La recherche primaire

La recherche primaire Acétoacétate réduit la croissance et de la concentration d'atp dans les lignées cellulaires de cancer qui sur-expriment la protéine découplante 2 Eugene J Beaux 1 2 *, Anna Miller 3, Edward V Quadros 2 3, Jeffrey M Sequeira 2 3 etrichard D Feinman 3 *Auteur correspondant: Eugene J Beaux efine@aecom.yu.edu 1Département de médecine nucléaire, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, USA 2Département de médecine, SUNY Downstate Medical Center, à Brooklyn, New York, USA 3Département de biochimie, SUNY Downstate Medical Center, à Brooklyn, New York, USA Pour tous les auteurs des courriels, s'il vous plaît connectez-vous. Cancer Cell internationales 2009, 9 : 14 doi: 10.1186/1475-2867-9-14 Affiliations des auteurs Reçu: 29 Avril 2009 Accepté: 29 mai 2009 Publié: 29 mai 2009 2009 Fine et al; titulaire BioMed Central Ltd Il s'agit d'un article Open Access distribué sous les termes de la Licence Creative Commons Paternité ( http://creativecommons.org/ licenses/by/2.0 ), qui permet l'utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que le travail original est correctement cité. Résumé Fond Des données récentes suggèrent que plusieurs cancers humains sont capables de découplage de la production mitochondriale d'atp en présence d'acide tricarboxylique intact (TCA), enzymes. Le but de la présente étude était de tester l'hypothèse selon laquelle les corps cétoniques peuvent inhiber la croissance cellulaire dans les cancers agressifs et que l'expression de la protéine découplante 2 est un facteur contributif. Le mécanisme proposé implique l'inhibition de la production d'atp glycolytique via un cycle de Randle comme tout augmenté découplage rend cancers incapables de produire de l'atp compensatoire de la respiration. Méthodes Sept lignées cellulaires de cancer humain agressifs, et trois lignes de commande de fibroblastes ont été cultivés in vitro dans 10 mm, soit un milieu de glucose (GM) ou dans 10 mm de glucose plus acétoacétate [G+ AcA]. Les cellules ont été testées pour la croissance cellulaire, la production d'atp et de l'expression d'ucp2. Résultats Il y avait une forte corrélation entre la croissance des cellules avec une concentration de l'atp (r = 0,948) dans un continuum dans toutes les lignées cellulaires. Les contrôles ont montré une croissance cellulaire normale et de l'atp avec la plus faible densité de coloration mitochondriale UCP2 tandis que toutes les lignées de cancer ont démontré une croissance proportionnellement inhibée et l'atp, et la sur-expression d'ucp2 (p <0,05). Conclusion Sept lignées cellulaires cancéreuses humaines cultivées en milieu glucose plus acétoacétate ont montré une réduction étroitement couplé de croissance et la concentration d'atp. Les résultats n'ont pas été observés dans les fibroblastes de contrôle. Le observé une surexpression d'ucp2 dans les lignées cancéreuses, mais pas chez les témoins, fournit un mécanisme moléculaire par lequel plausible acétoacétate évite les cellules normales, mais supprime la croissance des lignées de cancer. Les résultats portent sur le potentiel supposé pour les régimes cétogène que les stratégies thérapeutiques. Fond Otto Warburg a observé que de nombreux cancers perdent leur capacité de respiration mitochondriale, ce qui limite la production d'atp à glycolyse anaérobie [ 1 ]. Le phénomène est particulièrement répandue dans les tumeurs malignes agressifs, dont la plupart sont également hypoxique. L'hypoxie entraîne un déséquilibre stochastique entre le nombre d'espèces mitochondriale réduite vs. l'oxygène disponible, entraînant une augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS), dont la toxicité peut conduire à la mort cellulaire apoptotique. Une adaptation mitochondriale accrue de ROS est sur-expression de la protéine de découplage 2 (UCP2) qui a été rapportée dans un certain nombre de lignées cellulaires de cancer humain[ 2-4]. Horimoto et al.