APOPTOSE. GB3 Macia Eric : 15 Mars 2010

APOPTOSE? GB3 Macia Eric : 15 Mars 2010

PLAN du cours APOPTOSE (1) I. Présentation du cours : Notions à retirer, Plan du cours II. Introduction 1/ Historique 2/ Comparaison de 2 formes de mort cellulaire APOPTOSE/NECROSE a/ Critères morphologiques b/ Significations biologiques c/ Critères biochimiques III. Physiologie de l apoptose IV. Génétique de l apoptose (C.Elegans) Familles de protéines V. Les différentes voies d activation de l apoptose 1/ Voie Extrinsèque a/ Classification des récepteurs de mort cellulaire b/ Mécanismes d activation c/ Récepteurs Leurres d/ Fonctions biologiques

PLAN du cours APOPTOSE (2) 2/ Voie Intrinsèque Mitochondriale a/ Les membres de la famille Bcl-2 - Classification - Mode d action - Fonctions biologiques b/ Perméabilité mitochondriale c/ Apoptosome : lien entre la mitochondrie et l activation des caspases - La protéine adaptatrice APAF-1 - Formation de l apoptosome - Fonctions biologiques 3/ Voie Intrinsèque dépendante du RE VI. Les CASPASES : les protéases de l apoptose: 1/ Classification/Mode d action/fonction Physiologique 2/ Inhibition par les IAPs 3/ Substrats des caspases

PLAN du cours APOPTOSE (3) VII. Techniques de mise en évidence et de quantification de l apoptose - Activation des caspases - Substrats des caspases - Modifications mitochondriales - Modifications nucléaires - Modification de la membrane plasmique - Altération du métabolisme VIII. Conclusions

PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES RELATIVES A L APOPTOSE Aujourd hui environ 100 000 publications par an

II. INTRODUCTION Historique Apoptose/Nécrose

Une majorité des cellules produites au cours du développement est appelée à mourir De même un nombre important de cellules est renouvelé au cours de la vie adulte des organismes Chez l homme sur un total d environ 10 14 cellules environ 10 8 engagent un programme de mort cellulaire chaque jour (100 millions mais seulement 1/1 000 000)

HISTORIQUE Phénomène connu depuis plus de 150 ans 1842 Vogt reconnaît le phénomène, les cellules meurent de façon programmée au cours du développement de l amphibien 1951 Gluckman décrit la mort cellulaire au cours du développement dans plusieurs espèces 1965 Lochskin analyse la mort cellulaire au cours du développement larvaire. Il propose le terme Mort cellulaire programmée (MCP) 1972 Kerr, Wyllie et Curie définissent les critères morphologiques de la mort cellulaire en microscopie électronique. APOPTOSE 1986 Horvitz suggère que la MC au cours du développement du nématode C. Elegans, est génétiquement déterminée 1990 Caractérisation des premiers gènes impliqués dans la MCP

MORT CELLULAIRE PROGRAMMĒE et APOPTOSE Même si ces deux concepts sont contemporains (années 70), ils ne sont pas synonymes La MCP décrit une mort cellulaire qui se produit de manière programmée en lieu et temps au cours du développement L apoptose définit un tableau morphologique et biochimique stéréotypique d une forme particulière de mort cellulaire programmée Il existe d autres formes de mort cellulaire non apoptotique Nécrose, Autophagie, Paraptose

APOPTOSE ET NECROSE Caractéristiques morphologiques - Cellule non stimulée a Stimulus apoptotique * Rétrécissement cellulaire * Condensation de la chromatine * Intégrité mb et des organelles b c d e Corps apoptotiques Signaux de reconnaissance et Phagocytose des corps apoptotiques Gonflement cellulaire + organelles Marginalisation de la chromatine Lyse de la membrane plasmique et fonte des organelles

APOPTOSE ET NECROSE : Morphologie Apoptose d une cellule d hybridome B murin Nécrose spontanée d une cellule tumorale mastocytaire Corps apoptotiques phagocytés par un Macrophage intraépithélial

APOPTOSE ET NECROSE Signification physiologique APOPTOSE Affecte des cellules individuellement Stimuli physiologiques: Absence de facteur de croissance, cytokines ( TNFs récepteurs), ischémie, cellules infectées par un agent pathogène, cellules endommagées par les UV (ADN) NECROSE Affecte des groupes de cellules Stimuli non physiologiques: Stress métaboliques, poisons métaboliques, ischémie, rejet de greffe Stimuli non physiologiques: radiations, agents chimiothérapeuthiques, corticoïdes Phagocytose précoce Absence de réponse inflammatoire Phagocytose tardive Réponse inflammatoire sévère «ordonnée, propre» «désordonnée, inflammatoire»

APOPTOSE ET NECROSE Caractéristiques biochimiques APOPTOSE NECROSE Processus finement régulé Energie dépendante Perte des échanges ioniques Energie indépendante Dégradation internucléosomale de l ADN Relargage de facteurs mitochondriaux Cyt C, SMAC, ) Activation de protéases apoptogènes Caspases) Altération de la symétrie membrannaire Redistribution de la phosphatidylsérine Dégradation de l ADN aléatoire Production de ROS par la mitochondrie Relargage de facteurs mitochondriaux (Endo G, AIF ) Lyse des organelles Destruction de la membrane plasmique

III. Physiologie de l apoptose

Les Fonctions de l Apoptose Elimination des cellules inutiles et/ou dangereuses <-- régulé par l'apparition des hormones <-- autonome (mort par défaut)

Régulation de l'homéostasie tissulaire Prolifération, Apoptose et Homéostasie L ensemble des cellules différenciées peut reconstituer les 2/3 d un foie en 2 semaines En 8 ans, cette prolifération dépasserait la Taille de l Organisme Prolifération et Différenciation Normales Balance Apoptose/Prolifération Prolifération et Différenciation Excessives Balance Apoptose/Prolifération en Faveur de la Prolifération Prolifération et Différenciation Diminuées Balance Apoptose/Prolifération en Faveur de l Apoptose Le Ratio Apoptose/Prolifération est un contrôle important du Développement Cellulaire

