Métrologie des pollens dans l air : étude intercomparative en région Languedoc- Roussillon

Métrologie des pollens dans l air : étude intercomparative en région Languedoc- Roussillon Rapport final ( Janvier 2005

Cette étude a été réalisée par l'unité de Palynologie de l'ecole Nationale Supérieure Agronomique de Montpellier sous la direction de Michel CALLEJA et d'isabelle FARRERA et avec la participation de Tancrède ALMERAS, Paul RICHARD, Odile ROSSI et Denis VERNIER. Avec l'appui scientifique et technique de Jordina BELMONTE et Rut PUIGDEMONT du Laboratoire d'analyses Palynologiques de l'université Autonome de Barcelone. Cette étude a été commanditée par la DRASS Languedoc- Roussillon sous la responsabilité d'isabelle PLAISANT, ingénieur du génie sanitaire, et a bénéficié d'un financement de la DRIRE Languedoc-Roussillon. Les auteurs remercient Bernard CLOT de Météo-Suisse pour ses nombreuses remarques constructives.

INTRODUCTION 4 1 - PRINCIPES D'AEROBIOLOGIE 6 1.1 LE POLLEN 6 1.2 LES METHODES DE MESURE EN AEROBIOLOGIE 7 1.3 - LES ETAPES DE L'AEROBIOLOGIE EN FRANCE 7 2 - ETUDE METROLOGIQUE 10 2.1 - PRESENTATION DES METHODES HIRST ET COUR 10 2.1.1 La méthode Hirst 10 2.1.1.1 Protocole expérimental 11 2.1.1.2 Analyse des prélèvements 13 2.1.1.3 - Estimation des concentrations polliniques 14 2.1.1.3.1. Analyse journalière 14 2.1.1.3.2. Analyse hebdomadaire 14 2.1.2 La méthode Cour 15 2.1.2.1 Protocole expérimental 15 2.1.2.2 Traitement des prélèvements 16 2.1.2.3 Analyse des prélèvements 16 2.1.2.4 - Estimation des concentrations polliniques 17 2.1.2.5 Mesure de la sédimentation pollinique 19 2.2 - ETUDE METROLOGIQUE DES METHODES HIRST ET COUR 19 2.2.1 - Répétabilité de la méthode Hirst et de la méthode Cour 21 2.2.1.1 - Dispositif expérimental 21 2.2.1.2 Résultats - Discussion 21 2.2.1.2.1 - Richesse taxonomique 22 2.2.1.2.2 - Concentrations polliniques 23 A - Approche statistique 24 A - 1 - Choix de la méthode 24 A - 2 - Application 26 A 2 a Méthode Hirst 26 A 2 b Méthode Cour 29 A - 3 - Conclusion 30 B - Analyse des données 30 B 1 - Méthode Hirst 31 B 2 - Méthode Cour 32 C Discussion 33

2.2.2 - Comparaison des méthodes Hirst et Cour 34 2.2.2.1 - Dispositif expérimental 34 2.2.2.2 - Résultats 35 2.2.2.2.1 - Richesse taxonomique 35 2.2.2.2.2 - Concentrations polliniques 36 2.2.2.3 - Discussion 38 2.2.3 - Conclusion 41 2.3 AVANTAGES ET INCONVENIENTS DES METHODES HIRST ET COUR 41 2.3.1 - Coût du matériel 41 2.3.2 - Installation du matériel 42 2.3.3 - Taille de l'échantillon d'air analysé 43 2.3.4 - Erreur de mesure (justesse, biais) 44 2.3.5 - Montage, analyse et "pas de mesure" 45 2.3.6 - Niveau de détermination 47 2.3.7 - Conservation et perte des échantillons 47 2.3.8 - Pannes 48 2.3.9 - Récapitulatif 49 3. ETUDE COMPARATIVE D IMPLANTATION DES CAPTEURS EN LANGUEDOC- ROUSSILLON 50 3.1 CONSIDERATIONS METHODOLOGIQUES 50 3.2 CADRE DE L ETUDE ET DISPOSITIF EXPERIMENTAL 53 3.3 CONTROLE QUALITE DES DONNEES POLLINIQUES 54 3.4.1 - Richesse taxonomique 57 3.4.2 - Concentrations polliniques 59 3.4.2.1 - Analyse en composante principale 59 3.4.2.2 - ACP élargie 60 3.4.2.3 - Comparaison inter-sites dynamique 62 4.5 CONCLUSION 64 4 - CONCLUSION - PERSPECTIVES 65 BIBLIOGRAPHIE 72 CONCLUSION 75

