Le récepteur de l insuline

Le récepteur de l insuline Tarik ISSAD Directeur de Recherche CNRS Institut Cochin Département de Biologie Cellulaire 22 rue Méchain, 75014 PARIS issad@cochin.inserm.fr

1. Quelques rappels : le rôle de l insuline dans l organisme Nutriments Pancréas Foie Insuline Muscles Tissus adipeux

La concentration de glucose dans le sang doit être maintenue dans d étroites limites À jeûn Intestin Nourri Foie Absorption Foie Production Glucose 1g/litre Utilisation Muscles Tissus adipeux Rein Tissus dépendants du glucose Cerveau (110g/jour : 50% de l utilisation totale par l organisme) Hématies Rétine Médulla rénale

Les effets biologiques de l insuline Pancreas Nutriments + + Transport de glucose (Muscle, tissu adipeux) Transport d acides aminés (toutes les cellules) Expression de gènes (toutes les cellules) Synthèse d ADN + (toutes les cellules) + Synthèse protéique (toutes les cellules) Apoptose + - (toutes les cellules) Insuline Cellules cibles - + - + Lipogénèse Acetyl CoA Acides gras (foie, tissu adipeux) Glycogénogénèse Glucose Glycogène (foie, muscle) + Glycolyse Glucose Pyruvate (foie, muscle, tissu adipeux?) Gluconéogénèse Pyruvate Glucose (foie) Triglycérides Lipolyse (Tissu adipeux) Acides Gras

2. Le récepteur de l insuline : structure et fonction NH2 NH2 Domaine de liaison (région riche en cystéine) Insuline S S S S COOH Domaine trans-membranaire NH2 NH2 -S - S- -S - S- COOH Domaine tyrosine-kinase P-Y - P-Y - P-Y - β β -Y-P -Y-P -Y-P Domaine C-terminal COOH COOH

Structure générale du gène du récepteur de l insuline 130 kb Exons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 17 18 19 20 21 22 Domaines du récepteur Peptide signal Liaison insline Région riche en cystéine Association entre sous-unités Exon alternatif Domaine transmembranaire Site de coupure protéolytique Domaine tyrosine kinase Association β sous-unité sous-unité β

Biosynthèse du récepteur de l insuline S S S-S S-S S S S-S S-S Maturation (enlèvement et ajout de sucres, ajout d acide scialique, O-glycosylation, acylation) Prorécepteur Dimérisation S-S S-S S-S ponts disulfure interchaînes ponts disulfure intrachaîne Clivage S-S S-S S S S-S S S S-S S-S S-S S S S-S S S S-S S-S S-S S S S-S S S S-S β β S-S S-S S S S-S S S S-S N-Glycosylation Pré-prorécepteur β Ribosomes peptide signal Golgi Activité Tyrosine-kinase PY S-S S-S S S S-S S S S-S m ARN ADN Réticulum endoplasmique Liaison de l insuline

Sites de phosphorylation du récepteur de l insuline NH2 NH2 Domaine L1 Insuline S S S S Domaine CR Domaine L2 -S - S- NH2 NH2 -S - S- COOH COOH P-S 967 P-S 968-972 Y-P? Domaine juxta-membranaire β β Trans-phosphorylation - 1158 Y-P - 1162 Y-P - 1153 Y-P Domaine tyrosine-kinase Activité TK P-S 1305 P-S 1306 P-T 1348-1328 Y-P 1334 Y-P Domaine C-terminal COOH COOH

Cristalisation du domaine kinase du récepteur de l insuline non-phosphorylé (Hubbard et al., 1995) Boucle catalytique Boucle régulatrice

Cristalisation du domaine kinase du récepteur de l insuline sous forme tri-phosphorylée (Hubbard, 1997) Boucle régulatrice Boucle catalytique Peptide substrat

Cristalisation du domaine kinase du récepteur de l insuline (Hubbard, 1995,1997) Conformation fermée Conformation ouverte