Apoptose et Système Immunitaire Élimination des Thymocytes au cours de la sélection thymique Thymocytes Sélection négative/positive Thymus Pas de Récepteur à l Antigène Récepteur non Fonctionnel Reconnaissance du Soi 5% Survie 95% Apoptose Immunité T CD4/CD8

Développement du système nerveux Signal Extracellulaire Cellules cibles recevant le signal de Survie et se différenciant Cellules Produisant un Signal de Survie Différenciation Cellule Qui ne Recoit pas de Signal de Survie = Mort par Apoptose

Contrôle de la Glande Mammaire régulation hormonale lors de la grossesse Développement de la Glande Mammaire Hyperprolifération cellulaire et différenciation Lactation Involution de la Glande Mammaire APOPTOSE

IV. Génétique de l apoptose APOPTOSE? GENES

- Comprendre les règles que permettent l élaboration d un organisme multicellulaire et au fonctionnement du système nerveux. - Choix de C. elegans comme organisme modèle - Création des outils et cartes génétiques permettant d isoler les gènes impliqués dans différentes fonctions. - Retrace la succession de divisions qui conduisent un œuf fraîchement fécondé à un adulte de 959 cellules = lignage cellulaire - Mise en évidence des 131 cellules qui meurent invariablement au cours du développement normal. - Identifications des mutants ced-1 ced-2 et nuc-1 - Constitution d une carte ordonnées sous formes de cosmides - Nouvelles mutations affectant le déclenchement de la mort cellulaire programmée. - Cascade d événement conduisant à l apoptose. - Homologues fonctionnels chez les vertébrés.

CAENORABDITIS ELEGANS R Horvitz, J Sulston, S Brenner, Prix Nobel de Médecine 2002 Modèle unique d étude du développement Transparent Très petit nombre de cellules chez la larve : 1090 Le cycle de reproduction dure 3 jours La disposition et le rôle de chacune des cellules qui compose l organisme sont connus Produit 1090 cellules somatiques au cours du développement 131 cellules sont éliminées par apoptose au cours du développement L animal adulte compte donc 959 cellules O.1 mm

Identification de gènes impliqués dans l apoptose par mutagénèse chimique chez C. ELEGANS Horvitz (1992-93) identification de gènes de mort dans Caenorhabditis elegans Mutagénèse chimique chez les larves de C. Elegans Sélection de larves présentant des défauts d élimination des cellules au cours du développement Identification de 11 gènes impliqués dans l apoptose de C. ELEGANS Caenorhabditis elegans death = Ced Egg laying defective = Egl

La génétique de l Apoptose chez Caenorhabditis elegans Signal Suite à un stimulus de mort cellulaire, la protéine Egl-1 interagit avec Ced-9, permettant ainsi l'activation de la protéase Ced-3 Régulateur L'activation de Ced-3 par Ced-4 est inhibée par la protéine Ced-9 qui séquestre Ced-4 et/ou Ced-4/Ced-3 au niveau des membranes intracellulaires Activateur La protéine Ced-4 interagit avec Ced-3 et permet l'activation de Ced-3 Exécuteur la protéine Ced-3 est la protéine effectrice de l'apoptose

Effet des gènes isolés à partir de C. ELEGANS chez les mammifères L expression de CED3 ou de CED4 dans les cellules de mammifère est suffisante pour induire l apoptose. L expression de CED9 protège les cellules humaines de l apoptose. CED3 et CED4 sont des inducteurs de l apoptose alors que CED9 est protecteur contre l apoptose. CONCLUSION : Les mécanismes contrôlant la MCP sont conservés de Nématode à l Homme.

La génétique de l Apoptose Signal phase d induction ou d initiation ( Ceanorhabditis elegans ) BH3 Régulateur Bcl-2 Activateur APAF phase d exécution phase de dégradation Exécuteur Caspases Équivalents chez les mammifères

V. Les Différentes voies de l activation de l apoptose

Les voies d induction de l apoptose Il existe deux voies principales d induction de l apoptose : la voie des récepteurs de mort (ou voie extrinsèque) la voie mitochondriale (ou voie intrinsèque). Une troisième voie activée en réponse à un stress et faisant intervenir le réticulum endoplasmique (RE) a également été décrite.

Voie Extrinsèque des Récepteurs de mort «une famille hautement spécialisée»

Fas, Trail, TNF SIGNALISATION APOPTOSE

Récepteurs de la famille du TNF impliqués dans l apoptose L activation de la voie extrinsèque de l apoptose se fait en réponse à la fixation de ligands spécifiques de type cytokines sur des récepteurs de surface appelés récepteurs de mort. Ces récepteurs de mort appartiennent à la superfamille des récepteurs au tumor necrosis factor (TNF-R) et incluent des récepteurs tels que le récepteur Fas, les récepteurs au TNF (TNFR-1, TNFR-2) et les récepteurs au TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) DR-4 et DR-5 (Ashkenazi A 2002)

Les ligands Récepteurs de la famille du TNF impliqués dans l apoptose OPGL RANKL TRANCE TRAIL APO-2L TWEAK APO-3L CD95L TNF- LT / LT LIGHT RAN K OPG TRAIL-R3 DcR1 LIT TRID TRAIL-R4 DcR2 TRUND TRAIL-R1 DR4 APO-2 TRAIL-R2 DR5 KILLER TRICK2 DR6 DR3 APO-3 WSL TRAMP LARD APO-1 FAS CD95 TNF-R1 TNF-R2 TR6 DcR3 OPGL RANKL TRANCE TRAIL APO-2L TWEAK APO-3L CD95L TNF- LT / LT LIGHT RAN K OPG TRAIL-R3 DcR1 LIT TRID TRAIL-R4 DcR2 TRUND RAN K OPG TRAIL-R3 DcR1 LIT TRID TRAIL-R4 DcR2 TRUND TRAIL-R1 DR4 APO-2 TRAIL-R2 DR5 KILLER TRICK2 DR6 DR3 APO-3 WSL TRAMP LARD APO-1 FAS CD95 TNF-R1 TNF-R2 TR6 DcR3 Les ligands FasL/ Les récepteurs Les récepteurs OPGL RANKL TRANCE TRAIL APO-2L TWEAK APO-3L CD95L TNF- LT / LT LIGHT RAN K OPG TRAIL-R3 DcR1 LIT TRID TRAIL-R4 DcR2 TRUND TRAIL-R1 DR4 APO-2 TRAIL-R2 DR5 KILLER TRICK2 DR6 DR3 APO-3 WSL TRAMP LARD APO-1 FAS CD95 TNF-R1 TNF-R2 TR6 DcR3 OPGL RANKL TRANCE TRAIL APO-2L TWEAK APO-3L CD95L TNF- LT / LT LIGHT RAN K OPG TRAIL-R3 DcR1 LIT TRID TRAIL-R4 DcR2 TRUND RAN K OPG TRAIL-R3 DcR1 LIT TRID TRAIL-R4 DcR2 TRUND TRAIL-R1 DR4 APO-2 TRAIL-R2 DR5 KILLER TRICK2 DR6 DR3 APO-3 WSL TRAMP LARD APO-1 FAS CD95 TNF-R1 TNF-R2 TR6 DcR3 (D après Igney et al., 2002)