INTRODUCTION La prévalence des pathologies allergiques et des pollinoses en particulier n a cessé d augmenter au cours des dernières décennies dans les pays industrialisés. Les études épidémiologiques récentes soulignent l'augmentation rapide du nombre d'habitants sujets à ces maladies allergiques qui causent non seulement une souffrance et un handicap pour les personnes sensibilisées mais encore un préjudice financier élevé pour les collectivités. En France, le suivi du contenu sporopollinique de l'air est aujourd'hui assuré par le Réseau National de Surveillance Aérobiologique qui diffuse chaque semaine un bulletin allergo-pollinique national. Les informations communiquées permettent de suivre le déroulement de la pollinisation et de mettre en relation, a posteriori, des concentrations polliniques avec des symptômes allergiques. De nombreuses méthodes sont aujourd'hui utilisées en Aérobiologie pour le suivi du contenu sporopollinique de l'air. En Europe, la méthode Hirst (1952) est couramment utilisée par les différents réseaux aérobiologiques. Le RNSA a opté pour cette méthode mais d'autres méthodes, comme celle mise au point par Pierre Cour (1974), sont régulièrement utilisées en France métropolitaine et dans les DOM-TOM comme pour le suivi des ambroisies dans la vallée du Rhône (Réseau SARA : Surveillance Ambroisie Rhône-Alpes) ou l'établissement de calendriers polliniques. En Amérique du Nord, le Rotorod et la méthode Hirst sont généralement utilisés pour les mesures aérobiologiques. Les problèmes d allergie liés à la qualité de l air, et notamment à la présence de pollen, constituent une préoccupation croissante en matière de santé publique. Dans les orientations de son Plan Régional pour la Qualité de l Air, la Région Languedoc- Roussillon1 préconisait la mise en œuvre "d'une étude globale sur les pollens, visant à définir la représentativité des capteurs et ce que devrait être une structure régionale de surveillance". 1 Plan Régional pour la Qualité de l'air approuvé par arrêté préfectoral n 991070 du 16 novembre 1999 4

Pour définir les bases de son futur réseau Régional de suivi du contenu sporopollinique de l'air, la Direction Régionale des Affaires Sanitaires et Sociales du Languedoc-Roussillon a demandé à l'unité de Palynologie de l'ecole Nationale Supérieure Agronomique de Montpellier de réaliser une étude intitulée : "Métrologie des pollens dans l'air : étude intercomparative sur la région Languedoc- Roussillon". Cette étude a un double objectif. Objectif 1 Comparer 2 méthodes de mesure du contenu pollinique de l'air : la méthode Hirst et la méthode Cour. En étudiant en particulier : la répétabilité (mesure de la variance) de chaque méthode ; les écarts entre les résultats des 2 méthodes ; les avantages et les inconvénients de chaque méthode ; Objectif 2 Améliorer les connaissances sur les variations intra-régionales du contenu pollinique de l atmosphère en Languedoc-Roussillon pour : évaluer les différences dans le contenu pollinique de l'atmosphère aux alentours de Nîmes, Montpellier et Perpignan ; fournir des bases scientifiques en vue de définir l architecture du futur réseau régional de mesures polliniques. 5

