Apport de la biologie moléculaire et de l'odontologie dans l'histoire de la médecine

G. Aboudharam, M. Drancourt et D. Raoult URMITE - UMR CNRS 6236 - IRD 198 Faculté d odontologie Marseille Apport de la biologie moléculaire et de l'odontologie dans l'histoire de la médecine

Collaboration interdisciplinaire Odontologistes Microbiologistes Anthropologistes

Paleomicrobiology: an alternative approach to track bacterial evolution La paléomicrobiologie est un domaine émergent consacrée à la détection, l identification et la caractérisation des micro-organismes dans les vestiges archéologiques. Les données indiquent que l hôte associé à l ADN microbien peut survivre pendant près de 20.000 ans dans son environnement. De l ADN bactérien conservé dans des échantillons de pergélisol a été daté de 400.000-600.000 ans. En plus des tissus mous congelés et momifiés, les os et la pulpe dentaire peuvent être aussi utilisés pour la recherche d'agents pathogènes microbiens. Différentes techniques, y compris la microscopie et l immunodétection, peut être utilisé dans la paléomicrobiologie, mais la plupart des données ont été obtenues en utilisant la PCR basée sur les techniques moléculaires. Les infections causées par des bactéries, les virus et les parasites ont été diagnostiqués en utilisant des techniques paléo-microbiologiques. En outre, le typage moléculaire des agents pathogènes anciens pourraient aider à reconstruire l'épidémiologie des épidémies passées et pourrait alimenter les modèles actuels des infections émergentes, contribuant ainsi à l'élaboration de mesures préventives. [Drancourt M, Raoult D. Nat Rev Microbiol. 2005

Limites des descriptions historiques Disponibilité des sources historiques Traduction et interprétation des textes anciens Nosologie ancienne Approche analogique Données présumées et démonstratives

La Peste d Athènes (430) Thucydide Histoire II, XLVII, 4 La Peste d'athènes Selon François PERRIER (dit Le Bourguignon) Réalisé au 17e siècle Dijon ; musée des beaux-arts Leptospirose et tularémie (Langmuir et al, 1985) Grippe et Staphylocoque (Mercier, 1974) Mélioidose (Warner, 1954) Peste (Poole et Halladay, 1979) Typhus (David, 2000) 5

La Peste d Athènes (430) Thucydide Histoire II, XLVII, 4 La Peste d'athènes Selon François PERRIER (dit Le Bourguignon) Réalisé au 17e siècle Dijon ; musée des beaux-arts Leptospirose et tularémie (Langmuir et al, 1985) Grippe et Staphylocoque (Mercier, 1974) Mélioidose (Warner, 1954) Peste (Poole et Halladay, 1979) Typhus (David, 2000) DNA examination of ancient dental pulp incriminates typhoid fever as a probable cause of the Plague of Athens. Papagrigorakis MJ, Yapijakis C, Synodinos PN, Baziotopoulou-Valavani E. 5 Int J Infect Dis. 2006 May;10(3):206-14. Epub 2006 Jan 1

Matériel humain et microorganismes anciens Matériel environnemental Matériel humain Os Materiaux Inertes Tissus congelés Dents Ectoparasites Tissus momifiés Pulpe dentaire Animaux Tissus fixés

Techniques utilisées pour la détection des pathogènes anciens Observation microscopique Immunodétection et sérologie Isolation and culture Dectection basée sur la PCR et le séquençage de l ADN

