Version : 1 Page : 1 / 8 microbienne par Version Date Modificateur Descriptif 1 22/10/2012 M. Lelievre MAJ mise en page (en tete, filigrane) et corrections générales
Version : 1 Page : 2 / 8 1- Mots clés : biomasse, ADN, sol, électrophorèse, gel agarose, coloration, BET 2- Objectif / principe : L estimation de la biomasse microbienne est réalisée sur l extrait d ADN génomique total obtenu par extraction d ADN de sol. La méthode de dosage utilisée est basée sur l en comparaison à une gamme d ADN de thymus témoin permettant de calculer après analyse d image la quantité d ADN de chaque échantillon. 3- Consignes de sécurité : Port de la blouse et de gants 4- Durée de l expérience Pour la préparation du gel : 10 à 15 min environ Pour la durée de migration de l ADN : gel de vérification de PCR : de 0h30 à 1h20 environ gel de quantification : de 2h à 3h environ Pour la coloration et la visualisation du gel : 30 à 45 min Pour l analyse d image : 10 min/image 5- Matériel et produits nécessaires Matériel - Balance - Matériel d électrophorèse Biorad (calibration sur les cuves et supports Bio-Rad) - Flacon de 500 ml - Eprouvette de 25, 100, 500mL - Micro-onde - Générateur - Parafilm Produits - Agarose de routine - Tampon TBE (Tris, EDTA et acide borique) 10X préparé en 1X par les utilisateurs - BET - Marqueurs de poids moléculaires : ladder 1Kb - Colorant : bleu de bromophénol - ADN de thymus de veau (1mg/ml), biorad
Version : 1 Page : 3 / 8 6- Méthode A) PREPARATION DU GEL ET DU MONTAGE - Préparer du TBE dilué 1x à partir du concentré 10x avec de l eau permutée. - Préparation du gel Agarose de routine à 1 % pour l ADN extrait du sol, a) Peser directement dans le flacon (erlen ou bouteille SHOTT) la quantité nécessaire x g et compléter à y ml de TBE à l éprouvette. b) Faire fondre au micro-onde puissance maximale. Surveiller l'ébullition et adapter la puissance du micro-onde en fonction. NB : micro-onde fiole débouchée c) Stabiliser la température de l'agarose à l eau froide. Couler à chaud risque de déformer les plaques. NB : Il est possible de préparer à l avance l agarose et le conserver dans une étuve à 60 c en surfusion dans une bouteille Shott fermée. ATTENTION : quand l agarose devient jaune, il n est plus utilisable - Préparation du montage : a) Choisir la cuve, le support, le peigne et le guide de coulage appropriés b) Placer le support et son peigne dans le guide de coulage et régler l horizontalité du montage avec le niveau à bulle c) Couler le gel selon le tableau suivant afin de calibrer la quantité à mettre dans les supports de cuve pour harmoniser les dosages sur gel. Quantification ADN Quantification PCR Nombre de Nombre de peignes Taille tray Volume de gel 1% (ml) Volume de gel 2% (ml) peignes de 8puits de 8 puits 7 x 10 35 1 30 1 Taille gel tray Volume de gel 1% (ml) Nombre de peignes de 20 puits Volume de gel 2% Nombre de peignes de 20 puits 15 x 7 ø ø 40 1 15 x 10 80 1 60 2 15 x 20 160 2 120 3 15 x 25 200 3 150 4 Eviter les bulles qu on pourra enlever à l aide d une pointe de micropipette
Version : 1 Page : 4 / 8 d) Une fois polymérisé (environ 30min après), enlever délicatement le guide de coulage et déposé le gel et son support dans une cuve remplie de TBE 1X. Le gel doit juste être recouvert de tampon e) Enlever ensuite délicatement et bien droit le peigne pour ne pas arracher les puits. B) CHARGEMENT DU GEL - Colorant : 5 μl déposés sur parafilm. - Echantillon : 10μl - Gamme d ADN de thymus : 10µl/point de gamme - Marqueur de taille 1Kb DNA ladder : 5µl - Laisser migrer de 2h00 à 3h00 environ à courant constant de 70mA (si le voltage dépasse 100V baisser l ampérage). C) COLORATION DU GEL - Cette opération est réalisée dans la salle BET spécifique. - BLOUSE, GANTS VIOLETS EN NITRILE, ET MANCHETTES SONT OBLIGATOIRES. GARDER UN GANT NON SOUILLE PENDANT CETTE OPERATION. - Récupérer délicatement votre gel seul (sans support) dans un plastique - Immerger le gel dans un bain de BET pendant 15 à 40 min environ en prenant la précaution de ne pas souillé le plastique ayant servi au transport du gel. - Récupérer le gel à l aide d une pelle et l égoutter. - Mettre ensuite le gel dans un bain de rinçage (eau) à l aide de la pelle pendant 10 à 20 min environ. - Rincer la pelle. - Récupérer le gel à l aide d une pelle et prendre la/les photo(s) D) VISUALISATION DU GEL - Toucher les appareils de réglage et le matériel informatique avec un GANT PROPRE et SEC. - Placer le gel sur la table UV sous la caméra pour le visualiser sur ordinateur et imprimer une photo. - Récupérer le gel à l aide d une pelle, le mettre dans un bain de décontamination (contenant du charbon actif qui capte le BET).