1 - PRINCIPES D'AEROBIOLOGIE 1.1 LE POLLEN Le pollen est le gamétophyte mâle des plantes à graines, c'est-à-dire la structure qui produit et contient les deux gamètes mâles. Si le terme de pollinisation signifie (sensu lato) le transport des grains de pollen sur le stigmate, dans la pratique courante on lui a donné un sens plus large qui va de la déhiscence des anthères à la fécondation. Pollen de pin Pollen de tournesol La morphologie du grain de pollen est caractéristique de chaque espèce. L'identification repose sur la taille, la forme des grains, le nombre et la forme des apertures et l'architecture extrêmement variée de sa membrane externe (exine). La taille du grain de pollen varie de 5 µm (Myosotis) à 250 µm (conifères), la taille moyenne d'un grain de pollen est de 25 à 35 µm. La membrane externe des grains de pollen est composée de sporopollénine, dont la grande stabilité chimique autorise la conservation des grains dans divers milieux pendant de nombreux millénaires. La production pollinique varie d une espèce à l autre. Alors que les espèces anémophiles, qui utilisent le vent pour assurer leur dissémination pollinique, produisent généralement un nombre important de grains de pollen, les espèces entomophiles, qui utilisent les insectes comme vecteur du pollen, produisent moins de grains. Les différences constatées peuvent être reliées au caractère plus ou moins aléatoire du mode de pollinisation. Pour augmenter leur chance de se reproduire, les espèces anémophiles vont donc produire un nombre considérable de grains de pollen : on a pu évaluer qu un épillet de seigle pouvait libérer en un jour 50 000 grains de pollen et un chaton de noisetier 4 millions. Les espèces anémophiles produiront par ailleurs des grains de pollen plus petits et généralement lisses contrairement aux espèces entomophiles qui auront des grains de pollen plus gros et collants. Ces généralités doivent toutefois être utilisée avec précaution compte tenu du nombre important de contre-exemples qui abondent dans la nature. 6

Les grains de pollen impliqués dans l'induction et le déclenchement de maladies allergiques seront généralement originaires de plantes anémophiles en raison de leur nombre et de la probabilité de les inhaler en abondance. L allerginicité d une espèce dépendra de multiples facteurs comme de la quantité de grains libérés dans l atmosphère et de la présence en plus ou moins grand nombre de molécules allergisantes. Pollen d olivier 1.2 LES METHODES DE MESURE EN AEROBIOLOGIE De nombreuses méthodes ont été développées pour réaliser des mesures du contenu sporopollinique de l'air. Dans ces méthodes, on peut schématiquement différencier celles basées : sur le principe de la sédimentation. Selon le support (lame, boite de pétri, ) différentes méthodes ont été décrites. Les plus connues sont celles de Durham (1946) et de Tauber (1974). Pollen de plantain sur le principe de l'aspiration. La méthode la plus répandue est celle de Hirst (1952) avec les appareils Burkard et Lanzoni. sur le principe de la filtration, avec la méthode de Cour (1974) et son intercepteur pollinique. sur la force d'impact crée par un mouvement d'air (Rotorod de Perkins, Rotorod sampler de Ogden & Raynor, 1967). sur le principe de la reconnaissance des allergènes de l'air à l'aide de marqueurs. Pollen de noisetier 7

1.3 - LES ETAPES DE L'AEROBIOLOGIE EN FRANCE En l'absence de publications scientifiques référencées, il est difficile de retracer avec précision l'historique de l'aérobiologie en France. La grande majorité des travaux ont été réalisés durant la seconde moitié du 20 ème siècle. Toutefois, dès 1945, certains palynologues français comme Madeleine Van Campo ont publié des notes sur des analyses polliniques atmosphériques (Van Campo, 1945). Ces premiers travaux restent cependant imprécis et cantonnés à des observations ponctuelles (le bois de Boulogne). Capteur Durham Capteur Hirst Les premiers enregistrements systématiques datent très probablement de 1955 avec la station de Marseille, mais les mesures restent encore fragmentaires. Ce n'est qu'à partir de 1961, avec les stations de Paris (sur le toit de l'hôpital Rothschild puis à partir de 1962 sur une des terrasses de l'institut Pasteur), de Marseille (sur le toitterrasse de la nouvelle Faculté de Médecine) et de Briançon (sur le toit de l'hôpital civil) que les enregistrements sont réalisés quotidiennement et sur plusieurs années (Charpin et al., 1966). Les résultats obtenus par la méthode gravimétrique de Durham permettent alors d'établir les premiers calendriers polliniques de ces villes. Mais ces résultats restent toutefois représentatifs d'une zone restreinte (méthode extrêmement limitée dans l'espace) et ne fournissent pas d'informations volumétriques (seule la sédimentation pollinique est mesurée avec cette méthode). A la fin des années 60 et au début des années 70 de nouveaux calendriers seront publiés (Lorient, Perpignan, le Mont Dore, ) et la méthode volumétrique de Hirst se généralisera aux dépens de la méthode gravimétrique. Dès la fin des années 1970, un groupe international de recherches aéropalynologiques appliquées est constitué. Un réseau de 13 stations de prélèvement, distribuées depuis le cercle polaire (Station d'abisko) jusqu'à Oran (Algérie), voit le jour. Ce groupe de recherche est le fruit d'une collaboration entre des laboratoires de Palynologie (Montpellier, Stockholm, ), la Clinique des Maladies Respiratoires du CHU de Montpellier et des laboratoires pharmaceutiques (Stallergènes, Fison). La méthode retenue dans le cadre de ce réseau est celle mise au point par Cour à la fin des années 1960 (Cour, 1974). Ce réseau va fonctionner durant trois ans et fournira la 8

