Enseignement de Biologie Cellulaire : Biologie Moléculaire Université des Antilles-Guyane Première Année des Etudes de Santé Dr Maryse ETIENNE-JULAN-OTTO IV- La conservation de l ADN 1
Deux Mécanismes La réplication de l ADN La réparation IV- La conservation de l ADN A- La réplication 2
La réplication de l ADN Précède la division cellulaire Duplication de l information génétique qui sera transmise en quantités identiques aux cellules filles : contenu informatif identique à la cellule mère 1 molécule d ADN 2 molécules filles rigoureusement identiques à la molécule de départ La réplication de l ADN (2) Processus complexe Nombreuses activités enzymatiques Bien connue chez les procaryotes Comparable chez les eucaryotes 3
Initiation La réplication de l ADN (3) : différentes étapes Elongation Réactions de liaison et de terminaison Initiation La réplication de l ADN (4) : différentes étapes 1. Reconnaissance d une origine de réplication par un complexe protéique 2. Séparation des brins parentaux 3. Stabilisation provisoire sous forme simple brin 4
Initiation La réplication de l ADN (4 bis) : différentes étapes 4. Initiation de la synthèse des brins fils au niveau d une fourche de réplication Assurée par primosome chez E. coli Elongation La réplication de l ADN (5) : différentes étapes Exécutée par le réplisome (autre complexe protéique) Le réplisome se déplace le long de l ADN parental déroulement synthèse des brins fils 5
La réplication de l ADN (6) : différentes étapes Réactions de liaison et/ ou de terminaison Mécanismes enzymatiques mal connus Suivies de la séparation de la division cellulaire IV- La conservation de l ADN A- La réplication 1) Les enzymes de la réplication 6
Deux types principaux de contraintes 1. Contraintes topologiques ADN sous forme super enroulée nécessité suppression supertours ADN sous forme d une double hélice nécessité de séparer les deux brins 2. Contraintes liées à l orientation antiparallèle des 2 brins a) Les topoisomérases Diminuent considérablement le taux d enroulement de l ADN 2 types : Topoisomérases de type I Se fixent sur l ADN coupent 1 seul des brins déroulement de l ADN réparation Topoisomérases de type II coupent les 2 brins 7
b) Les ADN polymérases Définition : enzymes qui assurent la synthèse d un nouveau brin d ADN à partir d un brin matrice d ADN (ADN polymérase ADN dépendante) Plusieurs ADN polymérases chez les procaryotes et les eucaryotes b) Les ADN polymérases (2) Seules certaines sont impliquées dans la réplication : ADN réplicases Les autres : rôles secondaires dans réplication Réparation ADN (remplacement séquences endommagées) 8
b-1) Les ADN polymérases (3) : caractéristiques communes Additionnent des nucléotides 1 par 1 à une extrémité 3 -OH libre : le choix du nucléotide à intégrer respecte les règles d appariement avec le brin matrice (A apparié à T et G apparié à C) b-1) Les ADN polymérases (4) : caractéristiques communes Fidélité de la réplication : correspond au taux d erreurs commises par les ADN polymérases lors de la synthèse d une molécule d ADN 10-8 à 10-10 (1 erreur par génome pour 1000 cycles de réplication bactérienne ou 10-6 erreur par gène et par génération ) Chaque ADN polymérase a un taux d erreurs caractéristique 9
b-1) Les ADN polymérases (5) : caractéristiques communes Mécanismes de la fidélité de la réplication : pourquoi ce taux d erreurs est il faible? 1. contrôle d erreur présynthétique : contrôle de la base du nucléotide entrant avant son incorporation dans le brin en cours de synthèse b-1) Les ADN polymérases (5 bis) : caractéristiques communes Mécanismes de la fidélité de la réplication (2): 2. Contrôle par correction d épreuve : - Après l incorporation d un nucléotide dans une chaine en cours de synthèse, ce système contrôle la nature de la base. - Les erreurs sont corrigées par l activité 3-5 exonucléolytique qui s exerce dans le sens opposé à la synthèse d ADN. Toutes les ADN polymérases bactériennes possèdent cette activité 3-5 exonucléolytique 10
b-1) Les ADN polymérases (6) : caractéristiques communes Nécessité d une amorce : Fournit l extrémité 3 OH libre Celle-ci est allongée par addition de nucléotides Différents types d amorce b-1) Les ADN polymérases (7) : caractéristiques communes Différentes formes d amorce : 1. amorce ARN synthétisée face à la matrice au moment de la réplication ADN cellulaire, certains virus 2. ARN préexistant dans la cellule et qui s apparie avec la matrice rétrovirus 11