La liaison de l insuline stimule l activité tyrosine-kinase du récepteur. Par quel mécanisme? Insuline Insuline S S S S -S - S- -S - S- β β -Y-P -Y-P -Y-P Activité tyrosine-kinase Signal insuline

La sous-unité exerce un frein permanent sur l activité tyrosine kinase de la sous-unité β du récepteur S-S S S S S S-S S-S S S S S S-S S-S S-S β β -Y -Y -Y β β -Y -Y -Y β β -Y-P -Y-P -Y-P Digestion trypsique de la sous-unité Activité tyrosine-kinase constitutive Signal insuline β β β -Y-P -Y-P -Y-P Expression d un cdna déléte de la séquence codant pour la sous-unité Activité tyrosine-kinase constitutive Signal insuline

Modèle d activation du récepteur par l insuline En absence d insuline, la sous-unité exerce un frein permanent sur l activité tyrosine-kinase de la sous-unité β La liaison de l insuline sur la sous-unité entraîne une levée de l inhibition de l activité tyrosine kinase Insuline S S S S β S S S β S -Y -Y -Y S Insuline S S S S S β β S S -Y-P -Y-P -Y-P ADP ATP Activité tyrosine kinase

Analyse de la structure quaternaire du complexe insuline-récpteur de l insuline par microscopie électronique (Luo et al., Science, 1999)

Analyse de la structure quaternaire du complexe insuline-récpteur de l insuline par microscopie électronique (Luo et al., Science, 1999)

Reconstitution de la structure tri-dimensionnelle du complexe insuline-récepteur de l insuline (Luo et al., Science, 1999) β Cystein Rich Représentation schématique d un monomère -β d après les données de la littérature : - (L1-CR-L2) cristalisé pour le récepteur de l IGF1 - Fibronectin-like structure(fn1, Fn2) déterminée par RMN pour de nombreuses protéines - Position des ponts-disulfures - (1,2) et -β (3) - Domaine trans-membranaire - Domaine tyrosine kinase sous-forme activée cristalisé par Hubbard

Reconstitution de la structure tri-dimensionnelle du complexe insuline-récepteur de l insuline (Luo et al., Science, 1999) β Représentation schématique d un monomère -β d après les données de la littérature : - (L1-CR-L2) cristalisé pour le récepteur de l IGF1 - Fibronectin-like structure(fn1, Fn2) déterminée par RMN pour de nombreuses protéines - Position des ponts-disulfures - (1,2) et -β (3) - Domaine trans-membranaire - Domaine tyrosine kinase sous-forme activée cristalisé par Hubbard

Modèle d activation du récepteur par l insuline Insuline S S S S S S S S β β -Y -Y -Y S S Insuline S S S S β β S S -Y-P -Y-P -Y-P Insuline S S S S S S S S P-Y- -Y-P P-Y- β β -Y-P P-Y- -Y-P ATP ADP ADP ATP Activité tyrosine-kinase La liaison de l insuline entraîne un changement de conformation permettant le rapprochement des deux domaines kinases et la trans-phosphorylation d une sous-unité β par l autre sous-unité β

3. Les voies de signalisation du récepteur de l insuline : quelques exemples

Les voies de signalisation du récepteur de l insuline Insulin Receptor Y-P Gab1 Shc P-Y Y-P Y-P IRS Y-P Cbl Y-P ras raf-1 MEK MAP K PI-3K PDKs PKB & PKCζ/λ Crk C3G TC10 - Gene expression - Cell growth, proliferation and differentiation - Protein synthesis - Inhibition of apoptosis - Glucose transport - Glycolysis - Glycogen synthesis - Inhibition of lipolysis