[ 3 ] ont démontré UCP2 sur-expression dans la plupart des lignes 120 de cancer du côlon testé, la mesure en corrélation avec le degré d'agressivité tumorale. L'expression accrue de UCP2 a également été associée à une réduction de la production d'atp dans les tumeurs malignes de la thyroïde oxyphiles[ 2 ], et dans la leucémie de la souris et des lignées cellulaires de lymphome humaines[ 4 ]. Il est raisonnable de se demander si l'on peut profiter de la capacité d'ucp2 de perturber la régulation de la production d'atp dans le cancer comme une méthode thérapeutique. Un mécanisme par lequel les cancers agressifs que UCP2 sur-expriment pourrait inhiber ATP glycolytique est le soi-disant cycle de Randle. Dans les cellules normales, le cycle Randle a été proposé comme un mécanisme par lequel l'augmentation de la disponibilité des acides gras et des corps cétoniques à partir de la lipolyse inhibition de la glycolyse dans le but de maintenir une production stable

de l'atp. Les produits de la lipolyse, selon ce mécanisme, la fourniture d'acétyl-coa pour le cycle TCA intermédiaires dont inhiber la glycolyse[ 5 ]. Nous proposons que les cancers agressifs, dans des conditions de cétose, emploient un cycle de Randle comme pour inhiber la production d'atp glycolytique, mais, contrairement aux cellules normales, ne peuvent pas fournir l'atp mitochondrial compensatoire en raison de découplage. Nous avons trois lignes de culture de fibroblastes humains primaires et sept lignées cellulaires de cancer humain dans les médias de la variation de la glycémie et de la cétone contenu du corps de comparer les taux de croissance des cellules, la concentration d'atp, et l'expression d'ucp2.restriction de lignées de cellules de cancer de côlon et du sein a été conçu pour s'harmoniser avec les types de patients que nous attendons d'être admissible à notre essai clinique en cours de très faible teneur en glucides dans le cancer avancé[ 6 ]. (Le procès est inscrit sur ClinicalTrials.gov, numéro de registre du NCT00444054; avec les informations disponibles àhttp://clinicaltrials.gov/ct2/show/nct00444054 WebCite ). Matériels et méthodes Les lignées cellulaires Lignées cellulaires humaines représentant les cancers du côlon (Lovo, RKO, CaCo2, SW48, SW480) et les cancers du sein (MDA MB 231, MCF7) ont été achetés auprès de l'atcc, et des lignes de commande de fibroblastes humains normaux RFP3, SMI 064 et SMI 065 ont été obtenus à partir d'autres sources. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM avec 10% de sérum de veau foetal et 10 mm de glucose à 4% de CO 2 à 37 C. Les cellules ont été étalées dans des plaques douze puits à une densité de 10 5 par ml dans leurs milieux respectifs, et ont été maintenues pendant 24, 48, 72, et 96 h pour déterminer leurs courbes de croissance. Pour les cellules maintenues en culture des 72 et 96 h, le milieu a été remplacé à 48 h. Les cellules ont été récoltées par traitement à la trypsine et le nombre de cellules et la viabilité ont été déterminées en présence d'un colorant bleu trypan en utilisant un hémocytomètre. Les concentrations de glucose ont été modifiées à partir de 5 mm, 10 mm, 25 mm, 50 mm et 100 mm pour déterminer les conditions optimales de croissance. Toutes les lignées cellulaires ont été incubées plaquées en double ou en triple exemplaire. Matériels DMEM modifié sans glucose, glutamine et pyruvate, 100 NEAA et Lithium acétoacétate (Sigma), le sérum fœtal bovin (GIBCO) 100 glutamine, 100 pyruvate, la trypsine: solution d'edta, le sérum de chèvre normal, 100 solution antibiotique et la détermination de l'atp kit (Gibco / Invitrogen); lapin anti-ucp2 (humain-biolegend); chèvre anti-lapin IgG (H + L)-HRP (Vector Labs). Essais ATP cellulaire et la teneur en protéines La teneur en ATP dans les cellules a été analysée en utilisant un kit de dosage de la luciférase (Sigma). La protéine totale a été dosée à l'aide du kit Biorad protéine d'essai et la teneur en ATP a été exprimée par la cellule, et par mg de protéine cellulaire. Immunohistochimie Les cellules cultivées dans des plaques de 12 puits pendant 96 h ont été dissociées avec de la trypsine à 0,5 ml: solution d'edta, remises en suspension dans un volume égal de DMEM contenant 10% de FBS, on le lave deux fois dans un ml de PBS, suivi par une centrifugation