b) Les ADN polymérases (7bis) : caractéristiques communes Différentes formes d amorce : 3. Extrémité 3 -OH produite dans la molécule d ADN double brin par coupure par une endonucléase (voir plus loin) 4. Intervention d une protéine qui présente directement des nucléotides libres à la polymérase : certains virus b-2) Les ADN polymérases des bactéries (procaryotes) Trois ADN polymérases chez E. coli. Les ADN polymérases I et II impliquées essentiellement dans la réparation de l ADN endommagé. L ADN polymérase III, enzyme à multiples sousunités, est la réplicase 12
b-2) ADN polymérase III de E. coli activité réplicase (synthèse des brins d ADN fils lors de la réplication) est assurée par la sous-unité a. activité de correction d épreuves 3-5 exonucléolytique par la sous-unité e. Sous-unités e et a fonctionnent de façon coordonnée; ce qui permet d augmenter l efficacité de la correction d épreuves b-3) ADN polymérases des eucaryotes (1) Multiples Certaines sont dépourvues d activité 3-5 exonucléase 13
b-3) ADN polymérases des eucaryotes (2) ADN polymérases a et d sont des ADN polymérases nucléaires aux fonctions différentes ADN polymérase a ==> initiation de la synthèse des brins d'adn ADN polymérase d ==> allonge les brins naissants b-3) ADN polymérases des eucaryotes (3) ADN polymérases b et e processus de réparation vraisemblablement ADN polymérases g réplication de l ADN mitochondrial 14
ADN polymérase a/primase d e b g Emplacement Nucléaire Nucléaire Nucléaire Nucléaire Mitochondrial Fonction de synthèse Autres fonctions Amorce Synthèse d ADN Nécessité PCNA 3-5 exonucléase Réparation Réparation Réplication 3-5 exonucléase 3-5 exonucléase Inhibiteurs Aphidicoline Aphidicoline Aphidicoline Didésoxy- TTP Didésoxy- TTP Il existe 5 ADN polymérases chez les mammifères (lettres grecques) b-4) Protéines accessoires des ADN polymérases (eucaryotes) (1) Le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) Puissant activateur de l ADN polymérase d. Active aussi l ADN polymérase e mais non indispensable. 15
* b-4) Protéines accessoires des ADN polymérases (eucaryotes) (2) Facteur de réplication A (RF-A) Se fixe sur l ADN simple brin. Indispensable à l action des polymérases a et d. Pourrait être impliquée dans les phénomènes de recombinaison * b-4) Protéines accessoires des ADN polymérases (eucaryotes) (3) Facteur de réplication C (RF-C) Se fixe sur l ADN au niveau des zones où sont synthétisées les amorces. a une activité ATPasique ADN dépendante stimulée par PCNA et RF-A 16
c) Les hélicases Sépare les brins d ADN Utilise l hydrolyse de l ADN comme source d énergie d) La primase ARN polymérase : enzyme qui synthétise un nouveau brin d ARN à partir d un brin matrice d ADN (ARN polymérase ADN dépendante) utilisée uniquement pour la synthèse de courtes séquences d ARN qui sont utilisées comme amorce pour la synthèse d ADN Chez les eucaryotes, la fonction primase est portée par l ADN polymérase a 17
IV- La conservation de l ADN A- La réplication 2) Le déroulement de la réplication L initiation de la réplication entraîne la cellule dans un cycle de division Eucaryotes : celle-ci a lieu pendant la phase S du cycle cellulaire La réplication débute au niveau d une zone précise appelée origine de réplication 18
a-1. L origine de réplication Procaryotes Cairns (1962) A marqué l ADN en le mettant en présence de nucléotides radioactifs. En se répliquant, l ADN incorpore ces nucléotides. Il est alors possible de suivre les molécules marquées et leur réplication grâce à la radioactivité émise (autoradiographie en microscopie électronique) Cette méthode a montré que la molécule d ADN est circulaire chez les bactéries Cairns (1962) a-1. L origine de réplication Procaryotes 1. La réplication débute en un point fixe et unique du chromosome circulaire bactérien. 2. deux fourches de réplication se forment 3. elles se déplacent en sens inverse l une de l autre sur le chromosome 19
a-1. L origine de réplication Procaryotes (2) Cairns (1962) 4. se rejoignent en un point opposé du site d initiation a-1. L origine de réplication Procaryotes(3) Réplication bidirectionnelle (= il y a 2 fourches de réplication) à partir du point d initiation appelé origine de réplication La fourche de réplication est la zone d ADN au niveau de laquelle la réplication est active (synthèse des brins fils d ADN) 20
Autoradiographie Interprétation a-2. L origine de réplication Eucaryotes Marquage ADN puis autoradiographie en microscopie électronique. Origines de réplication multiples car grande quantité d ADN à répliquer 20 à 30 000 chez l homme 21
