Techniques chromatographiques : la CCM - données techniques fondamentales pour réaliser des chromatographies en phase liquide sur couche mince (CCM) ; - applications à des chromatographies d'adsorption en phase liquide sur phase stationnaire solide très fortement polaire (phase stationnaire gel de silice). Voici quelques données théoriques et techniques générales concernant les CCM. 1. Généralités concernant la CCM La CCM correspond à de la chromatographie liquide (la phase mobile est un liquide) pour laquelle la phase stationnaire se présente sous la forme d'une couche plane de faible épaisseur devant sa surface. CCM se traduit en anglais par TLC (thin layer chromatography) En CCM classique on utilise généralement la capillarité comme moteur de la phase mobile ce qui implique l'utilisation de phases stationnâmes présentant une résistance à l'écoulement faible et donc une granulométrie assez élevée et donc une capacité de séparation pas toujours élevée. Mais il existe des système de CCM qui mettent en œuvre des appareillages de pompage de la phase mobile. On peut ainsi utiliser des phases stationnaires de granulométrie faible à très haute performance. On parle alors de HPTLC : high performance thin layer chromatography. Une manipulation de CCM peut se résumer à l'aide du schéma suivant : En CCM, pour un système chromatographique donné (nature de la phase stationnaire et de la phase mobile), chaque analyte révélé possède un Rf (rapport au front de migration) qui lui est propre. En effet, Rf traduit le jeu des rétentions/élutions différentielles avec la phase stationnaires et la phase mobile. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 1/5
Évidemment 2 molécules différentes peuvent avoir le même Rf, attention aux identifications trop rapides... Une molécule absolument non entraînée par la phase mobile conduit à un Rf de 0. Une molécule absolument non retenue par la phase stationnaire conduit à un Rf de 1. Une molécule qui passe statistiquement x% de son temps dans la phase mobile et (1-x)% de son temps retenue par la phase stationnaire conduit à un Rf de x%. Un problème classique rencontré en CCM est le suivant : quelle est la quantité à déposer? Si un dépôt ne contient pas assez de matière on risque d'être en dessous du seuil de détection de la technique de révélation. Si un dépôt est trop chargé, on risque de saturer la phase mobile lorsqu'elle atteindra la ligne des dépôts en début de migration : tout se passera alors comme si on réalisait une suite de dépôts à la queue leu-leu : on observera un effet de traînée. Évidemment la performance d'une CCM dépend du choix de la phase stationnaire, de la phase mobile et de la méthode de révélation face au problème chimique posé. A l'heure actuelle les CCM sont quasiment toutes réalisées sur le support gel de silice (une phase stationnaire très polaire). Le support papier (phase stationnaire = cellulose avec sa couche d'eau liée = phase polaire) est un support historique (mais on peut citer l'analyse œnologique des produits de la fermentation malolactique toujours pratiquée sur papier buvard). Les CCM demeurent aussi des techniques «micropréparatives» intéressantes (par exemple la préparation d'extraits lipidiques) : on «gratte» les spots après migration pour récupérer les analytes qui seront solubilisés dans un solvant adéquat puis on centrifuge pour éliminer le culot de gel de silice. 2. Pratique de la CCM : cas du support gel de silice 2.1. La phase stationnaire gel de silice Le gel de silice est un adsorbant très polaire (il retient donc a priori les motifs polaires par interactions faibles de surface). On l'utilisera donc avec une phase mobile de polarité inférieure. Pour réaliser des CCM très reproductibles sur gel de silice, il convient de travailler avec des gels préalablement déshydratés (élimination de l'eau évaporable adsorbée en surface du gel) par séjour à 110 C. On parle de réactivation du gel pour qualifier cette étape. Ne jamais mettre ses doigts au contact de la plaque CCM! On peut utiliser des gants! Remarque : lorsqu'on réalise des chromatographies sur papier-cellulose, la phase stationnaire est en fait constituée par l'eau liée à la cellulose. Il ne faut donc surtout pas réactiver. 2.2 Préparer la cuve de chromatoqraphie Avec moins de 1 cm de hauteur de phase mobile. Il faut laisser saturer l'atmosphère de la cuve en vapeur de phase mobile ce qui implique une fermeture étanche et du temps... Sinon les migrations seront perturbées par les courants latéraux d'évaporation de la phase mobile. (L'idéal consiste même à tapisser la paroi de la cuve avec du papier imprégné de phase mobile.) 