Le dosage de la ferritine Formation des Assistantes médicales mars 2014 Dr M.F. Rossier Service de Chimie clinique & Toxicologie
La ferritine. Macromolécule (PM > 440 kd). Composée de 24 sous-unités: H (Heavy) acides et L (Light) basiques. > 20 isoformes décrites avec des distributions tissulaires spécifiques (foie, rate, moelle, placenta, tumeurs, ). Noyau contient jusqu à 2500 ions Fe 3+ Taux circulants (10-400 µg/l) reflètent les réserves en fer de l organisme MAIS Varient en cas d inflammation (phase aigue), en présence de certaines tumeurs, lors de nécrose cellulaire ou de perturbation de l érythropoïèse. 2
Les valeurs de ferritine Concentrations utiles (en µg/l): -Valeurs de référence 10 400 (H > F) -Déplétion en Fe < 20 -Carence martiale < 12 -Surcharge en Fe > 400* * Exclure syndrome inflammatoire, nécrose ou Ca Chez la femme: -Grossesse diminution -Ménopause augmentation 3
Le dosage de la ferritine par immunodosage 2013: 25 571 dosages de ferritine à l ICHV Cobas e-411 Cobas e-601 4
Pré- et post-analytique Dosage effectué sur: -Sérum (recommandé) -Plasma (possible, mais nécessite une correction > 10%) Stabilité: -7 jours à 4 C -12 mois à -20 C 5
Mesurer des molécules, c est comme Compter sa monnaie. 6
dans l obscurité 7
Méthodes analytiques Anticorps spécifique Spectromètre de masse 8
Les immunodosages 2 modes possibles: - Compétition - Sandwich* 9
Structure des immunoglobulines 150 KDa 10
Principe du dosage immunométrique (en sandwich) 11
Principe du dosage immunométrique (en sandwich) + + Analyte (sample) 1st Antibody (in excess) 2 nd antibody (labeled) + Separation sandwich Bound fraction, complex Free fraction 12
ELISA en méthode sandwich 2 nd Ab, biotinylated enzyme/ streptavidine substrate chromogene colored product 1 st Ab hormone 13
Le système «elecsys» (électrochimiluminescence) 620 nm 14
Immunodosage avec détection par ECL Avantages par rapport à l ELISA: 1) On peut répéter la mesure de nombreuses fois car le complexe de Ru(bpy)3 est régénéré à chaque cycle Amplification du signal Augmentation de la sensibilité 2) On contrôle la durée du signal Augmentation de la précision 15
Specific binding (B/B 0 ) (= detected signal) Courbes de calibration et domaine de dosage B 0 «sandwich» B=50% NSB EC 50 Analyte concentration (log M) 16
Profil de précision et domaine de dosage Ferritine : 0.5 2000 µg/l CV (%) 4% Méthode A Limite tolérable d imprécision Domaine d analyse pour méthode A Concentration de l analyte 17
Limitations des immunodosages 18
L effet crochet dû à un excès d analytes 19
Amélioration par une étape de lavage intermédiaire En cas de suspicion: - Diluer l échantillon - Effectuer un lavage avant le 2 ème anticorps wash Ferritine: pas d effet crochet observé jusqu à 100 000 µg/l 20
Les anticorps interférents Divers types d interférence par anticorps: - Anticorps hétérophiles (ex. HAMA: human anti mouse) - Facteurs rhumatoïdes (anti IgG) - Autres anticorps (ex. anti-streptavidine, anti-ru) 21
Présence d anticorps hétérophiles (HAMA) : ~ 4% mab Surestimation de l analyte Ag mab HAMA Anticorps endogènes hétérophiles Adapted from ahajournals.org 22
Anticorps hétérophiles (HAMA) 23
Prévention des interférences par HAMA Use chimeric or humanized antibodies for the assay Y Add non immune mouse antibodies 24
Questions 25