Version : 1 Page : 5 / 8 - Nettoyer la table UV avec de l eau et du papier absorbant. - Se noter sur le cahier d enregistrement des photos de gels avec un GANT PROPRE. - Enlever les gants selon la méthode préconisée pour la manipulation des toxiques. - SORTIR DE CETTE SALLE SANS GANTS VIOLETS EN NITRILE E) ANALYSE D IMAGE L analyse d image se fait à l aide du logiciel Image Quant TL. Pour estimer de la même manière tous les ADNs extraits et déposés sur des gels différents, il faut calibrer la taille du rectangle par rapport aux marqueurs de poids moléculaires utilisé (1Kb ladder) 1Kb Plus Ladder 1Kb Les rectangles dessinés en vert ci-dessus ont une taille estimée «standard» qui va être appliquée à toutes les quantifications sur gels agarose par ImageQuant TL à des fins de bonne reproductibilité et pour une bonne comparaison inter-gels des valeurs de quantités d ADN. Le logiciel fournit une fluorescence par rectangle qui va permettre de calculer la quantité d ADN extrait/g de sol grâce à la gamme étalon d ADN de thymus.
Version : 1 Page : 6 / 8 7- Réactifs chimiques, éléments de sécurité Produit Numéro CAS Formule chimique Type de danger Protection Irritant Tris 77-86-1 C 4 H 11 NO 3 Blouse, gants TBE EDTA 60-00-4 C 10 H 14 N 2 O 8 Na 2 2H 2 0 Irritant Blouse, gants, lunettes Acide borique 10043-35-3 H 3 BO 3 Irritant Gants, blouse, hotte aspirante ou masque, lunettes Bleu de bromophénol C 19 H 10 Br 4 O 6 S Saccharose 57-50-1 C 12 H 22 O 11 BET (Bromure d éthidium) 1239-45-8 C 21 H 20 BrN 3 Cancérogène Mutagène Toxique pour la reproduction Gants, blouse, écran facial ou lunettes, surchausses, travail sous sorbonne 8- Evacuation des déchets - Le tampon de migration est recyclé 1 à 2 fois puis jeté à l évier dès qu il devient bleu - Les tubes vides et les pointes de pipettes sont évacués en déchets chimiques dans les poubelles de paillasse et les poubelles jaunes. Ces dernières sont évacuées 1 à 2 fois par semaine par une société privée. - Les déchets chimiques sont entreposés dans les contenants spécifiques dans chaque laboratoire (sécuribac). Veiller à séparer les toxiques des non toxiques. - Le gel est décontaminé dans le contenant spécifique dans la salle BET. 9- Références bibliographiques Néant
Version : 1 Page : 7 / 8 Annexes 1. Préparation d une gamme d ADN de thymus de veau Matériel et produits nécessaires - Tubes Eppendorf 2 ml - Bain-marie - Réfrigérateur - TE - ADN de thymus de veau Biorad (ref 1702480) A- Préparation de TE : 10mM Tris, EDTA 1mM Ci Cf dilution V Tris 1 M 10 mm 1/100 70 µl EDTA 0,5M 1 mm 1/500 14µl QSP 7ml H20up - B- Préparation de la gamme d ADN de thymus de veau - A partir de la solution mère à 1mg/mL*, préparer 2 ml de solution à 250ng/10µL : 50µL de solution mère + 1,950 ml de TE - Laisser la solution à 250ng/10µL pendant 30 minutes au bain-marie à 37 C, puis la placer à 4 C pendant une nuit. - Faire plusieurs dilutions en cascade avec un facteur de dilution de 3/4 dans du TE pour constituer une gamme de 9 points (250 ; 187,5 ; 140,6 ; 105,5 ; 79,1 ; 59,3 ; 44,5 ; 33,4 ; 25 ng/10µl). Vortexer entre chaque point de dilution. ng/10µl 250 187,5 140,6 105,5 79,1 59,3 44,5 33,4 25 ADN (ml) 0,050* 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 TE (ml) 1,95 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 dilution 1 3/4 4/7 3/7 25/79 14/59 13/73 2/15 1/10 Ne seront gardés que les points : 250 ; 187,5 ; 140,6 ; 79,1 ; 25 ng/10µl
Version : 1 Page : 8 / 8 - Conserver les dilutions à 4 C. 2. Marqueur de poids moléculaires Marqueur 1 Kb Méthode : 1 Kb commerce: 30 µl 70 µl TBE 1X : 240 µl 560µL Bleu Bromophénol: 60 µl 140 µl EDTA 0.2 M ph 8.2: 60 µl 140 µl