Autoradiographies Interprétation Réplication bidirectionnelle (2 fourches de réplication), mode le plus fréquent : bactéries, certains phages, certains virus eucaryotes, les cellules de mammifères Réplication unidirectionnelle (1seule fourche de réplication) : certains bactériophages, ADN mitochondrial de souris. 22
L unité de réplication ou réplicon Zone d ADN répliquée à partir d une même origine de réplication 1 réplicon unique chez les procaryotes Plusieurs chez les eucaryotes Eucaryotes : L unité de réplication : le réplicon(2) Plus petits que chez les procaryotes : réplicon 100 à 200 kb chez l homme. Réplication plus lente : 40 mn chez E. coli 6 heures chez les mammifères 23
b) L ADN doit être maintenu sous forme simple brin Les hélicases séparent les brins d ADN Stabilisation des brins d ADN séparés sous forme simple brin : par la fixation des protéines SSB : «Single Strand Binding» Molécule d ADN en cours de réplication 2 types de régions Régions non répliquées sous forme de double hélice Les régions où la réplication est en cours: la fourche de réplication La fourche de réplication se déplace sur l ADN à partir de son point de départ (origine de réplication) 24
c) Synthèse de l amorce ARN (primer) L amorce ARN est synthétisée par la primase qui est associée au primosome chez E. coli Le primosome = complexe composé de multiples protéines : - une ARN polymérase ADN dépendante appelée primase ; - 2 autres protéines activation de la primase complexe capable de synthétiser l ARN ; c) Synthèse de l amorce ARN (primer) (2) Primosome (suite) - de protéines i, n, n, n qui assurent la reconnaissance du site où doit être synthétisée l amorce : leur fixation à l ADN donnerait à celui ci une forme particulière qui permet la fixation des protéines dna B et C et de la primase. 25
Les enzymes de la réplication chez les procaryotes Protéine M en kd Gène Fonction Rep 65 rep hélicase 50 Hélicase III 75 hélicase SSB 74 ssb Stabilisation de 300 l ADN double Protéine i 66 dnat brin 50 Protéine n 28 80 Constitution du Protéine n 76 primosome 70 Protéine n 17 - Protéine dnab 29 dnab 100 Protéine dnac 300 dnac 20 Primase 60 dnag Synthèse ARN primer ADN 760 20 polymérase III Sous-unité a 140 polc Elongation du brin synthétisé et Sous-unité b 37 dnan contrôle de fidélité Sous-unité g 52 dnaz Sous-unité d 32 dnax Sous-unité e 25 dnaq Sous-unité q 10 Sous-unité t 83 ADN 102 pola Maturation du 300 polymérase I Ligase 75 lig brin néoformé Ligation finale 300 50 d) L élongation La fourche de réplication se déplace le long du brin matrice qui est progressivement dénaturé par les hélicases et les brins fils sont synthétisés par la réplicase 26
brin néosynthétisé ADN polymérase sur le brin direct Hélice d ADN parental Protéines se fixant sur l ADN simple brin primase hélicase Amorce d ARN fragment d Okazaki ADN polymérase sur le brin retardé (terminant la synthèse d un fragment d Okasaki) brin néosynthétisé d) L élongation (2) La fourche de la réplication se déplace dans le sens 5 3 sur un brin et 3 5 sur l autre Les ADN polymérases n incorporent des nucléotides qu à une extrémité 3 OH libre (synthèse dans le sens 5 3 ) 27
d) L élongation (3) la synthèse est semidiscontinue d) L élongation (4) Sur le brin précoce, synthèse se déroule de façon continue dans le sens 5-3 à mesure que le duplex parental est déroulé. Les protéines SSB sont chassées au fur et à mesure de l utilisation du brin matrice 28
d) L élongation (5) sur le brin retardé, : une séquence d ADN simple brin doit être exposé puis un segment est synthétisé dans le sens inverse (par rapport au déplacement de la fourche). d) L élongation (6) sur le brin retardé, : - Une série de ces fragments (fragments d OKASAKI) de 1000 à 2000 pb est synthétisée chacun de 5 vers 3 (synthèse discontinue). Ils sont ensuite reliés les uns aux autres pour donner naissance à un brin retardé intact. 29
d) L élongation (7) sur le brin précoce : 1 seul événement d initiation au niveau de l origine sur le brin retardé : série d événements d initiation (1 par fragment d OKAZAKI) initié chacun par un ARN de 10 bases de long ADN néosynthétisé matrice du brin retardé matrice du brin direct 30
e) Finition du brin Destruction des amorces ARN par la RNase H qui détruit les ARN des hybrides ADN-ARN. La lacune engendrée est comblée par l ADN polymérase I La soudure est réalisée par une ADN ligase 31
f) Correction immédiate des erreurs IV- La conservation de l ADN B- La réparation 32