Activation des récepteurs Fas, DR4, DR5 et TNFR1 DD DD DED DED DD DD DD DED DED DD DED DD DED DD DD DD DD CARD DD DD CARD DD FasL Trail FAS/CD95 DR4 DR5 La fixation d un ligand sur un récepteur de mort conduit à la trimérisation du récepteur qui lui permet d être actif TNF TNFR1 Death Inducing Signaling Complex FADD Caspases 8 et 10 Caspases effectrices TRADD FADD Caspases 8 et 10 Caspases effectrices RAIDD Caspase 2 TRADD RIP TRAF2 NFkB JNK APOPTOSE APOPTOSE SURVIE

Modulation du ligand Trail par les récepteurs «leurres» DcR-1 et DcR-2 TRAIL/Apo2-L DcR1 DR4 et DR5 DcR2 FADD FADD Caspases 8 et 10 Caspases effectrices APOPTOSE

DED DED DED DED DED DED DED DED DED DED DED DED DED DD DD DD DD Modulation de l activation des recepteur de mort par FLIP FasL Trail FAS/CD95 DR4 DR5 FADD DD DD DD TRADD FADD DD DD DD TNF TNFR1 DDTRADD Caspases 8 et 10 FLIP Caspases 8 et 10 APOPTOSE Une isoforme de la caspase-8 appelée Flice-inhibitory protein (FLIP) contient 2 domaines DED mais pas de site catalytique. Elle agit en entrant en compétition avec les caspases-8 et -10 et en empêchant leur recrutement au niveau du DISC

Rôles physiologiques du couple Fas/FasL Le récepteur Fas est exprimé de manière ubiquitaire dans la plupart des tissus, mais avec une expression renforcée au niveau du thymus, du foie, des reins et du cœur. D un autre côté, FasL est principalement exprimé dans les lymphocytes T activés, les cellules NK (Natural Killer) et constitutivement exprimé au niveau de tissus constituant des sites immuns privilégiés, comme les yeux ou les testicules. Le système Fas/FasL joue un rôle prépondérant au cours de la réponse immune : 1. La délétion des lymphocytes T périphériques matures activés au cours d une réponse immunitaire. Ce processus est nommé AICD (Activated Induced Cell Death). 2. L élimination par les lymphocytes T cytotoxiques ou les cellules NK de cellules cibles infectées par un virus ou cancéreuses. Ceci en synergie avec le système Granzyme B/Perforine 3. La mort des cellules inflammatoires au niveau de sites immuns privilégiés (yeux testicules).

Physiopathologie des récepteurs de mort Le rôle physiologique de Fas/FasL a pu être élucidé grâce à l identification de mutations naturelles du récepteur ou de son ligand chez des souris ou des patients souffrant de syndromes auto-immuns : - Souris lpr (lymphoprolifération) - Souris gld (generalized lymphoproliferative disease) Fas FasL Perturbations du système immunitaire: - défaut d apoptose des lymphocytes, - lymphadénopathie - splénomégalie - hypergammaglobulinémie Chez l homme, un syndrome lymphoprolifératif similaire, nommé ALPS (Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome), a été identifié. La potentialité pro-apoptotique du système Fas/FasL est indispensable au maintien de l homéostasie du système immunitaire.

Voie Intrinsèque mitochondriale

Role de la mitochondrie dans l apotose Mitochondrie La mitochondrie est un organite cellulaire majeur qui est constitué d une membrane externe, d un espace intermembranaire, d une membrane interne et d une matrice. La mitochondrie génère l énergie nécessaire à toutes les réactions biochimiques de la cellule. La production d ATP se fait par phosphorylation oxydative dans la chaîne respiratoire. La chaîne respiratoire au niveau de la membrane interne de la mitochondrie génère un gradient de protons entre la matrice mitochondriale et l espace intermembranaire et crée ainsi un potentiel membranaire mitochondrial (ψm). Le retour des protons dans la matrice ne peut se produire qu'au niveau de passages spécifiques constitués par l'atp synthase. L ATP formé est alors transporté par l adénine nucléotide translocase (ANT) dans l espace intermembranaire en échange d une molécule d ADP. L ATP passe ensuite dans le cytosol au travers de canaux anioniques voltage-dépendants, les VDAC. la mitochondrie participe à l intégration et à la propagation des signaux de mort activés par des facteurs endogènes. La voie mitochondriale de l apoptose est induite par des signaux de stress cellulaire tels que l exposition à des radiations UV, une irradiation γ, des dommages à l ADN, une privation en facteurs de survie ou encore suite à l action d oncoprotéines, de protéines suppresseur de tumeurs comme la protéine p53 ou de protéines virales.