Microscopie Bactéries Bartonella bacilliformis Verruga pervana Xe siècle Allison MJ Am J Phys Antrop 1970, 41, 295 Virus Smallpox virus Variole XVIe siècle Fornaciari G. et al. Lancet 1986, ii, 625 Parasites Pediculus capios Pédiculose Ier siècle Capasso L. et al. Lancet 1998, 351,992 Capilaria Capillariose - 3000 ans Bouchet F. Lancet 1997, 349, 256 Isola2on and culture Bacillus spp. 25-40 millions Cano RJ et al. Science 1995, 268,1060] Bacillus anthracis Charbon 1917 Halotolerant bacterium 250 millions Vreeland RH et al. Nature 2000, 407, 897 Immunomarquage Ricke4sia ricke4sie Rocky Mountain spoyed ferver 1901 [Dumler JS JAMA 1991, 265, 718] Treponema pallidum Syphilis XVIe siècle [Fornaciari G. et al. Lancet 1989, ii,614] Trypanosoma cruzi Maladie de Chagas XVIe siècle [Dumler JS JAMA 1992, 339, 128] Molecular iden2fica2on Bactéries non idenofiées 11-425 millions Fish SA et al. Nautre 2002, 417, 132] Mycobacterium tuberculosis Tuberculose Xe siècle [Baron H. et al. J. Archelo. Sci. 1996, 23] idem idem idem Salo WL.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91,2091 Mycobacterium leprae Lèpre Xe siècle Rafin A. et al. Lancet 1994, 343, 1360] Borrelia burgdorferi Maladie de Lyme VIIe siècle - 1884 Matuschka FR. et al. J. Infect. Dis. 1996, 174,424 Enterobactéries - 12 000 ans Rhodes AN. et al. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 651 Escherichia coli - 300 ans Frickere EJ et al. LeY. Appli. Microbiol. 1997, 24, 351 Treponema pallidum XVIIIe siècle Kolman CK. Et al. J. Infect. Dis 1999, 180, 2060 Yersinia pes?s Peste 1590 / 1720 Drancourt M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 12637 idem idem 1348 Raoult D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 23, 12800 Bartonella quintana Fièvre des tranchées 4000 ans J Infect Dis. 2005 Feb 15;191(4):607-11. Epub 2005 Jan 10

Limites des tissus osseux pour la détection par PCR Contamination par la flore tellurique Lavage de l ADN cible par les sédiments Etape de décalcification Difficultés dues aux os

Prévention et contamination en paléomicrobiologie Flore environnementale Flore manu-portée Flore environnementale Témoin positif Précédents amplicons Contamination croisée Risques Prélèvement Extraction de l ADN PCR Mesures préventives Port de gants Nettoyage de la surface externe Utilisation d air filtré Irradiation aux UV Utilisation de la pulpe dentaire Pas de contrôle positif Utilisation d une pièce dédiée Port de gants Utilisation d un témoin négatif pour 3 échantillons Séquençage de tous les amplicons

Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme

Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme MJ Bottero IMEB Marseille Préservation Conservation Extraction de l ADN simple Vascularisation

Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme MJ Bottero IMEB Marseille Préservation Conservation Extraction de l ADN simple Vascularisation Takahashi 1985

Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme Le modèle animal Deux cobayes infectés par Rickettsia rickettsii par voie intrapéritonéale Amplification du fragment Rr 190 70p / Rr 190 602n du gène ompa

Pulpe dentaire bactériémie et microorganisme Modèle cobaye et Coxiella burnetii Day 0 5 10 15 20 guinea pig name A B C D E F G H I J K L M N O PCR Sod - - - - - - - - - - - - - + + PCR IS 1111 - - - - - - - - - + + - + + + Splenn culture - - - - - + + + + - - - - - - Blood culture - - - - - + + - - - - - - - - Caractérisation de Coxiella burnetii dans les différents échantillons de cobaye

Le charnier de la rue Leca (1994-opération LECA 210134602)

M. Serre (1658-1733) Avenue Belsunce pendant la peste à Marseille (Musée du vieux Marseille)

Les dents anciennes

Les cibles moléculaires Le gène pla (plasminogen activator) Plasmide ppcp1 de Yersinia pestis 200 à 300 bp La seconde cible moléculaire: detection d un fragment du gène Rpob of 133 bp (YpED / YpER) de Yersinia pestis

Les limites de la PCR avec l ADN ancien Les contaminations de l ADN Horizontale : ADN moderne Verticale: amplicons L ADN est chimiquement altéré Fragmentation de l ADN 100-300 bp Inhibiteurs de la PCR

La PCR suicide, une réponse à la question des contaminations Pas de témoin contrôle positif Les jeux d amorces sont utilisés une seule fois dans le même laboratoire Un nouveau jeu d amorçes à chaque nouvel essai Possibilité d accession à la séquence du génome bactérien

La peste noire Zones géographiques en Europe infectés par la peste. Progression notée en noir (d après G. Christakosa,, R.A. Oleab,c, H.-L. Yua 2007)

La peste noire

La peste noire Adultes TA1 and TA2 Amplification du fragment: Yp12D/Yp 11R (728-876) du gène pla 15/19 dents positives

Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis

Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis Y. pestis comprend trois biotypes/ genotypes: Antiqua, Medievalis, Orientalis Est-ce que chaque biotype est responsable d une pandémie? Deux génomes de Y. pestis disponibles

Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis MST: Multiple Spacer Typing (Intergenic spacers sequencing)

Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis

Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis Medievalis Orientalis Antiqua

Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis Première Pandémie (Peste Justinienne) Seconde Pandémie (Peste noire) Troisième pandémie (Peste moderne) 541 767 1346 1800 1855 Charniers Sens Dreux Montpellier Datation (5-6 th Century) (12-14 th Century) (1348)

Génotypage des souches anciennes de Yersinia pestis Les expériences ont été menées dans des laboratoires où Y. Pestis n a jamais été introduite «PCR Suicide» Deltal pulp extraction Dental school building A

Détection moléculaire de Y. pestis chez des victimes de la peste Justinienne et de la peste noire en France Première Pandémie Seconde Pandémie Troisième pandémie (Peste Justinienne) (Peste Justinienne) (Peste moderne) 541 767 1346 1800 1855 (Datation) Sens (5-6 th century) Dreux Montpellier (12-14 th century) (1348) Individus 1 2 3 4 5 6 7 8 Expériences Yp1 - - - - + - ND ND Cibles moléculaire Yp8 + + + + + + ND ND #1 Yp3 - + - + ND - - + #2 174290 174300 174310 174320 Y. Pestis CO92 strain individu #202 ATAACGTTTTTCCCAAGTTTAATGGCTACAACGAGTC...C...G...

Diagnostic rétrospectif des maladies transmises par les poux

Diagnostic rétrospectif des maladies transmises par les poux: le typhus

Détection de Rickettsia prowasekii Village de Douai ( 1710 1712 )

Détection de Rickettsia prowasekii Dents anciennes Pulpe dentaire collectée de 1.192 dents/ plusieurs individus de 12 charniers ExtracOon de l ADN avec les tubes MDx Pulpe dentaire collectée de dents/ 21 individus de Douai 55 Detec2on de 7 pathogènes par PCR en temps réel avec sonde TaqMan Appareil 7900 HT B.anthracis, B.recurren?s, B.quintana, R.prowazekii, S.Typhi, Y.pes?s, Poxvirus Detec2on de R. prowazekii 38 dents/ 19 individus PCR en temps réel emboîtée Gène: DNA invertase Pin- like protein ExtracOon de l ADN phenol- chloroform- isoamyl Confirma2on de R. prowazekii 17 dents/ 9 individus «PCR suicide» Gène:Glutamine amidotransferase like protein Génotypage de R. prowazekii 15 dents/ 7 individus PCR en temps réel emboîtée rpme- trnafmet intergenic spacer Séquençage

Détection de Rickettsia prowasekii Dents anciennes Pulpe dentaire collectée de 1.192 dents/ plusieurs individus de 12 charniers ExtracOon de l ADN avec les tubes MDx Pulpe dentaire collectée de dents/ 21 individus de Douai 55 Detec2on de 7 pathogènes par PCR en temps réel avec sonde TaqMan Appareil 7900 HT B.anthracis, B.recurren?s, B.quintana, R.prowazekii, S.Typhi, Y.pes?s, Poxvirus Detec2on de R. prowazekii 38 dents/ 19 individus PCR en temps réel emboîtée Gène: DNA invertase Pin- like protein Confirma2on de R. prowazekii 17 dents/ 9 individus «PCR suicide» Gène:Glutamine amidotransferase like protein La ExtracOon détecoon de l ADN moléculaire phenol- chloroform- de R. prowazekii dans la pulpe dentaire a confirmé scienofiquement isoamyl l épidémie de typhus suspectée à Douai au 18 ème siècle (1710 1712) C est la plus ancienne détecoon de R. prowazekii Génotypage de R. prowazekii 15 dents/ 7 individus PCR en temps réel emboîtée rpme- trnafmet intergenic spacer Séquençage

Dr. Michel Signoli Dr. Armelle Gardeisen Pr. Jean-Pierre Bocquet-Appel Pr. Luigi Fozzati Dr. Cyrille Le Forestier Dr. Dominique Castex Dr. Benoit Clavel Pr. Henri de Lumley Pr. Eric Crubézy Pr. Richard Donat Pr. Olivier Dutour Dr. Raffaella Bianucci Dr. Rozenn Colleter Dr. Sacha Kacki Dr. Philippe Blanchard Dr. Bernard Davoust Merci pour votre attention