La famille des IRSs (Insulin Receptor Substrates) IR PH 972 Y PTB IRS

La famille des IRSs (Insulin Receptor Substrates) SOS GRB2 SH2 PI3-Kinase PI3-Kinase SH PTP2 SH2 SH2 SH2 SH2 SH2 YXXM YXXM EYVN YXXM YXXM NYID IRS 1 PH PTB IRS 2 PH PTB IRS 3 PH PTB IRS 4 PH PTB PM apparent (SDS PAGE) Phénotype souris KO IRS 1 180 Kd - retard de croissance, résistance à l insuline modérée IRS 2 190 Kd - pas de retard de croissance, insuffisance pancréatique diabète IRS 3 60 kd - pas de phénotype apparent IRS 4 160 Kd - réduction modérée du poids corporel, légère intolérance au glucose

Les voies de signalisation en aval d IRS Insulin Receptor P-Y Y-P IRS Y-P ras raf-1 MEK MAP K PI-3K PDKs PKB & PKCζ/λ - Gene expression - Cell growth, proliferation and differentiation - Protein synthesis - Inhibition of apoptosis - Glucose transport - Glycolysis - Glycogen synthesis - Inhibition of lipolysis

The Phosphatidyl-Inositol 3 kinase pathway Insulin 972 Y IRS SH2 SH2 SH3 PKB

The Phosphatidyl-Inositol 3 kinase pathway Insulin 972 Y IRS SH2 p85 SH3 SH2 p110 PI 3-kinase PKB

The Phosphatidyl-Inositol 3 kinase pathway Insulin 972 Y IRS SH2 p85 SH3 SH2 p110 PI 3-kinase 3 P 3 P 3 P 3 P PKB

The Phosphatidyl-Inositol 3 kinase pathway Insulin 972 Y IRS SH2 p85 SH3 SH2 p110 PI 3-kinase PKB Protein Kinase B 3 P 3 P PDKs 3 P Phosphatidyl P Dependent Kinases 3 P PKCζ/λ

The Phosphatidyl-Inositol 3 kinase pathway Insulin 972 Y IRS SH2 p85 SH3 SH2 p110 PI 3-kinase 3 3 3 P P P PKB Protein -P Kinase B -P 3 3 3 P PDKs Phosphatidyl P Dependent Kinases 3 PKCζ/λ -P

The Phosphatidyl-Inositol 3 kinase pathway controls energy metabolism Insulin 972 Y IRS SH2 p85 SH3 SH2 p110 PI 3-kinase 3 3 3 P P P PKB Protein Kinase B -P -P 3 3 3 P PDKs Phosphatidyl P Dependent Kinases 3 PKCζ/λ -P + PDE3b Phosphodiesterase + PFK2 6-Phospho- Fructo2-Kinase - GSK3 Glycogen Synthase Kinase 3 +? - Activation of Glycogen Synthase Lipolysis - + + Glycolysis Glycogen Synthesis + Glucose Transport

Le tissu adipeux joue un rôle majeur dans la régulation du métabolisme énergétique Cerveau Nourri à Jeûn Triglycérides Corps cétoniques Lipolyse Estérification Lipoprotéines Acides gras Lipogénèse Acides gras Foie Glucose Muscles Adipocyte

Activation de la lipolyse par les hormones β-adrénergiques β-adrenergique P P AC P P camp P P Périlipine PKA HSL P HSL active Triglycérides Gouttelette lipidique Glycérol Glycérol COOH COOH COOH Acides gras libres COOH Acides gras libres

Inhibition of lipolysis Insulin receptor PI 3-K - Wortmannin PDE3b inactive PDE3b active P camp 5 AMP HSL Perilipin P PKA Perilipin Lipid droplet HSL P Lipolysis Fatty acids + Glycerol Triglycerides

Stimulation de la glycolyse dans le muscle cardiaque Glucose Récepteur de l insuline Glucose +? PI3-K PDKs PKB Glucose 6-P Fructose 6-P Phosphofructo 2-kinase P Phosphofructo 1-kinase + Fructose 2,6-P2 Fructose 1,6-P2 Phospho-Enol Pyruvate Le fructose 2,6-P2 est un activateur allostérique de la Phospho-fructo 1kinase, qui catalyse une étape limitante de la glycolyse Pyruvate