Fas, Trail, TNF Stress cellulaire Bax Bim Mitochondrie Bcl-2 Bcl-XL Cyt-c Apaf-1 APOPTOSE

Origine des perturbations membranaires observées dans l apoptose induite par la voie mitochondriale Théorie de la fermeture des canaux anioniques voltage-dépendants (VDAC) La fermeture du VDAC au cours de l apoptose pourrait induire une absence d échange ATP/ADP ce qui semble inhiber l activité de l ATP synthase et empêche le retour des protons vers la matrice et par conséquent contribue à l hyperpolarisation. Une telle augmentation du potentiel membranaire mitochondrial peut être à l origine du gonflement osmotique de la matrice conduisant à la rupture de la membrane externe mitochondriale (Zamzami N et Kroemer G 2001)

Les membres de la famille Bcl-2 Les membres de la famille Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma-2) constituent les principaux régulateurs de l apoptose. Cette famille, contenant environ une trentaine de membres, peut être divisée en 2 groupes en fonction de leur activité : -les protéines possédant une activité anti-apoptotique -les protéines possédant une activité pro-apoptotique. Chez le nématode C. elegans, il existe deux protéines de la famille Bcl-2 : CED-9, un facteur anti-apoptotique EGL-1, un facteur pro-apoptotique.. Ces régulateurs de l apoptose participent à la décision d entrée en apoptose ou de survie et ceci tout particulièrement au cours de l activation de la voie mitochondriale de l apoptose.

rappel Signal Suite à un stimulus de mort cellulaire, la protéine Egl-1 interagit avec Ced-9, permettant ainsi l'activation de la protéase Ced-3 pro-apoptotique Anti-apoptotique Régulateur L'activation de Ced-3 par Ced-4 est inhibée par la protéine Ced-9 qui séquestre Ced-4 et/ou Ced-4/Ced-3 au niveau des membranes intracellulaires

Antiapoptotiques Bcl-2 Bcl-XL Bcl-W Mcl-1 A1/Bfl-1 Boo/Diva Bcl-B Classification des membres de la famille Bcl-2 BH4 Variable BH3 BH1 BH2 Sites de phosphorylation Domaine de dimérisation TM Domaine d insertion membranaire Pro-apoptotiques Bax Bak Bok/Mtd Bcl-X S «Bax-like» BH3 BH1 BH2 TM Bik/Nbk Hrk/DP5 Blk Bim/Bod Bad Bid Bmf Noxa Puma/Bbc3 Bcl-G «BH3-only» BH3 TM BH : Bcl-2 homology domain TM : Transmembrane domain

Interactions entre les membres de la famille Bcl-2 Relocalisation de Bim par Phosphorylation microtubules Bim Relocalisation de Bid par clivage Bid En Présence Absence de signal de mort. Changement de conformation oligomérisation de Bax/Bak Bax Bax Bcl-2 Bcl-2 Bcl-2 P Bcl-2 Cyt-c Bak Bcl-2 Bcl-2 Complexe pro-apoptotique Complexe anti-apoptotique Relocalisation de Bad par déphosphorylation P Bad 14-3-3

Origine des perturbations membranaires observées dans l apoptose induite par la voie mitochondriale Théorie de la formation de canaux à travers la membrane externe composés de membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 L activation des protéines de la famille Bcl-2 par un stimulus pro-apoptotique induirait un changement conformationnel permettant la formation de pores qui laisserai passer des SIMPs (soluble intermembrane mitochondriale proteins). Certains de ces pores ont été décris et sont constitués par l oligomérisation de la protéine pro-apoptotique Bax de la famille Bcl-2, par une association entre les protéines Bax et Bid et enfin par une interaction entre Bax et le VDAC.

Origine des perturbations membranaires observées dans l apoptose induite par la voie mitochondriale Théorie du pore de transition de perméabilité (PTP) mitochondrial Le PTP est un canal non sélectif pouvant être formé par l apposition de protéines transmembranaires résidant au niveau de la membrane interne et au niveau de la membrane externe de la mitochondrie (composition minimale du PTP = ANT, VDAC et cyclophiline D, une protéine de la matrice. L ouverture du pore peut être induite par différents effecteurs physiologiques comme le calcium, la diminution de la concentration en adénine ou en phosphate inorganique, la protéine pro-apoptotique Bax de la famille des protéines Bcl-2 et également par des inducteurs de mort

Gènes Développement Apoptose Membres de la famille BCL-2 Anti-apoptotiques Bcl-2 Bcl-x Mcl-1 A1 Bcl-w Souris viables à la naissance. Létalité à E13. Pro-apoptotiques Bax Bak Bax/Bak BH3 only : Bid Bim Létalité embryonnaire à E3,5-4. Défaut d implantation de l embryon. Souris viables. Pas de défaut de développement. Souris viables. Pas de défaut majeur de développement. Souris viables mais stériles. Souris viables et fertiles. Pas de défaut majeur du développement. Insuffisance rénale sévère, due à une diminution du nombre de néphrons. Chute progressive du nombre de lymphocytes circulant au cours du développement. Apoptose accrue de la rate et du thymus. Hypopigmentation, reflétée par une mort accrue des mélanocytes. Mort cellulaire accrue de la population neuronale et défaut de maturation des populations lymphocytaires T B, et érythrocytaires. Apoptose des neutrophiles accrue. Apoptose des neutrophiles accrue. Les mâles sont infertiles. Les femelles ont des fonctions reproductrices normales. Mâles stériles en raison d une apoptose massive des cellules germinales. Les neurones isolés à partir de ces souris prolifèrent en absence de facteur de croissance. Les ovaires des souris femelles Bax-/- montrent un excès de cellules folliculaires primaires dû à un défaut d apoptose. Pas de défaut d apoptose. 90% de mortalité périnatale. Persistance de l inter-digitation. Accumulation de neurones dans le système nerveux central, splénomégalie. Les fibroblastes embryonnaires sont résistants aux radiations U.V. et à la déprivation en facteurs de croissance. Souris viables. Pas de défaut majeur du développement. Létalité embryonnaire partielle à E10. Développement thymique : lymphoadénopathie et splénomégalie des sujets âgés d un an. Hypergammaglobulinémie. Résistance des hépatocytes à l apoptose induite par FAS. Défaut d élimination des thymocytes auto-réactifs. Perturbation de l apoptose des neurones.

Les membres de famille Bcl-2 assurent une grande diversité de fonctions biologiques liées: - Différence dans leur capacité de former des dimères - Différence dans leur localisation cellulaire - Différence dans leur profil d expression cellulaire

Effets du double KO Bax/Bak Souris Bax -/-: Souris viable mais stériles (apoptose des cellules germinales) Souris Bak -/-: Souris normales Importance du couple Bax/Bak dans la régulation de l apoptose

Effets du double KO Bim/Bcl-2 Bcl-2 Défaut d apoptose Bim -/- Bcl-2 Survie Modérée WT Bim Bim Excès d apoptose Bcl-2 -/- Survie Modérée Bcl-2 -/- Bim -/- Les perturbations de l apoptose, causées par la déficience du gène Bcl-2, sont totalement complémentées par l invalidation de Bim.