à 2800 rpm pendant 3 minutes. Les cellules ont été remises en suspension dans 4 volumes de PBS, réparties sur aminosilane revêtu diapositives et séché à l'air pendant une nuit. Diapositives doublement PBS-lavées ont été bloquées avec 10% de sérum de chèvre normal dans du PBS pendant 30 min. à la température ambiante. Les lames ont ensuite été incubées dans de lapin anti-ucp2 (humain) Ab dilué à 1:200 dans 10% de sérum de chèvre normal-pbs pendant 2 h à la température ambiante ou une nuit à 4 C. Diapositives lavées dans du PBS ont été incubées dans des dilutions de 1:2000 de chèvre anti-lapin IgG (H + L)-HRP conjugué Ab secondaire dans 10% de sérum de chèvre normal-pbs pendant 1 h à température ambiante, puis lavées dans du PBS à nouveau. Lames ont ensuite été incubées dans le substrat de la peroxydase DAB pour 6-10 minutes, lavés à l'eau, déshydratés par les alcools et les xylènes et couverts avec un milieu Permount et verre lamelle. La quantification de l'ucp2 immunomarquage utilisant ImageJ Tous les types de cellules placées sur une lame ont été simultanément immunocolorées pour UCP2 comme décrit précédemment et photographié à un grossissement de 100 à l'aide d'un Nikon Labophot-2 microscope équipé d'un appareil photo numérique Nikon D70. L'intensité relative des UCP coloration par cellule a été déterminée en utilisant la version 1.39 ImageJ (NIH, États-Unis: pour dernière version supportée voir http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html WebCite ). Brièvement, RGB images composites contenant à la fois des cellules de commande (fibroblastes humains normaux) et diverses lignées de cellules de cancer ont été créés en utilisant Photoshop CS. Les fichiers composites ont été ouverts dans ImageJ et converties en 32 bits des images en niveaux de gris. Suite à cette conversion, le seuil pour l'analyse a été automatiquement choisi pour l'ensemble de l'image composite par ImageJ. Une trame a été ensuite étiré autour de chaque type de cellule dans l'image composite, et une analyse des particules a été réalisée qui a généré les données contenant à la fois du nombre de cellules et l'intensité de la coloration par cellule. Le cadre a ensuite été transféré à un autre type de cellule dans l'image composite et l'analyse ré-exécuté. Tous les résultats ont été rapportés UCP2 selon la méthode de coloration immunologique avec ImageJ analyse de la densité optique. Spécificité de coloration immunologique et la quantification de UCP2 avec dosage ELISA en sandwich Un test ELISA sandwich a été élaboré qui a été dirigée contre des fragments peptidiques très éloignés de UCP2. Détails de préparation seront publiés ailleurs. En bref, l'antigène de UCP2 et UCP2 lapin anti-humain comme anticorps primaire (fragment N- terminale partielle recombinant) ont été obtenus à partir de Biolegend. Un anticorps secondaire pour le dosage en sandwich était de chèvre anti-lapin HRP H & L de Vector Labs. TMB a été amené à réagir avec la peroxydase et l'absorbance a été mesurée à 450 nm. Les résultats de UCP2 par ELISA ont été corrélés avec l'analyse ImageJ pour RFP3, SW48, et MDA MB 231 afin d'évaluer la spécificité de la méthode d'immunomarquage. Statistiques Corrélation de la protéine ATP / mg avec la croissance des cellules a été effectuée en utilisant une régression ajustement des moindres carrés linéaire. UCP2 OD et ATP / mg de protéine ont été comparés entre toutes les lignées cellulaires utilisant ANOVA à

deux voies. Corrélations au niveau p <0,05 ont été considérées comme significatives. Les comparaisons de UCP2 dans les lignes de cancer vs valeurs moyennes fibroblastes ont été effectuées par le test t de Student avec correction de Bonferroni. Résultats L'examen préliminaire de culture de cellules de toutes les lignes montré un pic du taux de croissance de cellules à chaque glucose 10 mm ou 25 mm de glucose par rapport à des concentrations plus élevées ou plus faibles. 