2.3. Organiser la phase stationnaire pour les dépôts Réaliser un tracé au crayon graphite vers 1,5 cm du bord inférieur de la plaque de gel de silice. Prévoir les emplacements des différents spots de dépôt de façon raisonnée judicieuse en sachant que les dépôts doivent être à au moins 0,5 cm du bord de la plaque et distants d'au moins 0,8 cm. Reproduire le plan des dépote sur e compte-rendu de manipulation. 2.4 Réaliser des dépôts convenables Pour des CCM analytiques (non préparatives), le diamètre des spots de dépôts doit être de 2 à 3 mm. Le principe pour réaliser des dépôts convenables est le suivant : - déposer suffisamment de matière à analyser pour avoir des tâches de migration détectées par la technique de révélation (donc cela dépend de la détectabilité de la technique de révélation) ; - ne pas déposer trop, sinon on risque de saturer la solvant de migration lorsqu'il atteindra le spot de dépôt ce qui entraînera une migration avec tramée. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 2/5
Ainsi, l'optimisation des dépôts est empirique et dépend de chaque manipulation. Une règle importante : on peut superposer des dépôts si on pense que les solutions à déposer ne sont pas suffisamment concentrées mais à condition de bien sécher entre chaque application (ceci afin de ne pas étaler les dépôts au lieu de les superposer). On sèche au thermoventilateur. Pour appliquer un dépôt, utiliser un tube capillaire convenablement essuyé ou une pipette automatique réglée vers 0,5µL avec des pointes très fines (dites «crystals»). Tenir le capillaire ou la pointe perpendiculairement à la plaque de CCM, faire attention à ne pas abîmer le support en déposant. 2.5 Placer en cuve et laisser migrer - pas de turbulences, pas de vagues... - vérifier qu'au départ, la Iigne de dépôt est bien au-dessus du niveau de solvant! - refermer immédiatement la cuve après introduction de la plaque ; - laisser migrer tant que le front de phase mobile progresse mais arrêter avant que le front de solvant n'atteigne l'extrémité supérieure de la plaque. 2.6 Révéler la CCM - marquer le front de solvant dès la sortie de la plaque, au crayon graphite ; - évaporer soigneusement la phase mobile de la plaque («séchage» de la plaque) ; - révéler selon la technique ad hoc (avec ses caractéristiques propres de détectabilité et de spécificité...) ; - entourer les spots révélés au crayon, annoter éventuellement au crayon graphite, marquer les centres, calculer éventuellement les Rf (rapports au front de migration). Mise au point d'une phase mobile en analyse par chromatographie sur couche mince (CCM). Séparation et identification des acides aminés d'un mélange pharmaceutique par chromatographie d'adsorption sur couche mince de gel de silice. Le but du travail proposé est de rechercher une phase liquide adéquate pour une analyse CCM de gel de silice destinée à la mise en évidence simple de la composition en acides aminés d'un produit pharmaceutique: le SARGENOR. Ce médicament se présente sous forme d'ampoules buvables de 10 ml d'un mélange d'acide aspartique et d'arginine. Matériel de CCM et réactifs disponibles - Deux plaques de chromatographie de gel de silice (voir les propriétés dans le document de cours). C'est un adsorbant très polaire (elle retient donc a priori les motifs polaires par interactions faibles de surface). On l'utilisera donc avec une phase mobile de polarité inférieure. - Dilution du contenu d'une ampoule de SARGENOR dans 190mL d'eau distillée ; - Solutions aqueuses de différents acides aminés à 1 mg/ml: respectivement leu, val, phe, tyr, arg, asp, pro, lys, ser. - Réactif de révélation à la ninhydrine prêt à l'emploi ; - Les trois solvants permettant de réaliser les phases mobiles: butanol (le moins polaire), acide acétique (à manipuler selon les règles de sécurité, gants, lunettes, hotte) et eau (le plus polaire). - Le matériel pour réaliser les dépôts, une cuve pour les plaques de CCM, une étuve... Manipulations à réaliser Utiliser 2 plaques CCM qui seront préparées à l'identique avec 6 dépôts: 5 acides aminés témoins à sélectionner et du Sargenor. Les deux migrations seront réalisées en utilisant des phases mobiles différentes. L'une d'elles devra être le mélange butanol/acide acétique/eau 70v/20v/10v. L'autre la mélange butanol/acide acétique/eau Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 3/5