première image pollinique de plus de 120 taxa à une échelle continentale (Michel et al., 1979 ; Guérin, 1993). En 1984, le service des Allergènes de l'institut Pasteur, qui commercialise des allergènes, décide de mettre en place un réseau "Pollens" destiné à l'information des allergologues. Avec le désengagement de l'institut Pasteur dans le domaine des allergènes, ce réseau va se restructurer pour évoluer en Réseau National se Surveillance Aérobiologique en mars 1996 (Association loi 1901). La méthode qui sera retenue dans le cadre de ce réseau est la méthode Hirst. Localisation des capteurs du RNSA En 2002, le RNSA est constitué de 49 stations réparties sur l'ensemble du territoire métropolitain. Les stations à vocation allergologique qui utilisent la méthode Cour sont au nombre de 13 en 2002. Elles sont localisées dans la vallée du Rhône (5 stations) ; sur le pourtour méditerranéen (3 stations) et en outre-mer (5 stations). Les stations de Montpellier et Lyon, qui fonctionnent avec la méthode Cour, constituent les 2 plus longues séries polliniques continues françaises (respectivement en fonctionnement sur le même site depuis 1977 et 1982). Intercepteur pollinique de type Cour 9

2 - ETUDE METROLOGIQUE La métrologie, ou science de la mesure, est l'ensemble des techniques et des savoir-faire qui permettent d'effectuer des mesures et d'avoir une confiance suffisante dans leurs résultats. La mesure est nécessaire à toute connaissance, à toute prise de décision et à toute action. Mesurer est indispensable pour la recherche ; toute recherche vise à modéliser les phénomènes, et doit quantifier des grandeurs dans des unités connues et définies. Capteur Burkard et Cour avec anémomètre Les objectifs de l étude métrologique développée dans le cadre de ce chapitre consistent à : décrire les protocoles des méthodes Hirst et Cour ; estimer la précision de deux méthodes de mesure du contenu pollinique de l atmosphère, la méthode Hirst et la méthode Cour ; évaluer les éventuels écarts existant entre les résultats obtenus à partir de ces deux méthodes ; mettre en regard les avantages et les inconvénients de ces méthodes. 2.1 - PRESENTATION DES METHODES HIRST ET COUR 2.1.1 La méthode Hirst Microscope photonique La méthode Hirst, du nom de son inventeur, a été décrite en 1952 dans les «Annals of Appplied Biology». Le principe de cette méthode est basé sur l'aspiration d'un volume d'air connu avec projection des particules (grains de pollen et spores) sur une surface piège. 10