La voie mitochondriale de l apoptose Les différents SIMPs Apoptose

La voie mitochondriale dépendante des caspases: rôle du cytochrome c Le déclenchement de la voie mitochondriale dépendante des caspases se fait après relargage du cytochrome c depuis la mitochondrie Le cytochrome c est synthétisé sous forme de précurseur incapable de participer à l induction de l apoptose. Le précurseur est importé dans la mitochondrie où il subit une maturation. Le cytochrome c, au niveau de l espace intermembranaire mitochondrial, exerce sa fonction physiologique de transporteur d électrons entre les complexes III et IV de la chaîne respiratoire. Au cours de l apoptose seule une partie du cytochrome c, la fraction soluble, serait relâchée dans le cytosol. La fraction associée avec la membrane interne de la mitochondrie permettrait à la cellule de continuer à synthétiser de l ATP nécessaire à la réalisation de l apoptose. Le relargage du cytochrome c participe alors à l activation de la cascade des caspases en activant une caspase initiatrice, la caspase-9. L activation de la caspase-9 se fait au sein d un complexe multiprotéique, l apoptosome (cytochrome c,apaf-1, ATP et procaspase-9).

Structure d APAF-1 APAF: Apoptotic Protein Activating Factor A B Domaine de recrutement des caspases Sites de liaison datp/atp Liaison cytochrome c

Assemblage de l apoptosome La formation de l apoptosome débute par la fixation du cytochrome c au niveau de motifs WD-40 présents sur Apaf-1. Cette fixation induit un changement de conformation de Apaf-1 et expose son domaine CARD (Caspase recruitment domain). La fixation de l ATP permet la stabilisation de la nouvelle conformation qui permet l oligomérisation de sept unités (Apaf-1)-(cyt c)-atp.

Assemblage de l apoptosome Cette nouvelle conformation en heptamère autorise le recrutement de procaspases-9 via une interaction entre les domaines CARD des protéines Apaf-1 et les domaines CARD des procaspases-9. Le complexe heptamérique formé est alors appelé apoptosome. L apoptosome actif est alors capable de recruter et d activer les caspases effectrices -3 et -7. De plus, au sein de l apoptosome, les caspases-9 peuvent s autoactiver du fait de leur proximité.

Léthalité perinatale Rôle physiologique d APAF-1 et Cyt c EMBRYONS ISSUS DES SOURIS APAF-1 -/- EMBRYONS ISSUS DES SOURIS Cyt c muté knock-in Malformations crano-faciales majeures Défaut d apoptose cerveau Persistance de l interdigitation Cellules embryonnaires résistantes à l apoptose induite par la mitochondrie Malformations crano-faciales majeures Défaut apoptose cerveau Cellules embryonnaires résistantes à l apoptose induite par la mitochondrie

La voie mitochondriale de l apoptose Les différents SIMPs Apoptose

La voie mitochondriale dépendante des caspases: rôle de Smac/diablo et Omi/HtrA2 Au cours de l activation de la voie mitochondriale dépendante des caspases, parmi les SIMPs relarguées de la mitochondrie se trouvent les protéines Smac/DIABLO (Second Mitochondriaderived Activator of Caspase/Direct IAP Binding protein with Low pi) et Omi/HtrA2. Ces protéines sont en fait des inhibiteurs des IAP (cf partie caspases). Elles se lient au niveau des domaines BIR des IAP et inhibent ainsi leurs activités anti-apoptotiques a. Sur XIAP les sites de liaison caspase-9 et Smac se chevauchent. Les résidus, W310, E314 and H343 (en bleu) permettent l interaction avec la caspase-9. Les résidus T308, G305, G306 and P325 (jaune) donne un phénotype de gain de fonctions. b. Modèle de structure du complexe Smac/XIAP Geng Nature 408, 1008-1012

La voie mitochondriale de l apoptose Les différents SIMPs Apoptose

La voie mitochondriale indépendante des caspases: rôle de l AIF et l endonuclease G Le facteur AIF, identifié et cloné il y a plusieurs années, est une flavoprotéine de 57 kda confinée dans l espace intermembranaire de la mitochondrie. Le précurseur de l AIF (67 kda) est synthétisé dans le cytoplasme puis importé dans la mitochondrie. Une fois dans l espace intermembranaire, la protéine est clivée, elle change de conformation et possède alors probablement une activité NADH oxydase. Après activation de la voie intrinsèque, l AIF se transloque de l espace intermembranaire vers le cytosol puis vers le noyau. Le transport vers le noyau pourrait se faire grâce à une séquence de localisation nucléaire. Dans le noyau, l AIF induit une condensation périphérique de la chromatine ainsi qu un clivage de l ADN en fragments d environ 50 kb, ceci par interaction directe avec l ADN sans spécificité de séquence. l AIF amplifierait également sa propre libération une fois dans le cytosol. Cette action dépends directement de l activité de l AIF lui-même et sont indépendantes des caspases.

La voie mitochondriale indépendante des caspases: rôle de l AlF et l endonuclease G L endonucléase G est une nucléase mitochondriale non-spécifique de 30 kda très conservée chez les eucaryotes. Elle est codée par un gène nucléaire et est importée dans l espace intermembranaire mitochondrial. L activation de la voie intrinsèque de l apoptose conduit à la libération de l endonucléase G dans le cytosol puis à sa translocation dans le noyau. L endonucléase G digère l ADN en absence d activité caspase et en absence de la nucléase caspase-dépendante. Elle pourrait agir avec l exonucléase et la DNase I dans le noyau pour générer les fragments d ADN de haut poids moléculaire mais elle peut également générer des fragments oligonucléosomiques. L endonucléase G pourrait également coopérer avec l AIF pour induire une apoptose indépendante des caspases.