La réplication : insuffisante pour maintien intégrité de l ADN Insuffisante pour conserver rôle de l ADN dans l évolution.. La conservation de l information empêche la dégénérescence rapide Altérations de l ADN : 2 causes La non fidélité de la réplication Les agressions subies par l ADN 33
IV- La conservation de l ADN B- La réparation 1) Les agressions subies par l ADN et leurs conséquences a) Les agressions physiques Rayonnements très énergétiques : Rayonnements cosmiques, Radioactivité Rayonnements moins énergétiques : Rayons ultraviolets. 34
a) Les agressions physiques (2) Les conséquences des rayonnements très énergétiques : Lésions directes modifications de bases, ruptures de brins Conséquences indirectes induisent la production d ions superoxydes O - - chimiquement très réactifs a) Les agressions physiques (3) Les conséquences des Rayons ultraviolets : principalement des dimérisations de thymines adjacentes (création de liaisons covalentes entre nucléotides adjacents) 35
Les dimères de thymine *Action sur l ADN des rayons ultraviolets (soleil) * Des dimères similaires peuvent se former entre 2 bases pyrimidine voisines dans l ADN (C ou T). b) Les agressions chimiques Par des molécules réactives Par des radicaux libres 36
b) Les agressions chimiques (2) Origine de ces molécules Métabolisme propre de la cellule Ex : ions H+ cellulaires et l agitation thermique peuvent retirer jusqu à 10 000 bases puriques par jour et par cellule chez l homme. b) Les agressions chimiques (3) Conséquences Lésions directes: Dépurination Modification de bases [désamination, oxydation, ], Création de liaisons covalentes entre les deux brins. 37
Dépurination de l ADN Désamination Désamination 38
Désamination et dépurination : - deux réactions chimiques les plus fréquentes lésions sévères au niveau de l ADN cellulaire Sites pouvant être modifiés par des lésions oxydatives (flêches rouges), des attaques hydrolytiques (flêches bleues), et des méthylations incontrôlées (flêches vertes) 39
b) Les agressions chimiques (4) Conséquences Lésions indirectes: Drogues intercalantes c) Conséquences des agressions Tout évènement qui modifie de manière irréversible la structure de l ADN par rapport à la double hélice régulière est reconnu comme inacceptable. 40
c) Conséquences des agressions (2) Le changement peut être : une mutation ponctuelle qui transforme une base en une autre, un changement structural qui ajoute un élément volumineux à l ADN ou relie deux bases l une à l autre. c) Conséquences des agressions (3) Le changement d une seule base Affecte séquence mais pas la structure globale de l ADN mésappariement. N empêchent pas la réplication lorsque les brins sont séparés, ni la transcription. Risque pour les générations futures. 41
c) Conséquences des agressions (4) Les modifications structurales Peuvent constituer un obstacle physique à la réplication ou à la transcription : liaisons covalentes entre bases d un même brin d ADN ou entre les bases situées sur des brins opposés. c) Conséquences des agressions (5) Les modifications structurales Exemples : - UV dimérisation de pyrimidines adjacentes - Addition d un groupement volumineux sur une base 42
c) Conséquences des agressions (6) Les modifications structurales Autre cas : Coupure simple brin ou retrait d une base empêche un brin de servir de matrice pour la synthèse d ADN ou d ARN. c) Conséquences des agressions (7) Quel que soit le changement induit Si maintien du composé d addition endommagé dans l ADN maintien des problèmes structuraux et/ou induction de mutations jusqu à ce qu il soit enlevé. 43
2- Cas particulier des méthylations de l ADN La méthylation est la modification la plus courante de l ADN. Existe de manière constitutive Correspond à un marquage informatif de l ADN. A une signification différente chez les procaryotes et chez les eucaryotes. 44
Les méthylations chez les procaryotes (1) L ADN de E. coli contient une petite quantité de 6- méthyladénosine et de 5-méthylcytosine sous l action de 3 systèmes de méthylation Les méthylations chez les procaryotes (2) Infection d une bactérie par un virus Lors de l infection d une bactérie par un virus, celui-ci injecte son ADN dans la bactérie. Pour se défendre, la bactérie détruit l ADN viral grâce à des enzymes capables de cliver l ADN : les endonucléases de restriction Sans protection, l ADN bactérien peut lui aussi, être coupé par ces enzymes 45
