Table des matières I. Introduction 8 1.Aspects cliniques de la maladie d Alzheimer 9 1.1. Diagnostic clinique..9 1.2. Aspects épidémiologiques 9 1.3. Aspects génétiques..9 2. Lésions neuropathologiques de la maladie d Alzheimer.10 2.1. Diagnostic neuropathologique. 10 2.2. Les dégénérescences neurofibrillaires (DNF).11 2.2.1. Aspects morphologiques 2.2.2. Distribution cérébrale 2.2.3. Autres maladies neurodégénératives où sont observées des DNF 2.3. Les plaques séniles 14 2.3.1. Aspects morphologiques 2.3.2. Distribution cérébrale 2.3.3. Autres maladies avec des dépôts d amyloïde 2.4. Autres lésions 15 2.4.1. Perte neuronale 2.4.2. Gliose 2.4.3. La dégénérescence granulovacuolaire (DGV) 3. Les tauopathies...17 3.1. Maladie de Pick...17 3.2. La paralysie supranucléaire progressive (PSP)...19 3.3. La dégénérescence cortico basale (DCB).19 3.4. La démence frontotemporale (DFTP-17).20 4.Le cytosquelette..20
4.1. Microtubules. 20 4.2. Filaments intermédiaires.20 4.3. Microfilaments..20 5.Les protéines Tau.. 21 5.1. Gène.21 5.2. Protéines..21 5.2.1. Structure 5.2.2. Localisation 5.3. Modifications post traductionnelles de la protéine tau 25 5.3.1. Phosphorylation de tau 5.3.2. Glycosylation 5.3.3. Oxydation 5.4. Fonction 27 3 5.5. Mutations de tau..28 5.Les protéines PHF-Tau...29 5.1. Définition..29 5.2. Composition en isoformes de tau.29 5.3. Modifications post-traductionnelles des protéines tau-phf..30 5.3.1. Phosphorylation 5.3.2. Ubiquitination 5.3.3. Glycosylation 5.3.4. Glycation 7. Les protéines présénilines 1 et 2.. 32 7.1. Gène.32 7.2. Protéines... 32 7.2.1. Structure
7.2.2. Localisation cellulaire 7.3. Fonction 33 7.4. Mutations..34 8. La protéine précurseur du peptide amyloïde.36 8.1. Gène.36 8.2. Protéine.36 8.2.1. Structure 8.2.2. Localisation cellulaire 8.2.3. Métabolisme 8.2.3.1. La voie non amyloïdogène 8.2.3.2. La voie amyloïdogène 8.2.3.3. Cheminement de l APP dans la cellule 8.2.3.4. Le peptide amyloïde Aβ 8.2.3.5. Transport axoplasmique 8.3. Fonction 41 8.4. Mutations.41 9. L apolipoprotéine E.42 9.1. Gène..42 9.2. Protéine.43 9.3. Fonction...44 9.4. Relation entre apolipoprotéine E et la maladie d Alzheimer.. 44 10. Les modèles transgéniques de la maladie d Alzheimer 44 10.1. Modèles d amyloidose Aß..44 10.2. Modèles de dégénérescences neurofibrillaires..45 10.2.1. Modèles transgéniques exprimant des isoformes de protéine tau humaine «sauvage» 10.2.2. Modèles exprimant des isoformes de protéine tau mutée 4
II. Objectifs 47 III. Matériel et Méthodes...50 1. Tissus humains...51 1.1. Préparation des tissus..51 1.2. Caractérisation neuropathologique 51 2.Souris transgéniques 52 2.1. Description des transgènes...52 2.2. Etablissement des lignées.53 2.3. Préparation des tissus...53 3. Cultures cellulaires..53 3.1. Technique de culture des cellules CHO...53 3.2. Technique de transfection 53 3.3. Etablissement des lignées stables....54 4. Anticorps.54 4.1. Anticorps primaires..54 4.1.1. Anticorps polyclonaux anti-tau 4.1.2. Anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-phosphotau 4.1.3 Anticorps anti-ps1 4.1.4. Anticorps anti-app 4.1.5. Anticorps Anti-Aβ 4.2. Anticorps secondaires...56 5.Extraction d ARN.57 6. Gel d agarose..57 7. Extraction d ADN.57 8. Electrophorèse sur gel des acides nucléiques..58 9. PCR...58 9.1. PCR-Tau... 59
9.2. PCR-PS1... 59 9.3. PCR-APP.. 59 9.4. PCR-ApoE. 59 10.RT-PCR. 60 10.1. RT-PCR Tau... 60 10.2. RT-PCR Actine... 60 5 11. Préparation des protéines 60 11.1. Homogénats 60 11.2. Préparation des protéines tau 61 11.3. Préparation des protéines PS1... 61 12. Immunoprécipitation des protéines tau.61 12.1. Principe... 61 12.2 Technique 61 13. Electrophorèse sur gel des protéines...62 14. Immunoblotting des protéines...62 15. Méthode TUNEL 62 15.1. Principe...62 15.2. Protocole. 62 16. Fixation des tissus... 63 17. Colorations 63 17.1. Hématoxyline éosine 63 17.2. Imprégnation argentique de Gallyas. 63 17.3. Rouge Congo.. 63 18. Immunohistochimie... 64 18.1. Simple marquage chromogénique. 64 18.2. Double marquage chromogénique. 64