2.1.1.1 Protocole expérimental Plaque protectrice Orifice de captage ECHANTILLONNAGE DES EMISSIONS POLLINIQUES Ta mbo ur avec horloge L'appareil de Hirst est une pompe électrique monté sur une girouette qui prélève par une buse de 14mm x 2mm un volume d'air constant (10 litres d air / minute). Les particules ainsi aspirées sont piégées sur une lame de microscope enduite de vaseline qui défile verticalement à raison de 2mm / heure. Alime ntation électrique Méthode Hirst Nomb re de grai ns de poll en par mètre cu be d'air 1 jour MONTAGE DE LA BANDE ADHÉSIVE PIÉG EANT LES GRAINS 1 jour 2 jo ur etc... 1 heure (2mm) ANALYSE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE Dans la version moderne de l'appareil de Hirst (Capteur Burkard ou Lanzoni selon le fabriquant) la lame a été remplacée par une pièce cylindrique, appelé tambour, qui permet de réaliser un prélèvement durant une période de 7 jours. Les grains de pollen aspirés par le capteur, toujours au rythme de 10 litres d air / minute, sont projetés sur une bande de cellophane rendue adhésive. Cette bande, de 19 mm de largeur, est fixée sur le tambour qui défile devant la buse d aspiration du capteur grâce à un mécanisme d horlogerie à une vitesse de 2 mm / h. La buse d'aspiration, de 28 mm 2 de surface utile (2 x 14 mm) 2, est orientée face aux vents dominants à l'aide d'un empenage. Après une semaine de fonctionnement, la bande est découpée en 7 segments qui correspondent à chaque jour de la semaine. Chaque segment est placé dans un milieu de montage 3 solide entre lame et lamelle et analysé directement au microscope photonique (sans aucun traitement). Buse d aspiration Tambour 2 Dans le cas du Burkard, des buses plus petites peuvent être utilisées. 3 Le milieu de montage est composé de gélatine, glycérine et eau distillée 11

Echantillon monté entre lame et lamelle En France, le milieu d'enduction, qui permet l'adhérence des grains de pollen (et des spores) sur la bande de cellophane, est composé de silicone et de tétrachlorure de carbone (C Cl 4 ). En raison de la cancérogénéité du tétrachlorure de carbone, mais aussi du manque d'adhésion de ce milieu dans certaines conditions thermiques (ou de durée d'exposition), plusieurs études ont été réalisées pour remplacer ce dernier (Comtois & Mandrioli, 1997 ; Galan & Dominguez, 1997 ; Razmovski et al., 1998 ; Alcazar & Comtois, 1999 ; Alcazar et al., 2003). Des bandes pré-enduites de silicone sont aujourd hui commercialisées par Lanzoni et le RNSA. Deux capteurs issus de la méthode Hirst sont aujourd hui employés, les capteurs Burkard et Lanzoni. Capteur Lanzoni Capteur Burkard 12

2.1.1.2 Analyse des prélèvements Les analyses consistent à identifier et comptabiliser les grains de pollen (et / ou les spores) captés durant l'exposition du tambour. Pour les différents taxa 4 identifiés, les résultats sont exprimés en nombre de grains de pollen (et / ou de spores) contenus en moyenne par m 3 d air. Selon l'étude et le laboratoire, les analyses microscopiques, qui ne portent que sur une partie seulement de la lame, sont réalisées par lecture verticale ou horizontale de la lame. lame bande adhésive Mode de lecture Lecture verticale Lecture horizontale Pour obtenir un résultat horaire et journalier, les analyses sont réalisées par lecture verticale de la bande tous les 2 ou 4 mm selon que l'on souhaite un résultat horaire ou bi-horaire. Pour aller plus vite, ou pour avoir une meilleure représentation pollinique, on pratique aussi régulièrement l'analyse horizontale de 2 ou 4 lignes (analyse en continu). Les résultats obtenus seront alors uniquement journaliers. Mais le changement de tambours devra toujours être réalisé à la même heure pour permettre un suivi quotidien des émissions sporopolliniques. Pour remédier à cette perte d'information (perte des données horaires), le RNSA développe actuellement le "système Microvision" qui permet, à l'aide d'une platine couplée à un logiciel d'acquisition de données, d'établir une courbe journalière de pollinisation. Il est également possible d obtenir des résultats bi-horaires avec une lecture longitudinale en utilisant par exemple une lame graduée ou un plastique transparent gradué posé sous la lame. 4 Les caractères morpho-polliniques permettent de faire des déterminations plus ou moins précises selon la famille. Pour prendre en compte ces différents niveaux systématiques on utilise le terme de taxon (taxa au pluriel) 13