Voie dépendante du Reticulum endoplasmique

La voie apoptotique dépendante du RE: Le réticulum endoplasmique (RE) est le site d assemblage des protéines (modifications posttraductionnelles et acquisition des structures III et IV). Le RE est également un site de stockage du calcium intracellulaire [Ca2+]i qui permet de réguler la concentration cytoplasmique en calcium. Depuis quelques années un nouveau rôle dans la réponse au stress cellulaire et l induction de l apoptose est apparu concernant le RE. 3 voies apoptotiques peuvent être induites après un stress du RE. 1) Induction transcriptionnelle de CHOP («C/EBP homologus protein»), un membre de la famille des facteurs de transcription C/EBP. CHOP est peu ou pas exprimé dans des conditions physiologiques normales et est fortement induit en réponse à un stress du réticulum. Sa surexpression conduit à un arrêt de la croissance cellulaire et à l apoptose. 2) Voie de transduction cjun N-terminal kinase (JNK). 3) Activation de la caspase-12,l ocalisée au niveau de la membrane du RE côté cytosolique, conduit à l apoptose. Il semblerait que JNK agisse comme partenaire dans cette activation.

La voie apoptotique dépendante du RE: La famille des protéines BCL2 dans les cellules au repos ou en condition de stress du réticulum endoplasmique Dans les conditions de repos, les protéines pro-apoptotiques Bax et Bak (Bax/Bak) sont maintenues inactive par interaction avec BCL2 au niveau des membranes du réticulum endoplasmique (RE) et de la mitochondrie. Bim (BH3) est quant à lui inhibé par liaison à la protéine du cytosquelette dyneine.

La voie apoptotique dépendante du RE: La famille des protéines BCL2 dans les cellules au repos ou en condition de stress du réticulum endoplasmique Un stress sévère du RE entraîne l activation de c-jun N-terminal kinase (JNK) et C/EBP homologous protein (CHOP; phase d initiation). JNK et CHOP elimine l effet anti-apoptotique de BCL2. CHOP bloque l expression de BCL2, alors que JNK le phosphoryle. JNK phosphoryle également Bim ce qui entraîne à son détachement du cytosquelette et à son activation.

La voie apoptotique dépendante du RE: La famille des protéines BCL2 dans les cellules au repos ou en condition de stress du réticulum endoplasmique Collectivement ces changements permettent l activation de Bax et Bak,la transmission du signal du RE à la mitochondrie et la mort cellulaire (phase d execution). Les caspases sont probablement activées à la surface du RE ainsi qu au niveau de l apoptosome après la transmission du signal de mort à la mitochondrie et au relargage du cytochrome c.

VI. Les caspases «les ouvrières de l apoptose»

Après la phase d initiation de l apoptose caractérisée par l activation des voies extrinsèque ou intrinsèque, interviennent les phases d exécution et de dégradation. Ces différentes voies font intervenir dans leur déroulement l activation d une famille de protéases particulières, les caspases. C ASP ASES Cystéine Aspartate Protéases à cystéine capables de cliver des substrats après un acide aspartique X X X D X Chez les mammifères, 14 caspases ont été identifiées à ce jour dont 11 sont présente chez l humain. Ces enzymes jouent un rôle dans l initiation et l exécution de l apoptose ainsi que l activation de cytokines comme l IL-1β et l IL-18.

CASPASES: MECANISME D ACTIVATION L activation des caspases peut se faire au sein de complexes multiprotéiques (apoptosome et DISC), dans lesquels les procaspases sont recrutées, ou par clivage protéolytique de la forme zymogène D après Amarante- Mendes et Green, 1999

CASPASES: CLASSIFICATION Les caspases peuvent être subdivisées en trois grands groupes selon leur site spécifique de reconnaissance du substrat, selon leur structure selon leur fonction biologique Les caspases inflammatoires. Le premier groupe comprend les caspases-1, -4 et -5 qui jouent un rôle dans les réponses inflammatoires en participant à l activation protéolytique de cytokines proinflammatoires telles que l IL1β et l IL18

CASPASES: CLASSIFICATION Les caspases initiatrices sont à l origine de la cascade d activation des caspases conduisant à l exécution du programme apoptotique. Ces caspases initiatrices possèdent un prodomaine long permettant leur recrutement par des molécules adaptatrices au niveau de motifs d interaction situés sur ce prodomaine. Les caspases-8 et -10 possèdent un motif DED (death effector domain) permettant leur recrutement dans le DISC au niveau de récepteurs de mort. Les caspases-2 et -9 possèdent quant à elles, un motif CARD (caspase recruitement domain) qui permet leur recrutement au niveau de l apoptosome Le recrutement des caspases initiatrices au niveau des complexes multiprotéiques DISC et apoptosome permet leur activation.

CASPASES: CLASSIFICATION Une fois activées, les caspases initiatrices vont à leur tour activer les caspases effectrices -3, -6 et -7. Ces dernières sont caractérisées par un prodomaine court. Les caspases effectrices sont activées par clivage et dimérisation comme évoqué précédemment. Lorsqu elles sont activées les caspases effectrices sont directement impliquées dans l exécution de l apoptose et clivent un grand nombre de protéines vitales de la cellule