50 mm et 100 mm de glucose supprime la croissance des cellules, probablement à partir de l'hypertonie. Quatre-vingt-six heures avant une croissance maximale autorisée saturation de la plaque et a été choisi comme le moment optimal pour le comptage des cellules. On a trouvé que 10 mm de glucose à moyen (GM) était aussi efficace pour promouvoir la croissance comme 25 mm et, parce qu'il est plus proche de concentrations physiologiques humaines, a été choisi pour d'autres tests expérimentaux. Afin de comparer l'effet de l'acétoacétate (ACA) sur la croissance, le nombre de cellules à 96 h dans le glucose combiné plus le milieu acétoacétate (G+ ACA) ont été comparés à 96 h G seul qui a été défini comme 100%. Table1 montre les valeurs de la croissance cellulaire par cette définition et du nombre de cellules absolues. Les valeurs sont également présentés pour ATP / mg cellule et UCP2 que les densités optiques à partir de photographies numérisées de cellules colorées avec de la peroxydase. Tableau 1. 96 h lignées de cellules cultivées dans du glucose 10 mm, soit avec ou sans l'acétoacétate * Spécificité des dosages Le dosage ELISA de type sandwich UCP2 a démontré une relation linéaire de la courbe standard de l'antigène de UCP2 (Biolegend) vs ELISA (r = 0,988) (Figure 1A ). Lysats de RFP3, SW48 et MDA MB 231 ont également été testée à des concentrations variant jusqu'à 1000 fois en excès de protéines totales. La valeur de UCP2 calculée à partir de la courbe standard resté très linéaire (figures1b, C, et1d ), sans preuve d'une liaison non spécifique. Les valeurs d'ucp2 dans les lignées cellulaires testées par ELISA restent dans le même rapport que le procédé de coloration immunologique. OD ImageJ dérivés (y) est en corrélation avec la technique ELISA (x) [y = 122.7x + 13,5; r = 0,93, p <0,01; données non présentées]. Il n'y avait pas de corrélation entre l'expression de la protéine cellulaire et la variation en% en raison de l'acétoacétate ATP (Figure2 ). Figure 1. Spécificité de UCP2 ELISA. (A) courbe standard de l'antigène UCP2 est calibré contre Sandwich ELISA (voir texte). (B) est calculé à partir UCP2 courbe standard dans des lysats cellulaires provenant de RFP3, SW48 et MDA MB 231 (B, C, et D, respectivement).pentes des régressions représentent ng UCP2 par pg de protéine totale. Figure 2. Absence d'inhibition de la protéine non spécifique. Il n'y a pas de corrélation significative entre l'expression de la protéine cellulaire et le% de variation dans l'atp en raison de l'acétoacétate supplémentaire dans le milieu. r 2 = 0,08 (p> 0,2) Les données sont dans le tableau 1. Effets sur la croissance des cellules et la concentration de l'atp des fibroblastes de commande provenant d'un adulte normal (RFP3) et du nouveau-né (MH 064 et 065) ont montré aucune réduction de soit la croissance cellulaire ou la concentration d'atp dans le milieu G+ AcA, alors que toutes les lignées de cancer ont montré des réductions parallèles à l'atp et à la croissance lorsqu'elle est cultivée en G+ AcA (tableau 1 et à la Figure3A ). La réduction de l'atp et de l'inhibition de croissance des cellules montrent une corrélation linéaire de régression des moindres carrés, g = 1.03a 6,5; r = 0,95 (p <0,001) (Figure3B ). Figure 3. (A): L'effet de l'addition de glucose, l'acétoacétate de milieu sur la concentration en ATP et la croissance cellulaire.atp et la croissance cellulaire sont toutes deux exprimées en pour cent des valeurs respectives obtenues à 96 h dans 10 mm de glucose (seul) moyen. M64 et M65 représentent SMI 064 et SMI 065 lignées cellulaires, respectivement. (B) La relation de la croissance cellulaire à la concentration de l'atp. Normale contrôles de fibroblastes RFP3, MCH 064 et 065 (en haut ovale droite) montrent ni inhibition de la croissance, ni la réduction de l'atp. Tous les autres points de données représentent les sept lignées cellulaires de cancer du tableau 1 avec réduction parallèle de l'atp et de la croissance cellulaire comme voir également en figure 3A. croissance des parcelles de l'équation de régression (g) fonction de la concentration de l'atp (a) en bleu en bas à droite de la figure (p <0,01). Les données sont dans le Tableau 1. UCP2 expression de variation affiché à 96 h selon le milieu de croissance (GM vs G + AcA), mais toutes les lignées de cancer