2.1.1.3 - Estimation des concentrations polliniques L estimation du nombre de grains de pollen / m 3 d air est obtenu en multipliant le nombre de grains de pollen effectivement comptés par un facteur de conversion. Ce facteur tient compte du volume d'air aspiré et de la surface effectivement analysée. 2.1.1.3.1. Analyse journalière Dans le cas d'une analyse journalière, ce facteur correspond à la surface totale d'un segment de bande (ST = 48 mm x 14 mm (5) ) divisé par le volume d'air capté durant une journée (V = 14,4 m 3 ) multiplié par la surface analysée (SA). La surface analysée correspond au nombre de lignes analysées multiplié par la surface d'une ligne (largeur x longueur). La largeur d'une ligne dépend de l'objectif et des oculaires utilisés. La longueur d'une ligne varie selon que la lecture est horizontale (48 mm) ou verticale (14 mm). Le calcul du nombre de grains de pollen contenus en moyenne par m 3 d'air (Q4) est donné par la formule : ( ) ST Q4 = nx Vx SA avec n = nombre de grains de pollen effectivement comptés Avec un microscope standard (objectif x40 et oculaires x10) et une analyse sur 12 lignes verticales, le coefficient de conversion est de 0,63. Ainsi, 1 grain de pollen effectivement compté donnera une concentration de 0,63 grains / m 3 d air. Dans ce cas, le pourcentage d'observation (rapport entre ce qui est observé et ce qui est capté) sera de 11% et l'observation portera, chaque jour, sur un échantillon de 1,58 m 3 (11% de 14,4 m 3 ). 2.1.1.3.2. Analyse hebdomadaire Lors d une analyse hebdomadaire, la formule utilisée pour le calcul du nombre de grains de pollen / m 3 d air est identique à celle employée pour une analyse journalière. Seuls le volume d air et les surfaces totales et observées changent (multipliés par 7). 5 Cette largeur correspond à celle de la buse d'aspiration et non à la largeur d'un segment de bande (19 mm). 14

Les données hebdomadaires peuvent être exprimées pour 7 m 3 d air en sommant 7 données journalières, ou par m 3 d air en réalisant une moyenne des 7 données journalières. Dans de nombreuses publications les données hebdomadaires Hirst correspondent à un cumul des données journalières. Il est nécessaire de réajuster ces résultats pour les comparer à des données moyennes hebdomadaires provenant d autres méthodes telle la méthode Cour. 2.1.2 La méthode Cour Du nom de son concepteur Pierre Cour, la méthode Cour (1974) recueille les grains de pollen naturellement, sans les aspirer, à l'aide d'une girouette porte-filtre exposée à tous les vents (Intercepteur Pollinique de type COUR). 2.1.2.1 Protocole expérimental L intercepteur pollinique est constitué d une potence (en rotation sur un axe) avec deux cadres porte-filtre verticaux placés à l avant et un empennage (à l arrière) qui permet d orienter l intercepteur face au vent. Sur les cadres, 2 toits inclinés protègent les prélèvements des intempéries. Les flux polliniques sont interceptés par des Unités filtrantes verticales de gaze hydrophile de 20 cm de côté (soit une surface de captage de 40.000 mm 2 ) que l'on glisse dans les cadres porte-filtre. Intercepteur pollinique de type Cour et anémomètre totalisateur Les filtres sont composés de 6 épaisseurs de gaze hydrophile enduites d'huile de silicone et sertis dans un cadre en plastique. Ils sont fabriqués et hermétiquement ensachés dans une atmosphère filtrée à 2µm. Un anémomètre totalisateur placé à proximité de l'intercepteur permet d'évaluer la quantité de vent passé à travers les filtres et ainsi d'estimer les résultats en nombre de grains contenus en moyenne par m 3 d'air. 15

