Structure de la présentation

Importance de l Orbitrap pour l analyse protéomique Laurent Geiser 14 ème journées scientifiques du cccta Les Diab lerets, 16 septembre 2010 MS n et masse exacte: l outil incontournable du XXI ème siècle? Structure de la présentation 1. Protéomique par shotgun Buts de l analyse protéomique Intérêts et principes de la protéomiqu e par shotgun 2. Masse exacte et résolution en protéomique Spectres MS issus d e l analyse d un sérum Interprétation des données 3. L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement? 1

Structure de la présentation 1. Protéomique par shotgun Buts de l analyse protéomique Intérêts et principes de la protéomiqu e par shotgun 2. Masse exacte et résolution en protéomique Spectres MS issus d e l analyse d un sérum Interprétation des données 3. L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement? Découverte de biomarqueurs potentiels Population référence Population soumise à un toxique Comparaison d es populations Effets du toxique au niveau protéomique Apparition ou disparition de protéines Phosphorylations Apparition ou disparition de modifications post-traductionnelles (PTM) sur les protéin es Augmentation ou diminution de protéin es Alkylations Glycations Autres... Oxydations Acetylations 2

Analyse protéomique par shotgun (bottom up) MS & MS/MS expérimentaux Dénaturation & digestion des protéines (trypsine) en peptides Séparation LC & détection MS Spectres MS & MS/MS des peptides MS & MS/MS théorique (in silico) Identification automatique des peptides & protéines Protéines dans la base de donnée appropriée (humain, rongeur, ) Digestion théorique en peptides (trypsine) Spectres MS & MS/MS in silico des peptides Principaux intérêts & défis du shotgun Intérêts: vitesse & universalité 1 an alyse => identification d e centaines de protéines Les p eptides sont plus adaptés que les protéines pour la LC-ESI-MS/MS (ionisation par ESI & fragmentation après la MS 1 ) Défis: complexité des matrices réelles Quantité de protéines, et donc de spectres MS/MS expérimentaux & in silico Domaine d e concentrations d es protéines (~ 10 10-10 14 ) 3

Structure de la présentation 1. Protéomique par shotgun Buts de l analyse protéomique Intérêts et principes de la protéomiqu e par shotgun 2. Masse exacte et résolution en protéomique Spectres MS issus d e l analyse d un sérum Interprétation des données 3. L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement? Cas modèle: sérum Sérum: liquide sanguin déb arrassé de ses cellu les et protéin es d e coagulation; surn ageant obtenu après coagulation et centrifugation du sang dan s un tube. Composition du sérum: 90% d eau, protéin es, g lucose, ion s min éraux, Protéines dan s le sérum: ~ 60-80 g/l de protéines totales, dont ~ 60% d albumine Echantillon pour la protéomique: dilution à ~ 1 g/l de protéines totales, utilisation de 10 µl, soit ~ 10 µg. Digestion sur ~ 10 µg; injection en LC-ESI-MS/MS: ~ 0.1 1 µg 4

1. LC-ESI-MS: Total Ion Current RT: 0.00-8.00 100 9 90 8 MS 1 : TIC 30.2 4 34.8 40.14 42.72 42.80 NL:.26E9 TIC F: FT MS + p NSI Full ms [400.0 0-2000.0 0] MS 2010 _04_21 _LAG_ 16 _PTM_LY0_J02_No_ OGE_ 01 80 7 27.6 34.29 30.43 47.6 60.74 70 3.0 1 47.89 60.8 6 Relative Ab undance 6 60 0 4 40 39.8 37.6 8 43.86 1.30 8.44 3.2 3.78 3.94 61.14 3 30 7.72 6 6.80 2 27.38 61.61 20 1 10 26.01 2. 4 61.97 62.19 71.28 67.3 6 76.0 2.2 0 78.0 2 0.1 6.13 8.26 17.20 22.0 3 80.91 0 0 10 1 20 2 30 3 4 0 4 0 60 6 70 7 80 8 Time (min) 2. Apport de l exactitude: sélectivité R T: 0.0 0-8. 00 1 00 9 9 0 41.61 NL: 1. 7E7 m/ z= 11 06.0-1106. 06 F: FTM S + p NSI Ful l ms [40 0.00-2000. 00] M S 2010_04 _21_LAG _16_PT M_ LY0_J02_N o_og E_01 R T: 0.0 0-8. 00 1 00 9 9 0 41.61 6 3.90 NL: 1. 7E7 m/ z= 11 06.00-1106. 10 F: FTM S + p NSI Ful l ms [40 0.00-2000. 00] M S 2010_04 _21_LAG _16_PT M_ LY0_J02_N o_og E_01 8 8 63.99 8 0 8 0 7 7 7 0 7 0 R e l a ti v e A b u n d a n c e 6 6 0 0 4 4 0 3 3 0 2 2 0 1 Range: 1 106.0 1 106.06 Th Exactitude: 9 ppm R e l a ti v e A b u n d a n c e 6 6 0 0 4 (0.01 Th/ 1 106 Th) 4 0 (0.1 Th/ 1 106 Th) 3 3 0 2 2 0 1 Range: 1 106.0-1 106.1 Th Exactitude: 90 ppm 1 0 0 11. 03 1.91 4 6.76 1.28 7.03 8.1 2 62. 19 71.62 78. 06 22. 39 84. 69 0 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 6 70 7 80 8 Tim e (m in) 1 0 0 1. 36 6. 9. 89 1.91 22. 39 3 9.76 8. 64 46.81 4. 91 33.84 37. 87 42.2 47.94 0.8 0 60. 66 66. 72 26. 99 2 9.04 67. 6 77.83 78.33 0 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 6 70 7 80 8 Tim e (m in)