Les méthylations chez les procaryotes (2) Rôle de la méthylation chez les procaryotes Protection de l ADN de la cellule hôte contre les clivages par les endonucléases de restriction contrairement aux ADN étrangers qui ne possèdent pas les mêmes systèmes de modification et de restriction. But principal : protection de la bactérie vis à vis des invasions, la source d invasion la plus courante étant le bactériophage. Les méthylations chez les eucaryotes (1) Chez les eucaryotes, la méthylation a pour rôle de distinguer les gènes qui sont dans des conditions fonctionnelles différentes. Voir le chapitre sur la régulation de l expression des gènes 46
IV- La conservation de l ADN B- La réparation 2) Les systèmes de réparation a) Principes de base : Le principe de la réparation est d éliminer les lésions et de revenir à la séquence d origine Le mode le plus courant est le celui du système de réparation par excision-remplacement 47
a) Principes de base (2) Il existe des systèmes qui compensent les conséquences néfastes de l ADN endommagé au cours de la réplication : systèmes de compensation. b) La réparation directe Elle est rare Implique l inversion ou le simple retrait de la lésion. Processus direct et spécifique de chaque altération. 48
b) La réparation directe (2) Cas de la photoréactivation des dimères de pyrimidines : les liaisons covalentes sont défaites par une enzyme dépendante de la lumière : système très répandu dans la nature. Chez E. coli : gène phr enzyme photolyase. c) Le système de réparation par excision 1. Etape de reconnaissance des sites endommagés par des nucléases spéciales (endonucléases) : l endonucléase reconnaît une base endommagée ou un changement dans le parcours spatial de l ADN 2. Excision de la région endommagée de l ADN (exonucléases). 3. Synthése d une séquence de remplacement par d autres enzymes (ADN polymérase, ADN ligase) 49
Nucléases : enzymes qui attaquent l ADN Les endonucléases coupent à l intérieur d une chaine continue d ADN Coupure par une endonucléase Les exonucléases retirent des nucléotides d une chaine nucléotidique à partir d une extrémité libre Excision de nucléotides par une exonucléase c) Le système de réparation par excision (2) Systèmes courants d endonucléases certains reconnaissent des lésions générales dans l ADN, d autres agissent sur des altérations spécifiques des bases : les glycolases reconnaissent les bases endommagées spécifiques, les endonucléases AP reconnaissent les résidus des sites qui ont perdu une ou plusieurs purines 50
c) Le système de réparation par excision (3) Il y a souvent de multiples systèmes de réparation par excision dans un même type cellulaire, et ils s occupent probablement de la majorité des lésions qu ils rencontrent c) Le système de réparation par excision (4) chez E. coli 1. Etape d incision, La structure endommagée est reconnue et clivée de part et d autre de la lésion par une endonucléase, 2. Etape d excision, - Une exonucléase 5 3 enlève une partie du brin endommagé à partir d une extrémité 5 libre. Elle crée ainsi une brèche dans la molécule d ADN 3. Etape de synthèse, - La zone d ADN éliminée est remplacée par l action d une ADN polymérase selon le principe de l appariement des bases. La continuité du brin est rétablie par une ADN ligase 51
d) La réparation des mauvais appariements Il s agit des mauvais appariements qui se produisent lors de la réplication Les bases voisines mal appariées sont détectées. Le système de réparation des mauvais appariements de la réplication considèrent que la mauvaise base est portée par le brin néosynthétisé, le brin fils d) La réparation des mauvais appariements Les 2 brins se distinguent par leur niveau de méthylation : Le brin parental est méthylé Le brin fils ne l est pas Correction préférentielle de la séquence des brins fils néo-synthétisés. 52
d) La réparation des mauvais appariements (2) D autres systèmes s occupent des mauvais appariements produits par la conversion de bases telle qu en provoque la désamination. e) Autres systèmes de réparation Les systèmes de tolérance 53
Chez les bactéries, la plupart des gènes codant pour les enzymes de la réparation font partie d un système de sauvegarde complexe et hautement inter-régulé : le système SOS. Eucaryotes Les systèmes de réparation mal élucidés. Ils sont probablement proches de ceux des procaryotes. Certaines maladies humaines héréditaires donnent une indication de l existence et l importance des systèmes de réparation chez les mammifères : systèmes par excision, système par recombinaison existent vraisemblablement. 54