EMISSIONS POLLINIQUES ATMOSPHERIQUES - ECHANTILLONNAGE (A) TRAITEMENTS CHIMIQUES DU SUPPORT FILTRANT (B) 2.1.2.2 Traitement des prélèvements (A2) Influence des facteurs climatiques Variation des émissions polliniques (A1) H2SO 4 HCL (B1) HF (B2) KOH ANALYSES QUANTITATIVE ET QUALITATIVE DES POLLENS LIBERES (C) Après exposition, les filtres sont ensachés, répertoriés et expédiés en vu de leur traitement chimique. Le traitement des filtres, destiné à détruire le support filtrant ainsi que toutes les autres particules piégées en même temps que les grains de pollen et les spores, est effectué dans une salle sous atmosphère filtrée afin d éviter toute contamination pollinique locale. (C1) Variation des températures Méthode Cour (C4) Nombre de grains de pollen par mètre cube d'air (C2) (C3) Les étapes du traitement correspondent à une succession d'attaques à l'acide (H2SO4, FH, HCL) séparées à chaque fois par une centrifugation et un rinçage. Une acétolyse (Erdtman, 1960) permet enfin de vider les grains de pollen de leur contenu cytoplasmique. 2.1.2.3 Analyse des prélèvements A l'issue du traitement, une quantité connue d'eau glycérinée et rajouté au culot résiduel. Le nouveau culot et alors homogénéisé et mesuré à l'aide d'une micropipette. Par différence, il est possible d'évaluer la taille du culot résiduel et une dilution précise de celui-ci est réalisée en rajoutant, au culot homogénéisé, une quantité d'eau glycérinée. Echantillon monté entre lame et lamelle Une fraction elle-même rigoureusement connue de cette préparation 6 est montée entre lame et lamelle en prenant soin de constituer un micro-bassin pour permettre aux grains de pollen de tourner sous l'effet d'une légère pression. Le micro-bassin est obtenu en réalisant, entre la lame et la lamelle, une cale longitudinale à l'aide d'une laque incolore pour la conservation des préparations microscopiques (type hystomount). 6 Le volume de préparation monté entre lame et lamelle est fonction de la taille de la lamelle. Dans le cas d'une lamelle de 22 x 50 mm, le volume est généralement de 50 µl. 16

L'analyse sporo-pollinique consiste à déterminer et comptabiliser les grains de pollen et les spores 7 piégés durant l'exposition des filtres. Elle ne porte que sur une fraction de la préparation microscopique. Selon l'étude, le nombre de lignes analysées est plus ou moins important. Il varie, en règle générale entre 5 et 10 selon la taille du culot et le degré de précision que l'on souhaite obtenir. Dans le cas d'une analyse de grains de pollen allergisants, les analyses sont réalisées avec un objectif x63 et portent généralement sur 5 lignes 8 horizontales réparties sur toute la largeur de la lamelle. 2.1.2.4 - Estimation des concentrations polliniques L estimation du nombre de grains de pollen contenu en moyenne par m3 d air pour une période d exposition considérée tient compte : de la quantité de vent réellement passée à travers le filtre durant son exposition (VP). Compte tenu de son rendement, seul 20% du vent passe à travers le filtre (rendement moyen qui varie entre 17 et 24% selon la vitesse du vent). Il convient donc pour le calcul de la concentration pollinique de prendre 1/5 du vent seulement (Cour, 1974) ; de la superficie de filtre mise en traitement (S). En règle générale seule la moitié du filtre est mise en traitement (soit 200 cm2). L'autre moitié est conservée pour réaliser un contrôle ou faire des analyses complémentaires (mesures des métaux lourds, des minéraux, ) ; du volume de culot monté entre lame et lamelle (v) par rapport au volume total de culot obtenu après dilution (V0) ; de la largeur effectivement analysée (l) par rapport à la largeur utile de la lamelle (L). La largeur analysée est fonction du nombre de ligne et du champ microscopique (objectif x oculaire). Le calcul du nombre de grains de pollen contenus en moyenne par m3 d'air (Q4) est donné par la formule : V0 Q4 = nx v ( x )/( S) avec n = nombre de grains de pollen effectivement comptés L l VP x 5 7 Certaines spores sont détruites ou perdues lors des traitements chimiques. 8 Dans le cas d'une étude agronomique qui nécessite des résultats d'une grande précision, les analyses sont réalisées sur 10 lignes. 17