Gènes Développement Apoptose Caspases Caspase 1 (infla.) Caspase 2 (ini.) Pas d effet sur le développement. Résistance aux chocs septiques induits par LPS. Absence d IL-1 et IL-18 clivé. Production altérée d IL-1, IL-6 et IFN-. Souris viables. Pas de problème majeur. Excès de cellules germinales femelles. Sensibilité normale à la plupart des agents pro-apoptotiques. L apoptose induite par CD95 est atténuée dans les thymocytes. Les neurones sont résistants à la déprivation en facteurs de croissance. Ovocytes résistants à la mort induite par les drogues. La mort induite par le granzyme B est défectueuse dans les cellules B. Lymphocytes sensibles aux drogues et à l anti-cd95. Caspase 3 (Eff.) Caspase 8 (ini.) Caspase 9 (ini.) Caspase 11 (infla.) Taille des souris plus petite. Mort entre la 1 ère et la 3 ème semaine. Altération du développement du cerveau avec un excès de cellules post-mitotiques. Létalité in utero. Embryons plus petits. Malformation cardiaque. Accumulation massive d érythrocytes et hémorragie massive. Diminution des cellules souches hématopoïétiques. Létalité périnatale. Cerveau plus volumineux et mal formé dû à une réduction de l apoptose au cours du développement du cerveau. Absence d activation de la caspase 3 dans les cerveaux embryonnaires. Pas de défaut du développement (similaire à caspase 1). Absence de production d IL-1 et, due au blocage de l activation de la caspase 1. Pas de bourgeonnement et de fragmentation du noyau dans les thymocytes et les hépatocytes. Clivage des substrats des caspase absent ou retardé. Réduction de l apoptose dans l AICD et dans les fibroblastes stimulés par des drogues. Fibroblastes résistants à l apoptose induite par TNF-R 1, CD95 et DR3, mais sensibles à la plupart des agents pro-apoptotiques. Activation normale de NFkB et de JNK. Les cellules souches embryonnaires et les fibroblastes sont résistants à de nombreux stimuli pro-apoptotiques. Les thymocytes sont résistants à l apoptose induite par radiation- et dexaméthasone, mais sensibles aux U.V. et à CD95. Les splénocytes ne sont pas protégés contre l apoptose induite par des drogues. Cellules résistantes à l apoptose induite par la surexpression de la caspase 1. Caspase 12 (infla.) Pas de défaut du développement. Souris résistantes à l apoptose induite par le stress du réticulum endoplasmique, mais sensibles aux autres stimuli pro-apoptotiques. Les neurones corticaux présentent une insensibilité à l apoptose induite par la protéine -amyloïde, mais pas par la staurosporine ou la déprivation en facteurs de croissance.

Fas, Trail, TNF Stress cellulaire: Déprivation cytokines, radiations, UV, agents antitumoraux, choc thermique Voie extrinsèque Récepteurs de mort Voie intrinsèque Mitochondrie Mitochondrie Cyt-c Caspase-8 initiatrice Caspase-3 Caspases effectrices Apaf-1 Caspase-9 initiatrice Protéolyse de substrats DXXD APOPTOSE

Ressemblance des effets des invalidations géniques chez la souris Notion de chemins biologiques - La caspase 8 et sa protéine adaptatrice FADD, qui sont indispensables à l apoptose induite par les récepteurs de mort cellulaire. Cette voie participe durant l embryogénèse à la mise en place du système cardio-vasculaire. - Les caspases 3 et 9 et la protéine régulatrice APAF-1, qui sont indispensables à l apoptose de type mitochondrial. Cette voie participe durant l embryogénèse à la mise en place du système nerveux central.

Fonctions biologiques des caspases EMBRYONS ISSUS DES SOURIS CASPASE 9 -/- EMBRYONS ISSUS DES SOURIS CASPASE 8 -/- +/+ -/- +/+ -/- Malformations encéphaliques majeures Défaut apoptose cerveau Cellules résistantes à l apoptose induite par le voie mitochondriale Malformations cardiaques majeures Défaut apoptose cœur Cellules résistantes à l apoptose induite Par la voie des récepteurs de mort Léthalité périnatale

Notion de redondance ou de compensation Aucune des différentes caspases déjà invalidées n est capable d inhiber la totalité des processus apoptotiques au cours du développement embryonnaire. Rôle des caspases chez l adulte? L invalidation génique des caspases étant souvent létale à des stades précoces du développement, seules des invalidations conditionnelles pourraient rendre pleinement compte de leurs fonctions biologiques au cours du maintien de l homéostasie d un organisme adulte.

Fas, Trail, TNF Stress cellulaire: Déprivation cytokines, radiations, UV, agents antitumoraux, choc thermique Mitochondrie IAPs Cyt-c Caspase-8 initiatrice Caspase-3 Caspases effectrices Apaf-1 Caspase-9 initiatrice Protéolyse de substrats DXXD APOPTOSE IAPs

Famille des IAPs : Inhibitory of APoptosis BIR : Baculoviral IAP Repeat

Mécanisme d inhibition des caspases par les IAPs IAP BIR IAP BIR

Fonctions biologiques des IAPs? L inactivation génique de XIAP ne perturbe pas le développement des souris XIAP-/- et ne conduit pas à l apparition d un phénotype particulier. Redondance et/ou d une compensation des différents membres de la famille des IAP.

Fas, Trail, TNF Stress cellulaire SMAC Mitochondrie IAPs Cyt-c Caspase-8 Caspase-3 Caspases effectrices Apaf-1 Caspase-9 SMAC Protéolyse de substrats DXXD IAPs APOPTOSE SURVIE

Fas, Trail, TNF Substrats des Caspases Stress cellulaire Mitochondrie Cyt-c Caspase-8 Caspase-3 Caspases effectrices Apaf-1 Caspase-9 Protéolyse de substrats DXXD APOPTOSE

Substrats des Caspases Sur les 250 substrats connus on retrouve des protéines impliquées : - Dans le maintien de l intégrité structurale cellulaire Ex: Gelsoline, Lamines, -caténines - Dans la régulation du métabolisme Ex: Protéine phosphatase 2A, Pyruvate Kinase - Dans la réparation et la fragmentation de l ADN Ex : Parp, CAD (caspase activated DNase) - Dans le contrôle de la prolifération ou du cycle cellulaire Ex : NFkBp50, SRF, P27kip1 - Les caspases elles-mêmes. - Démantèlement la structure cellulaire (Rock1, ICAD) - Mise en sommeil les voies de survie - Exacerbation des voies apoptotiques (Bcl-2, Mcl-1) Mort irréversible de la cellule par apoptose

Maintien de l intégrité structurale de la cellule Le cytosquelette d actine et la gelsoline (son régulateur anti-apoptotique) sont la cible des caspases durant l apoptose. La destruction du cytosquelette accélère le processus apoptotique et résulte dans l altération morphologique caractéristique de l apoptose. Dans les 2 cas les fragments d actine et de gelsoline semblent participer à la progression apoptotique. -tactin : Fragment d actine de 15-kDa qui induit la mort par apoptose. -Le fragment N-terminal de la gelsoline fragmente l actine de manière non régulé. L actine fonctionne donc à la fois comme cible et effecteur de l apoptose dans les cellules mammifères.