ont montré des valeurs supérieures en moyenne, soit par rapport à des fibroblastes (p <0,05) (Figure 4 ). Peroxydase coloration de MDA MB231 est en contraste avec la figure RFP35. Il y avait une relation linéaire inverse entre la concentration de l'atp et de l'expression de l'ucp2 en milieu acétoacétate (Figure6 ; r = 0,66, p <0,05). Figure 4. croissance cellulaire vs expression UCP2 dans des fibroblastes contrôle vs lignées cancéreuses. Série pourpre représente UCP2 dans les cellules cultivées dans un milieu glucose; série bleue représente lignées de cellules cultivées en glucose plus acétoacétate. lignes de cancer plus-express UCP2 vs fibroblastes témoins lorsque cultivées en soit moyen. Les astérisques correspondent aux différences significatives (p <0,05) dans les valeurs de UCP2 pour les cellules cultivées en G ou de milieu de croissance G+ AcA par rapport aux résultats correspondants à partir de toutes les lignées de fibroblastes. Les données sont dans le Tableau 1. Figure 5. expression UCP2 dans les fibroblastes vs MDA MB 231. peroxydase coloration des contrôles RFP3 (en haut) implique moins de cellules et est moins intense que de MDA MB 231 (en bas). Grossissement 100. Figure 6. concentration d'atp en fonction de l'expression d'ucp2. (ATP (y) dans un milieu acétoacétate en fonction de l'expression d'ucp2 (x). [Équation de régression en haut à droite, p <0,05] la plus basse expression d'ucp2 avec la plus grande conservation de l'atp est présent dans les fibroblastes de commande (ovale) SW48 est identifié comme étant. une valeur aberrante. (Les données sont dans le tableau 1). Discussion Les protéines de découplage (UCP de) constituent une famille structurellement liée à la capacité variable à découpler la production mitochondriale d'atp [ 7 ][ 8, 9 ]. Désaccouplement réduit le gradient de protons à travers la membrane mitochondriale interne. UCP1, d'abord découvert chez les rongeurs, est présent dans la graisse brune chez les nourrissons, mais son abondance diminue remarquablement dans la plupart des gens avec l'âge, avec la réduction du tissu adipeux brun.ucp2 a environ 58% d'homologie structurale avec UCP1. Alors que la concentration UCP2 est très faible ou absente dans la plupart des tissus normaux, il a été trouvé pour être exprimé plus fortement dans le vieillissement vs fibroblastes jeunes[ 10 ], dans les îlots pancréatiques de

diabète de type 2[ 11 ], et dans les macrophages de moins de stimulation inflammatoire[ 7, 12 ].Dans tous ces cas, sa présence a été postulé pour représenter une réaction adaptative pour les espèces réactives de l'oxygène (ROS) a augmenté. Il existe une controverse si UCP2 provoque le découplage mitochondrial important ou inhibition ROS[ 13, 14 ]. Il est instructif, cependant, de noter que les tissus avec la plus haute expression de l'ucp2, comme ci-dessus, sont celles qui génèrent une grande ROS; et que les ROS atténuation pourrait s'expliquer par le découplage mitochondrial, un effet observé qu'à de fortes concentrations de UCP2. Les cancers sont parmi les tissus rapportés à exprimer UCP2 dans des concentrations beaucoup plus élevées que les tissus normaux[ 2-4 ]. Notre proposition commence avec l'hypothèse que UCP2 surexpression est une réponse adaptative qui limite de ROS dans les lignées de cancer en provoquant le désaccouplement. La proposition demande si cette hypothèse est confirmée par des résultats cohérents dans des conditions expérimentales spécifiques. Une augmentation de l'ucp2 a été rapportée comme étant associée à une réduction de la production d'atp respiratoire dans plusieurs lignées cancéreuses [ 2, 4 ] qui ont conservé enzymes du cycle de TCA. Horimoto et al[ 3 ] a montré que la sur-expression UCP2 est présente dans la plupart des lignées de cancer du colon, le degré de surexpression corrélation avec le grade histologique. Il a été proposé que la surexpression UCP2 a un mécanisme d'adaptation qui réduit l'apoptose induite par les ROS chez les cellules cancéreuses. Nous suggérons que les corps cétoniques, si métabolisé dans les cancers de ce type, peuvent inhiber glycoloysis et la génération