3. Apport de la résolution 2010_04 _21_LAG_16_ PTM_ LY0_J02 _No _OGE_01 # 2077-2 083 RT: 27.6 2-27.6 AV: 2 NL: 3.9 E8 F: FTMS + p NSI Full m s [4 00.00-20 00.00] 66 0.0629 R=14 31 z=4 100 9 90 8 80 7 70 6 28.2 17 R=7326 Rela tive Abund ance 60 0 4 40 3 30 2 20 1 10 0 4 31.7418 R=63 4 z=4 499.2989 R=923 6 z=1 7.3197 R=4 84 z=3 674.317 7 R= 0877 z=4 862.47 64 R= 4603 z=2 879.74 81 R=44936 z=3 1319.1 184 R=36662 0 0 600 700 8 00 900 1000 1100 12 00 1300 1400 m/z z=2 3. Apport de la résolution 2010_04 _21_LAG_16_ PTM_ LY0_J02 _No _OGE_01 # 2077-2 083 RT: 27.6 2-27.6 AV: 2 NL: 3.20 E8 F: FTMS + p NSI Full m s [4 00.00-20 00.00] 28.2 17 R= 7326 z= 100 9 90 8 80 7 70 6 28.014 R=6 228 28.419 R=806 1 Rela tive Abund ance 60 0 4 40 3 30 2 20 1 10 0 28.622 R=6 968 28.8 27 R=6224 2 9.031 R=69 3 29.233 R=3 808 Résolution pour une ch arge + Détermination univoque du pic monoisotopique: 28.014 Th Erreur de 0.2 Th: ~ 400 ppm 27.6 2 7.8 2 8.0 28.2 28.4 28.6 28.8 29.0 29.2 29.4 29.6 29.8 30.0 3 0.2 3 0.4 30.6 m/z 6

4. Apport de l exactitude et de la résolution MM peptide = Charge * ( Pic monoistopique - Masse proton ) Masse proton: 1.007 Charge Pic monoisotopique Masse moléculaire du p eptide + 28.01 Th 263.220 Da 4+ 69.812 Th 263.222 Da 3+ 879.414 Th 263.221 Da 2+ 1318.617 Th 263.220 Da Exactitude sur la masse moléculaire d e 263.221: < 1 ppm (0.002 Th/ 2 000 Th) Identification automatique des protéines MS & MS/MS expérimentaux Spectres MS & MS/MS des peptides Identification automatique par EasyProt MS & MS/MS théorique Spectres MS & MS/MS in silico des peptides 7

Identification de PTMs avec la masse exacte? Identification à partir de 20 acid es amin és d e masses connues EasyProt (Phen yx) Mascot Identification: ~ 20 30% des sp ectres expérimentau x PTMs: modifications de certains acid es aminés décalage en masses Phosphorylations Alkylations Oxydations Glycations Autres... Acetylations Masses exactes + outils bio informatiques adaptés Identification des PTMs? Structure de la présentation 1. Protéomique par shotgun Buts de l analyse protéomique Intérêts et principes de la protéomiqu e par shotgun 2. Masse exacte et résolution en protéomique Spectres MS issus d e l analyse d un sérum Interprétation des données 3. L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement? 8

LTQ-Orbitrap de Thermo Fisher Scientific Utilisation classique: MS 1 dans l Orbitrap: excellentes exactitude (< ppm) et résolution (~ 0 000) sur la masse des ions parents (= sur le peptide). Fragmentation pour la MS 2 par «data dependent acquisition» des ions parents intéressants: charge, intensité, liste d exclusion dynamique (peptides fragme ntés préalablement), MS 2 dans le LTQ (acquisiti on rapide) ou dans l Orbitrap (exactitude). LTQ-Orbitrap, TOF ou FT-ICR? Orbitrap: exactitude sur > 10 FT-ICR: exactitude sur ~ 10 TOF: exactitude sur ~ 10 2 Thermo Fisher Scientific LTQ-Orbitrap: exactitude sur les masses dan s un domain e de linéarité inégalé par d autres an alyseurs (sauf FT-ICR). LTQ-Orbitrap: instrumentation et mainten ance similaires à des QqQ, TOF ou Ion Trap; san s comp araison avec les contraintes pour un FT-ICR. 9

LTQ-Orbitrap pour toutes les analyses MS/MS? LTQ-Orbitrap Echantillon s complexes avec un e gamme d yn amique étendue Exactitude & résolution sur les masses Acquisition non continue: in adapté aux analyses ultra-rapides Temps de v ol (TOF) Flexibilité & acquisition en continu Peu ad apté à de larges gammes d ynamiques Triple quadrupole (QqQ) Valid ation quantitative: exactitude & précision en SRM Sensibilité, informations sur les masses en scan Remerciements Fabienne Jeanneret Paola Antinori Denis Hochstrasser Marc Fathi Florent Gluck 10