30v/20v/50v (donc plus polaire) ou le mélange butanol/acide acétique/eau 90v/5v/5v (donc moins polaire). Mode opératoire pour réaliser les CCM demandées Réactiver le gel de silice à l'étuve à 105 C pendant 30 minutes. Préparer une cuve de migration. Verser au fond de la cuve le solvant de migration, jusqu'à ce que le niveau du liquide dans la cuve atteigne 8 mm de hauteur. Refermer la cuve et attendre 30 minutes, pour que l'atmosphère de la cuve soit saturée (ceci a pour but de limiter l'évaporation de la phase mobile depuis la plaque). Tracer, très légèrement au crayon graphite, une ligne de dépôt à 1,5 cm du bord inférieur de la plaque. Marquer les emplacements des dépôts en les espaçant régulièrement et en veillant à laisser au moins 5 mm de chaque coté de la plaque Pour déposer, utiliser des capillaires préparés par tirage de canne de verre ; on ne conserve que les capillaires réguliers, de section nette, de diamètre convenable (essayer sur du papier filtre). Un capillaire ne sert que pour déposer une seule solution. Ou alors, utiliser des pipettes mécaniques réglées à un volume de 0,5 µl. Un dépôt ne doit pas excéder un diamètre de 3 mm (à cause de l'effet d'étalement lors de la migration). Pour cette manipulation, a priori, effectuer les dépôts en 3 fois en séchant soigneusement entre chaque opération à l'air chaud (sèche-cheveux). Migration : plonger le bord inférieur de la plaque dans le solvant et laisser la migration s'effectuer jusqu'à ce que le front du solvant soit à quelques mm du bord supérieur de la plaque. En fin de migration, sortir la plaque, marquer immédiatement le front du solvant au crayon graphite. Sécher la plaque au four. SOUS UNE HOTTE ASPIRANTE, pulvériser le réactif à la ninhydrine sur la plaque en position légèrement inclinée, attendre 2 minutes et porter la plaque à l'étuve à 105 C pendant 3 à 4 minutes (il est aussi possible de passer le réactif de révélation au pinceau perpendiculairement à la direction de migration). Compte-Rendu : Pour chaque manipulation réalisée : - Composition exacte de la phase mobile utilisée ; plan des dépôts, mode opératoire exact de réalisation des dépôts (en 1, 2, 3, 4 fois...) ; résultats obtenus (entourer les spots révélés d'un léger trait de crayon et fournir la plaque ou un calque du résultat. Calculer les Rf (rapport au front de migration) de chaque tâche) - Analyse critique. Peut on justifier a posteriori la migration différentielle des acides aminés témoins testés lors de chaque manipulation (utiliser vos connaissances quant à la nature chimique des chaînes latérales des acides aminés et éventuellement les données du document annexe)? Quelle phase mobile est la plus performante? Peut on justifier les différences de migration obtenues par l'analyse de la composition des 2 phases mobiles différente utilisées? Justification du choix des acides aminés témoins. Que peut-on dire sur la composition en acides aminés du SARGENOR? Donner la réaction chimique de révélation. Document annexe : Le document expose des résultats publiés par J. Kyte et R. Doolittle dans A simple method for displaying thé hydropathic character of a protein ; Journal of molecular biology, mai 1982, 157 n 1, 105-132. Les auteurs on établi une échelle d'hydropathie (hydrophilie ou hydrophobicité plus ou moins marquée) des chaînes latérales R des aminoacides fondée sur la combinaison de 3 critères : - un critère enthalpie libre. D'après des données pratiques et des calculs thermodynamiques, l'enthalpie libre standard de transfert des différentes chaînes carbonées de formule RH depuis la phase solution aqueuse vers la vapeur condensée est calculée (des valeurs négatives marquent l'hydrophobicité, des valeurs positives l'hydrophilie) ; - deux critères statistiques à partir d'une base de données de 12 structures conformationnelles protéiques globulaires connues. Pour chacune des chaînes latérales des 20 acides aminés, il a été calculé sa proportion dans la localisation à plus de 95% enfoui dans la structure ainsi que dans la localisation à 100% enfoui. Plus une proportion est élevée plus l'acide aminé est statistiquement hydrophobe. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 4/5
Les valeurs des différents critères ont été normalisées pour se distribuer chacune entre -4,5 et 4,5. L'échelle finale obtenue résulte en principe de la moyenne pour chaque acide aminé des valeurs des trois critères. Le tableau ci-dessous présente l'échelle finalement obtenue (l'échelle combinant les i critères est dénommée hydropathy index). [... All values in the last 3 columns result from arbitrary normalisation to spread them between -4,5 and +4,5. The normalization functions where : a -0,679 ΔG transfer en kcal/mol + 2,32. b 48,1 (fraction 100% buried ; Chotia, 1976) 4,50. c 16,45 (fraction 95% buried ; Chotia, 1976) 4,71 Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 5/5