Synthèse de glycogène Glucose Récepteur de l insuline Glucose +? PI3-K PDKs PKB Glucose 6-P Glucose 1-P GSK 3 active + GSK 3 inactive P UDP glucose Glycogène synthase active Glycogène synthase inactive P Glycogène

Stimulation de la translocation de Glut4 par l insuline Glucose Récepteur de l insuline + Glucose? Glut 4 PI3-K - Wortmannin Métabolisme La PI3-Kinase est nécessaire à la stimulation du transport de glucose par l insuline

The Phosphatidyl-Inositol 3 kinase pathway Insulin 972 Y IRS SH2 p85 SH3 SH2 p110 PI 3-kinase 3 3 3 P P P PKB Protein -P Kinase B -P 3 3 3 P PDKs Phosphatidyl P Dependent Kinases 3 PKCζ/λ -P

Stimulation de la translocation de Glut4 par l insuline Glucose Récepteur de l insuline? Wortmannin Glucose Glut 4 PI3-K PDKs - Glut 4 PKB PKC ζ /,λ Site de rétention Les kinases activées par la voie PI3K-PDKs pourraient permettre de libérer les vésicules contenant Glut4 qui seraient accrochées à un site de rétention intracellulaire

Stimulation de la translocation de Glut4 par l insuline Glucose Récepteur de l insuline Glucose? Glut 4? PI3-K PDKs Wortmannin - + Analogues de PIP3 Glut 4 PKB PKC ζ /,λ Site de rétention La voie PI-3 kinase est nécessaire mais n est pas suffisante pour la translocation de Glut4 : - le PDGF stimule la voie PI3-K aussi bien que l insuline mais il n a pas d effet sur le transport de glucose - des analogues de PIP3, qui pénètrent dans la cellule, n activent pas le transport de glucose - ces mêmes analogues activent le transport de glucose dans des cellules incubées en présence de wortmaninn et stimulées par l insuline Il existe donc une deuxième voie, activée par l insuline, indispensable à la translocation de Glut4 à la membrane plasmique

La voie Cbl-CAP Récepteur de l insuline Caveolae TC10 rho family Flotillin CAP CAP Cbl - Cbl - C3G CRK - Cbl est un substrat qui s associe au récepteur par l interemédiare de la protéine CAP - Après phosphorylation de Cbl par le récepteur, le complexe Cbl-CAP est relargué et s accumule dans les caveolae. Il recrute alors un facteur d échange du GTP, C3G, par l intermédiaire de la protéine adaptatrice CRK

La voie Cbl-CAP Récepteur de l insuline Caveolae TC10 rho family Flotillin CAP CAP Cbl - GTP? Cbl C3G - CRK Le rôle de C3G pourrait être d activer une petite proteine G, la protéine TC10, localisée dans ces domaines. Sous l action de l insuline, TC10 est activée, et cette activation est nécessaire au transport de glucose.

Stimulation de la translocation de Glut4 par l insuline Récepteur de l insuline Caveolae Flotillin CAP? TC10 rho family CAP Cbl - IRS - Glut 4 GTP? Cbl C3G - CRK PI3-K - Wortmannin PDKs PKB PKC ζ /,λ Glut 4 Site de rétention

Fusion de la vésicule contenant Glut4 avec la membrane plasmique Syn 4 (T-snare) Caveolae Récepteur de l insuline Synip Vamp 2 (V-snare) Glut 4 TC10 rho family GTP Flotillin CAP Cbl - C3G CRK CAP Cbl - IRS - Wortmannin PI3-K - PDKs Vamp 2 PKB PKC ζ /,λ Glut 4 Site de rétention

Fusion de la vésicule contenant Glut4 avec la membrane plasmique Syn 4 Caveolae Récepteur de l insuline Synip TC10 rho family Flotillin CAP CAP Cbl - IRS - Vamp 2 Glut 4 GTP Cbl C3G - CRK PI3-K - Wortmannin PDKs Vamp 2 PKB PKC ζ /,λ Glut 4 Site de rétention