D'un enregistrement à l'autre, les paramètres d'analyse varient. En situation moyenne, avec une quantité de vent hebdomadaire de 1000 km, un culot de 400 µl et une analyse sur 5 lignes, il faut compter 25 grains de pollen pour avoir une concentration de 1 grain par m 3 d'air. Compte tenu du volume d'air échantillonné et du nombre important de grains de pollen comptés, les résultats peuvent être exprimés en grains de pollen contenus en moyenne par 1000 m 3. Pour avoir, d'un enregistrement à l'autre, des résultats statistiquement comparables, les analyses seront réalisées en tenant compte du pourcentage d'observation (PO). Celui-ci est donné par la formule : v ( x l) PO = x100 V L 0 Pour avoir une analyse représentative, Pierre Cour préconise un pourcentage d'observation minimum de 0,2%. Dans l'exemple présenté précédemment, le pourcentage d'observation est de 0,63%. Si on tient compte du rendement du filtre (20%) et de la surface de filtre mise en traitement (200 cm 2 ), l'observation porte sur un échantillon de 4000 m 3 et l'analyse microscopique (fraction statistiquement représentative de l'échantillon réellement analysée) porte sur 25,2 m 3. Dans le cas où le pourcentage d'observation serait inférieur à 0,2% à l'issue des 5 lignes analysées (cas de culots importants), il convient d'augmenter le nombre de ligne jusqu'au pourcentage requis. Dans certains cas exceptionnels, l'analyse d'une 2 ème lame s'impose pour atteindre le pourcentage d'observation de 0,2%. La durée d'exposition des filtres sera fonction de l'étude à réaliser. A partir de 15 jours d'exposition les filtres peuvent se colmater dans les régions arides caractérisées par une atmosphère chargée en particules minérales. Il est donc préférable de ne pas dépasser cette durée d'exposition pour éviter que le rendement du filtre ne diminue. Dans le cadre d'étude sur le rythme circadien des émissions polliniques (Malaboeuf, 1996) une exposition bi-horaire est préconisée. Celle-ci devra toutefois rester ponctuelle en raison du temps et des coûts mis en œuvre lorsque l'on travaille à cette résolution. La présence de 2 cadres porte-filtre sur l'intercepteur pollinique permet de réaliser une mesure des émissions pollinique à "2 vitesses". Selon le stade phénologique et / ou le degré de précision souhaité, il est en effet possible de réaliser un enregistrement hebdomadaire sur le cadre gauche de l'intercepteur et un enregistrement quotidien sur le cadre droit. 18

2.1.2.5 Mesure de la sédimentation pollinique La méthode Cour peut être également utilisée pour la mesure de la sédimentation pollinique. Dans ce cas, Pierre Cour propose l'utilisation d'un récepteur pollinique. Comparable au pluviomètre de la météorologie, ce récepteur permet une mesure des retombées polliniques à l'aide d'une Unité filtrante horizontale. Les modalités d'exposition, de traitement et d'analyse sont comparables à celles développées dans le cadre de l'intercepteur pollinique à la seule différence que les résultats sont exprimés en nombre de grains de pollen sédimentés par unité de surface. Récepteur pollinique de type Cour 2.2 - ETUDE METROLOGIQUE DES METHODES HIRST ET COUR En aéropalynologie, le paramètre que l on cherche à estimer est le contenu pollinique de l air en un lieu et un temps donnés. Pour obtenir cette estimation, il est nécessaire, outre l utilisation d un capteur à pollen, de faire appel à l ensemble d une chaîne d opérations (le piégeage et la fixation des grains de pollen au niveau du capteur ; le montage des grains de pollen entre lame et lamelle ; l identification visuelle des grains qui peut être variable suivant les pollenanalystes, ) qui sont potentiellement entachées d erreurs et qui induisent, en se cumulant, une différence entre la valeur réelle de la concentration pollinique et son estimation. Caractériser la mesure pollinique ne signifie donc pas caractériser la précision du capteur lui-même mais celle de la méthode de mesure dans sa globalité. 19