectrométrie de masse et détection de la résistance Positive blood culture 1 ml culture Modified Sepsityper protocol 1µl-loop filled with bacteria Incubation 1-2 h, 37 C Resuspension in antibiotic Solution centrifugation supernatant Culture plate Intens. [a.u.] 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 6000 4000 2000 Target preparation 3h Data output 0 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 m/z Spectra analysis MALDI Biotyper Spectrométrie de masse et détection de la résistance Méropénème Méropénème + K. pneumoniae sauvage Méropénème +A. baumannii NDM-1 Méropénème + K. pneumoniae KPC-2 34 Hrabak 17
La détection des micro-organismes Spectrométrie de masse : révolution pour l identification bactérienne Méthodes génotypiques : - longues et couteuses, - difficiles à intégrer dans le workflow d un laboratoire de bactériologie - Impact à évaluer Plutôt réfléchir sur des ré-organisations dans les laboratoires avec aide de spectromètre de masse La détection des résistances A l heure actuelle, ou dans un avenir proche la détection des résistances bactériennes est meilleure par les techniques phénotypiques que génotypiques Seuls les dépistages de gènes acquis (meca, van) sont réalisés en pratique courante BLSE : CTX-M facile mais TEM et SHV moins Aucune technique n envisage la détection de E. cloacae déréprimé ou P. aeruginosa muté sur la porine D2 Les techniques moléculaires pour la détection de la résistance s ajoutent aux techniques classiques, mais ne les remplacent pas. 18
Merci de votre attention 37 Perspective lointaine? Diagnostic microbiologique par séquençage haut débit? Lecture en parallèle de plusieurs millions de séquences d ADN ou d ARN Analyse bio-informatique (reconstruction et analyse de génomes entiers à partir des fragments séquencés) Human genome sequencing project 1990-2003 3 milliards $ Nouvelle génération de séquenceur 2012 1 génome 2 heures 1000 $ 19
Perspective lointaine? Diagnostic microbiologique par séquençage haut débit? Fev 2014 Lecture en parallèle de plusieurs millions de séquences d ADN ou d ARN Analyse bio-informatique (reconstruction et analyse de génomes entiers à partir des fragments séquencés) Human genome sequencing project 1990 2003 3 milliards $ Nouvelle génération de séquenceur 2012 1 génome 2 heures 1000 $ Antibiogrammes réalisés directement sur prélèvements cliniques - Etudes réalisées sur prélèvements respiratoires (LBA, PDP, A. Bronchiques) chez des patients suspects de PAVM - Sensibilité données à quelques antibiotiques par l intermédiaire des bandelettes E-test (CMI) - Gélose pour antibiogramme ensemencée directement avec le prélèvement clinique puis dépôt de E-test -Très bonnes performances Taux de concordances avec la méthode De référence : de 82.5 à 96.2% Erreurs majeures de 1,5 à 1,9% Boyer et al, Diagn Microbiol Infect Dis, 2012 Kontopidou et al, Int J Antimicrob Agents, 2011 Cercenado et al, Diagn Microbiol Infect Dis,2007 20
250 Aspirations trachéales chez 250 patients avec une PAVM avérée - 167 groupe E-test (oxacilline, pip/tazo, céfepime, imipénème, cipro, amikacine) - 83 groupe contrôle 21