d'atp résultant sans compensatoire mitochondrial production d'atp respiratoire, inhibant ainsi la croissance des cellules. Le cycle de Randle a été proposé il ya plus de 30 ans comme un mécanisme par lequel les produits de la lipolyse (acides gras et les corps cétoniques) inhibent la glycolyse dans les cellules normales, pour maintenir la production d'atp stable [ 5 ]. Selon ce mécanisme, l'acétyl-coa abondante provoque la rétro-inhibition de la pyruvate déshydrogénase et augmente le niveau des intermédiaires de TCA, en particulier le citrate, pour inhiber la phosphofructokinase, les deux procédés en réduisant le taux de glycolyse. La pertinence de métabolisme normal a été contestée par Wolfe et al[ 15, 16 ]. Ces chercheurs ont montré de façon convaincante que la plupart des conditions physiologiques glucides sécrétion d'insuline stimulée augmente intracellulaire disponibilité de glucose. Concentrations de glucose intracellulaire augmentée voiture glycolyse, ainsi que les glucides, par l'effet dominant de l'insuline, devient le régulateur du métabolisme des lipides plutôt dans l'autre sens. Wolfe et al. a souligné que le cycle de Randle n'a été démontré de façon convaincante dans in vitro préparations dans des conditions de euglycémique hyperinsulinémique pince, dans lequel la disponibilité intracellulaire de glucose reste élevé et fixe.dans ces circonstances, dans les préparations du myocarde de rat, par exemple, la disponibilité d'acides gras de variable ne régit en effet le taux de glycolyse. Fait intéressant, la disponibilité de glucose intracellulaire élevée fixe est une condition susceptiblein vivo pour les cellules cancéreuses les plus agressives dont les membranes exprimer une forte affinité insulino-indépendant glucose 1 transporteurs (GLUT1)[ 17 ]. Le Km pour GLUT1, à 18 mg / dl, prédit transport maximale de glucose fixé à des concentrations physiologiques de glucose ordinaire de 60 à 100 mg / dl. Cela contraste avec les tissus humains normaux (par exemple, les myocytes, adipocytes, cellules endothéliales) qui, capable de métaboliser les lipides et les glucides, expriment insulino-dépendant GLUT4. Notre hypothèse suggère que le métabolisme des corps cétoniques dans les cellules surexprimant GLUT1 et UCP2 peuvent fournir l'occasion de l'acétyl-coa et le citrate d'inhiber la glycolyse, tout comme dans le cycle de Randle euglycémique hyperinsulinémique-. Cependant, UCP2 sur-expression diffère du modèle de Randle dans ce découplage empêche compensation mitochondrial complet de la production d'atp. Nous considérons ce un cycle de Randle «inefficace». Preuve d'un tel cycle de Randle inefficace est constaté dans les sept lignées de cancer de notre enquête qui a démontré des réductions parallèles de la concentration de l'atp et la croissance cellulaire, la plus grande inhibition trouvé dans CaCO2 et lignes SW48, et le moins MCF7 (figure 3B). En outre, UCP2 coloration inversement corrélée avec la production d'atp dans toutes les lignées cellulaires (figure4,5 ). Les trois lignées cellulaires de fibroblastes de commande ni démontré l'inhibition de la croissance ni la production d'atp réduite, et ont montré la coloration moins quantitative pour UCP2 parmi toutes les lignées cellulaires mesurées. Les résultats élargissent les observations des enquêteurs précédents et point à un type spécifique d'anomalie mitochondriale, UCP2 sur-expression que dans des conditions de cétose est capable de réduire le taux de certains cancers de la croissance. Nous croyons que les résultats sont également capables de concilier apparemment des résultats contradictoires dans des modèles animaux précédents. Tisdale et al.inhibition de la croissance tumorale chez des souris MAC 16 rapporté sur des régimes cétogènes[18 ] mais l'échec de la cétose pour inhiber Walker carcinosarcome[ 19 ]. Ce dernier n'a pas la tumeur ketotransferase succinyl-coa nécessaire pour métaboliser les corps cétoniques. Le métabolisme des corps cétoniques est requis par la présente hypothèse pour permettre l'inhibition de la glycolyse par l'intermédiaire du cycle de Krebs, et donc absence de cette enzyme