Activation du couple CAD/ICAD Signal apoptotique ICAD CAD Activation des caspases (caspase 3) CYTOPLASME NOYAU CAD/ICAD CAD actif Fragmentation d ADN ICAD inactif CAD= Caspase Activated DNAase ICAD = Inhibitor of CAD

Connexion entre la voie des récepteurs de mort et la voie mitochondriale

Fas, Trail, TNF Stress cellulaire Mitochondrie Cyt-c Caspase-8 Caspase-3 Caspases effectrices Apaf-1 Caspase-9 Protéolyse de substrats DXXD APOPTOSE

Résumé de la voie de signalisation apoptotique

VII. Techniques de mise en évidence et de quantification de l apoptose

Techniques de mise en évidence et de quantification de l apoptose 1/ Activation et Substrats des caspases 2/ Modification de la membrane plasmique 3/ Modifications nucléaires 4/ Modifications mitochondriales 5/ Altération du métabolisme

Méthodes de détection de l apoptose 1.Activation des caspases 2. Modifications de la Membrane 116 85 Activité Clivage Substrats extracellulaire intracellulaire Blebbing annexin V Phosphatidyl sérine 3.Dégradation de l'adn 4. Perméabilisation de la mitochondrie Echelles d ADN TUNEL Cytochrome c Potentiel (Dy) 5. Condensation de la chromatine Cellule normale Condensation de la chromatine

1. Activation des caspases

Detection des caspases actives Détection de l activation des caspases par WB Anticorps Anti-Caspase Pro-caspase 9 Caspase 9 Anticorps Anti-Caspase active Caspase 9 clivée

Dosage de l activité des caspases Substrat direct D E V D Peptide-fluorophore (AFC) Clivage Caspase active D E V D Mesure par Fluoroscan Quantification

Détection des Caspases actives Quantification par FACS (Fluorescence Activated Cells Sorting) Détection in situ 10X 100X Ischémie cérébrale

1bis. Substrats des caspases

Détection des substrats des caspases Anticorps Anti substrat Western blot Anticorps Anti substrat clivé Anticorps Anti PARP clivé Immunohistochimie Immunofluorescence

2. Modifications de la Membrane plasmique

Marquage Annexin-V/Iodure de propidium Annexin V Conjuguée FITC Membrane plasmique APOPTOSE Externalisation Phosphatidylserine «FLIP-FLOP» Cytoplasme Annexine V-FITC Noyaux Imperméables au PI Analyse par FACS Cellules mortes Noyaux Perméables au PI Iodure de propidium (PI) Cellules apoptotiques

Annexin V détection in vivo 18 F- Deoxyglucose avant traitement Tumeurs 99 TcannexinV 1h 48h: Chimiothérapie 18 F- Deoxyglucose après traitement Régression des Tumeurs

Trypan blue Une coloration qui rentre au travers de la membrane des cellules mortes/non viables Principe Quantification de la proportion de cellules mortes

3.Modifications nucléaires

Fragmentation de l ADN NT anti-fas Cong/Decong Fragmentation internucléosomale de l ADN, 180pb Nucléases spécifiques CAD Dégradation au hasard Nucléases non spécifiques

Condensation de la chromatine nucléaire des cellules apoptotiques Marquage des noyaux au DAPI % de cellules apoptotiques

Fragmentation de l'adn Marquage Tunel in situ +Terminal transférase +dutp * * UUUU * * * * UUUU * * * Immunostaining of apoptotic cells (dark brown) by TUNEL (Terminal Desoxynucleotidyl transferase dutp Nick End Labelling) and peroxidase staining in rabbit endometrium

4.Modifications mitochondriales

Démobilisation du Cytochrome c Western blot après fractionnement sub-cellulaire - + - + + - - - + + + + Hsp 60 MITOCHONDRIES Cyt c CYTOPLASME

Démobilisation du Cytochrome c Immunohistochimie anti Cytochrome c Cytochrome c cytosolique Cytochrome c mitochondrial

Démobilisation du Cytochrome c Immunofluorescence anti Cytochrome c Cellules contrôles Cellules apoptotiques Cyt c ponctiforme Cyt c mitochondrial Cyt c diffus = = Cyt c cytosolique

Potentiel de membrane mitochondrial Apoptose Chute du potentiel mitochondrial chlorométhyl-x-rosamine (fluorescent mytotracker ) lipophilic cationic fluorescent dye that is concentrated inside mitochondria by their negative mitochondrial membrane potential Analyse par FACS

5. Altération du métabolisme cellulaire

MTT et XTT MTT Formazan Tetrazolium Bromide Soluble jaune Sel de tetrazolium Soluble jaune Insoluble Bleu Soluble orange XTT Formazan Cellule au métabolisme actif (déhydrogénases enzymes mitochondriaux) La quantité de Formazan produite est directement proportionnelle à la quantité de cellules viables

MTT et XTT MTT XTT DO 570 DO 470 Mesure lecteur de microplaque Quantification du % de cellules viables

Incorporation de [ 3 H]-thymidine L incorporation de [3H]-thymidine reflète la synthèse d ADN qui est un bon index de l état prolifératif d une cellule. LBW242 (low molecular weight Smac mimetic) induit l apoptose dans different types cellulaires

Conclusions

Apoptose Est l un des processus de mort cellulaire programmée (Nécrose, Autophagie) Processus génétiquement déterminé, conservé au travers du règne animal. Intervient tout au long du développement et de la survie des organismes vivants Permet l élimination des cellules surnuméraires, mal positionnées, endommagées ou infectées par un agent pathogène, cellules représentant une menace pour l organisme Permet également l élimination des cellules en fin de réponse immune d une manière rapide et «propre» afin de limiter la réponse inflammatoire et les processus autoimmuns Des dérégulations de l apoptose participent à l émergence de nombreuses pathologies liées soit à un excès d apoptose (neurodégénération, immunodéficience) soit à un défaut d apoptose (cancers, syndromes auto-immuns) La compréhension des mécanismes apoptotiques (identification et régulation des familles de protéines impliquées dans cette cascade biochimique) a permis durant ces 15 dernières années de mettre en place des stratégies alternatives de lutte contre ces différentes pathologies et ainsi d améliorer la réponse des patients aux traitements conventionnels.