Fusion de la vésicule contenant Glut4 avec la membrane plasmique Syn 4 Récepteur de l insuline Caveolae Synip Vamp 2 Glut 4 TC10 rho family Flotillin CAP CAP Cbl - IRS - Vamp 2 Glut 4 GTP Cbl C3G - CRK PI3-K PDKs - Wortmannin Vamp 2 PKB PKC ζ /,λ Glut 4 Site de rétention

Fusion de la vésicule contenant Glut4 avec la membrane plasmique Récepteur de l insuline Glucose Syn 4 Caveolae Glucose Vamp 2 Glut 4 TC10 rho family Vamp 2 Glut 4 GTP Flotillin CAP Cbl - C3G CRK CAP Cbl - IRS - Wortmannin PI3-K PDKs - Vamp 2 PKB PKC ζ /,λ Glut 4 Site de rétention

La stimulation du transport de glucose par l insuline Récepteur de l insuline Glucose Syn 4 Caveolae Glucose Métabolisme Vamp 2 Glut 4 Vamp 2 Glut 4 TC10 rho family GTP Flotillin CAP Cbl - C3G CRK CAP Cbl - IRS - Wortmannin PI3-K PDKs - Vamp 2 PKB PKC ζ /,λ Glut 4 Site de rétention

4. La modulation du signal : rôle des IRSs

Signal Rétro-inhibition Atténuation du signal Récepteur Ligand Récepteur Ligand Récepteur Ligand - - Signaux intracellulaires Signaux intracellulaires Signaux intracellulaires Effets Biologiques Effets Biologiques Effets Biologiques

L hypothèse de la phosphorylation du récepteur sur sérine/thréonines NH2 NH2 Insuline S S S S -S - S- NH2 NH2 -S - S- COOH COOH β P-S 967 P-S 968 β -972 Y-P? - 1158 Y-P - 1162 Y-P - 1153 Y-P Domaine juxta-membranaire Domaine tyrosine-kinase COOH P-S 1305 P-S 1306 P-T 1348- COOH 1328 Y-P 1334 Y-P Domaine C-terminal

L hypothèse de la phosphorylation du récepteur sur sérine/thréonines?? Signal Rétro-inhibition Atténuation du signal Récepteur Insuline Récepteur Insuline Récepteur Insuline S T P-S P-T P-S P-T Activité Tyrosine-kinase Activité Tyrosine-kinase Activité tyrosine kinase Effets Biologiques Ser-thr kinase Effets Biologiques Ser-thr kinase Effets Biologiques Données expérimentales (1984,1986) : - Dans des modèles cellulaires en culture les agents stimulant la PKA ou la PKC inhibent l activité tyrosine kinase des récepteurs. Mais : - De nombreux auteurs, utilisant les mêmes cellules ou d autres types cellulaires, n ont pas retrouvé ces résultats.

Le rôle des IRSs dans la modulation du signal IR IR IR 972 Y PTB PH IRS PH 972 Y PTB IRS 972 Y P-S P-S PTB PH IRS Y Y Y Y Y PTB PH IRS P-S P-S PTB PH IRS P-S P-S PTB PH IRS Effets Biologiques Ser-thr kinase Effets Biologiques Ser-thr kinase Effets Biologiques

Exemple de rétro-contrôle par la PKC ζ IR IR PH 972 Y PTB IRS P-S P-S PTB PH IRS 972 Y P-S P-S PTB PH IRS Y Y Y Y Y PI3-K PKB PKC λ PDKs PKC ζ

Les mécanismes physiologiques de rétro-contrôle peuvent être détournés de leur fonction dans les situations pathologiques d insulino-résistance IR IR PH 972 Y PTB IRS P-S P-S PTB PH IRS 972 Y P-S P-S PTB PH IRS Y Y Y Y Y PI3-K PKB PDKs PKC ζ Production de céramides PKC λ Activation de sphingomyélinases Récepteur TNF Production de TNF par le tissu adipeux Obésité