serait prévisible à coup sûr pour inhiber la croissance du cancer. Il ya des limites dans la présente étude. L'enquête ne prouve pas une inhibition de la croissance du cancer et la production d'atp en raison de découplage. Une preuve directe nécessite des manifestations du métabolisme acétoacétate ainsi que l'inhibition de la vitesse de production de l'atp, et pas seulement de la concentration de l'atp à l'état stationnaire. Deuxièmement, le glucose et l'acétoacétate ont tous deux été incubés à des concentrations supraphysiologiques à maximiser les effets détectables. Il n'est pas possible sans autre in vivo étude pour prédire les effets dans des conditions physiologiques. En troisième lieu, in vitro, la culture de lignées de cellules primaires est difficile pour les types de cellules humaines normales, et seuls les fibroblastes ont été utilisés comme témoins, de sorte que la réponse d'autres types de tissus normaux n'a pas été mesurée. En outre, les lignes de fibroblastes capables de se développer en culture cellulaire ne sont pas normales; Toutefois, ni sont ils l'équivalent des lignées de cellules malignes et leur différence de lignes malignes a été démontré dans cette enquête. En outre, la gamme de sensibilité de la tumeur à l'acétoacétate est très variable, de manière plausible en raison de l'augmentation des niveaux d'expression de UCP2, mais d'autres facteurs doivent être considérés. Par exemple SW48, avec la plus grande réduction de l'atp et de la croissance des cellules en milieu acéto-acétate, avait une valeur aberrante de premier plan avec l'expression d'ucp2 moins parmi les lignées cellulaires de cancer (Fig.5 ). Enfin, nous n'avons pas manipuler expression UCP2 utilisant knock-down et knock-in techniques. Simples manipulations de protéines, bien que très importante, on ne peut s'attendre à prédire de façon fiable les changements phénotypiques à la lumière de la conscience croissante de la réglementation complexe de rétroaction des réseaux gène-protéine. Nous prévoyons d'explorer ces manipulations dans l'enquête subséquente, jusqu'à présent avoir mis l'accent sur les comportements phénotypiques de sept lignes différentes de cancer, contrairement aux contrôles. Les cancers sont connus pour leur capacité à échapper à la régulation métabolique [ 20 ] et à l'utilisation thérapeutique des inhibiteurs métaboliques a été évitée jusqu'à récemment. Inhibiteurs pharmacologiques spécifiquement ciblées telles que le dichloroacétate[ 21 ] et le 2-désoxyglucose[22, 23 ], celle-ci a proposé à l'origine comme un inhibiteur métabolique en 1960[ 24 ], ont montré des résultats prometteurs dans l'inhibition de la croissance du cancer, bien que la toxicité pour les cellules normales a été une

limitation. Il est intéressant de se demander si la régulation métabolique moins toxique des cellules cancéreuses est possible à la lumière de la réflexion actuelle sur l'évolution du cancer, le développement et la progression[ 25, 20 ]. Nous avons déjà décrit une hypothèse générale portant sur cette[ 6 ] et a proposé, avec d'autres[ 26 ] que les adaptations évolutives humains à la famine rendent les cellules normales tolérantes de sources de nutriments flexibles, y compris les corps cétoniques et les acides gras. D'autre part l'ouverture d'un événement primaire transformation d'une cellule normale en un phénotype pré-malin est suivie d'une longue période de réponse adaptative cellulaire suite à une hypoxie, micro-nutriments privé local. Pendant cet intervalle de croissance cellulaire anormale multiples adaptations éventuellement entraîner dans le phénotype de cancer[ 27 ]. Une réaction typique de l'environnement hypoxique, par exemple, est l'expression de l'insuline-indépendant de GLUT1[ 25, 28 ] déclenchée par HIF 1α[ 29 ] assurer la captation du glucose maximale pour la production de l'atp glycolytique. Cancers solides nécessitent au moins 30 à 35 doublements de générations avant qu'ils atteignent une taille cliniquement détectable de 1-2 cm de diamètre (en supposant que le diamètre de la cellule de mammifère moyenne de 10 microns)[ 30 ] sur des durées de 3 à 15 