18.3. Double marquage en fluorescence. 65 18.4. Triple marquage 65 19. Microscopie électronique.....65 IV. Résultats..66 1. Effets de la surexpression d une forme mutée de PS1 sur la phosphorylation de tau et son agrégation dans un modèle double transgénique... 67 1.1. Résumé.68 1.2. But du travail..68 1.3. Résultats...69 1.3.1. Génotypage des souris transgéniques 1.3.2. Expression de la protéine tau transgénique 1.3.3. Expression de la protéine préséniline 1 (M146L) transgénique 1.3.4. Analyse statistique 6 1.3.5. Phosphorylation des protéines tau 1.3.6. Expression de la β-caténine 1.3.7. Immunoprécipitation 1.3.8. Immunohistochimie 1.4. Discussion.79 2. Anomalies du cytosquelette neuronal dans des souris transgéniques exprimant une protéine tau humaine et des formes mutées de PS1 et de l APP.87 2.1. Résumé..88 2.2. But du travail...88 2.3. Résultats 88 2.3.1. Génotypage par PCR 2.3.2. Analyse par Western blot
2.3.3. Analyse immunocytochimique 2.3.4. Formation des dépôts amyloïdes dans les souris tau /APP et tau/ps1/app 2.3.5. Analyse de la phosphorylation de tau par immunocytochimie 2.3.6. Modifications neuritiques associées aux dépôts d amyloïde Aβ 2.3.7. Analyse ultrastructurale des plaques amyloïdes et des neurites dystrophiques 2.3.8. Analyse de la phosphorylation de tau par Western blotting 2.4. Discussion.101 3. Etude de l agrégation de tau dans des lignées cellulaires exprimant des formes mutées de tau...119 3.1. Résumé..120 3.2. But du travail 120 3.3. Matériel et méthodes.121 3.3.1. Les plasmides 3.3.2. Préparation des bactéries compétentes 3.3.3.. Transformation des bactéries 3.3.4. Préparation de stock de plasmides 3.3.5. Culture et transfection des cellules CHO 3.3.6. Immunoblotting 3.3.7. Dosage et quantification des protéines 3.4. Résultats 124 3.4.1. Sélection des clones stables 3.4.2. Analyse par immunoblotting 3.5. Discussion.127 4. Analyse du profil des ARNm de tau et des isoformes de protéines tau dans le tissu cérébral de sujets contrôles et de patients Alzheimer 128 4.1. Résumé..129 4.2. But du travail...129
4.3. Résultats 130 4.3.1. Concentration en ARN total dans les régions cérébrales affectées et non affectées 4.3.2. Amplification par RT-PCR du domaine 5 des ARNm de tau 4.3.3. Amplification par RT-PCR du domaine 3 des ARNm de tau 4.3.4. Déphosphorylation des protéines tau présentes dans la fraction soluble d homogénats cérébraux 7 4.3.5. Analyse densitométrique 4.3.6. Génotypage du gène ApoE 4.4. Discussion.140 V. Discussion générale...149 1. Modèlisation transgénique des dégénérescences neurofibrillaires : comparaison entre les différents modèles. 150 1.1. Modèles surexprimant des protéines tau humaines non mutées 150 1.2. Relations entre tau, PS1, GSK-3 βet β-caténine 151 1.3. Modèles exprimant des protéines tau mutées......153 1.4. Les dépôts d amyloïdes βinduisent-ils la formation des DNF? 155 2. Modèlisation cellulaire de la phosphorylation de tau..157 2.1. Etude de la phosphorylation de tau dans des modèles cellulaires..157 2.2. Etude de l agrégation de tau dans des modèles cellulaires non neuronaux. 158 3. Analyse de l expression différentielle des isoformes de tau...159 3.1. Effet des mutations de tau associées aux DFTP-17 sur l expression des isoformes de tau..159 3.2. Distribution cérébrale des ARNm de tau et des isoformes de proteine tau dans des cas sporadiques de MA 160
3.3. Le génotype APOE des sujets contrôles et Alzheimer a-t-il un effet sur le profil d expression des ARNm de tau et des protéines tau? 161 VI. Perspectives.162 VII. Bibliographie...164 Annexes...186