ans. L'abondance et le faible coût de grain caractéristique de l'agriculture moderne et efficace a fait cétose soutenu un environnement métabolique interne inconnu pour beaucoup de gens vivant dans les pays développés[ 6 ]. Il s'ensuit que dans les grandes cohortes d'individus, la cétose durable n'est pas un micro-environnement familier pour nouvellement évolution des cellules anormales, sur le chemin vers la malignité. Néanmoins, nos tissus normaux restent adaptés à ces micro-environnements comme le montre l'absence de toxicité dans le jeûne expérimental de personnes souffrant d'obésité morbide dans les années 1960[ 31 ]. Dans les cancers humains dans le monde développé, et en l'absence de cétose soutenue comme une pression sélective sur des durées de 30 ou plus de temps de doublement, devrait alors s'attendre à une diversité de réponses évolutives y compris les vulnérabilités accidentelles et les adaptations de survie. Une réponse qui correspondrait à une vulnérabilité accidentelle à la cétose serait sur-expression d'ucp2 avec des enzymes de TCA intactes. Conclusion Nous avons montré que l'acétoacétate ajouté au milieu glucose provoque des réductions variables mais parallèles de la concentration en ATP et la croissance cellulaire dans les sept lignées cellulaires de cancer humain. L'effet se trouve le long d'un continuum avec des fibroblastes de contrôle à un extrême dans lequel la croissance ni de cellulaire est inhibée ni la concentration en ATP réduite. L'effet est en accord avec un cycle de Randle "inefficace" due à une sur-expression de la protéine de découplage 2, vu que dans les lignées de cancer, et est plausible compte tenu des modèles actuels de adaptatif microscopique développement et la progression d'une cellule transformée vers le phénotype du cancer. Plus de travail doit être fait pour prouver l'inhibition métabolique par ce mécanisme. Si elle est avérée, les résultats témoignent du potentiel supposé pour les régimes cétogène que les stratégies thérapeutiques non toxiques, comme adjuvants aux thérapies standards, et aux thérapies de la multimodalité pour améliorer le contrôle de la maladie maligne. Intérêts concurrents Les auteurs n'ont aucun intérêts conflictuels ou concurrentiels à déclarer dans la conception, l'évolution, ou à l'exécution de cette recherche. Des contributions d'auteurs EJF a conçu l'étude, dirigée sa conception primaire et de la coordination, effectué une grande partie de l'analyse des données, et a rédigé et révisé le manuscrit; AM a grandi et compte les cultures cellulaires, a effectué les essais de l'atp, a effectué une analyse substantielle des données et participé à la rédaction de la section Méthodes du manuscrit; EVQ exécution coordonnée de l'étude, a contribué à des aspects importants de la direction de la recherche, et a apporté des modifications importantes à la main; JMS a effectué le test de UCP2 et écrit les modalités de cet aspect de l'œuvre; RDF exécution coordonnée de l'étude, a contribué à des aspects importants de la direction de la recherche, et a apporté des modifications importantes au manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final. Remerciements Le financement de ce projet a été assuré en partie par: La Fondation de recherche de l'état de New York (EJF, RDF et AM) et NIH n DK064732 (EVQ et JMS); et Le C et Veronica Atkins Fondation Robert (EJF, RDF). Aucun des organismes de financement joué aucun rôle dans la conception, l'exécution ou l'interprétation de l'étude, ni dans la préparation ou la soumission du manuscrit. Références Warburg O: Sur l'origine des cellules cancéreuses. Sciences 1956, 123 (3191) : 309-314. PubMed Résumé Editeur Texte intégral Savagner F, Franc B, Guyetant S, Rodien P, P Reynier, Malthiery Y: synthèse de l'atp mitochondrial défectueux dans les tumeurs de la thyroïde oxyphiles. J Clin Endocrinol Metab 2001, 86 (10) :. 4920-4925 PubMed Résumé Editeur Texte intégral Horimoto M, Resnick Mo, Konkin TA, Routhier J, baguettes JR, Baffy G: L'expression de la protéine de découplage-2 dans le cancer du côlon humain. 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