RAPPORT D ACTIVITE : CRIBLAGE IN VITRO D AGENTS THERAPEUTIQUES DANS DES CULTURES DE CHONDROCYTES Page 1 sur 38 -
BONNES PRATIQUES DE LABORATOIRE L'étude a été réalisée conformément à l'ordonnance française concernant les bonnes pratiques de laboratoires (BPL), adoptée le 14 mars 2000. L'ordonnance française est basée sur les principes de l'ocde de la bonne pratique de laboratoire, comme révisé en 1997 et adopté le 26 novembre 1997 par la décision du Conseil de l OCDE. Les bonnes pratiques de laboratoires forment un système de garantie de qualité portant sur le mode d organisation des études de sécurité non cliniques ayant trait à la santé et à l environnement et sur les conditions dans lesquelles ces études sont planifiées, réalisées, contrôlées, enregistrées, archivées et diffusées. Page 7 sur 38 -
1. Objectifs L objectif de cette étude est d évaluer in vitro l effet de deux molécules seules ou en association après 6 heures, 24 heures et 72 heures de traitement, sur l expression de gènes spécifiques de la matrice extracellulaire cartilagineuse (collagène de type II et agrécane) dans des cultures de chondrocytes primitifs de rat, en conditions «physiologiques» ou «pathologiques inflammatoires» (en présence d interleukine- 1β). L expression d un marqueur de dé-differenciation, le collagène de type I, est également étudiée. A cette fin des tests de quantification de l expression de ces trois gènes (collagène de type II, agrécane et collagène de type I) ont été réalisés par PCR quantitative. Page 12 sur 38 -
2.2 Composés à tester Réception Les composés sont réceptionnés le 16/10/2008. Les produits à tester sont conditionnés dans des flacons en plastique translucide. Ils se présentent sous la forme de poudre de granulométrie homogène. Après identification et codification, les échantillons sont conservés à température ambiante et à l abri de la lumière. Identification des composés - ABS-M-06565-01 - ABS-M-06565-02 Correspondance : - ABS-M-06565-01 : Extrait sec d'ortie titré à minimum 1% en silicium natif. Composé qui se présente sous la forme d une poudre verte - ABS-M-06565-02 : Chondroïtine de faible poids moléculaire (10 à 15000 g/mol). Composé qui se présente sous la forme d une poudre blanche. Fournisseur : 06565 Page 15 sur 38 -
2.3 Conditions testées - Le composé ABS-M-06565-01 seul à 1 µg/ml - Le composé ABS-M-06565-02 seul à 1 µg/ml - Les composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 en association à 1 µg/ml/composé Chaque condition est testée sur des chondrocytes en conditions «physiologiques» et en conditions «pathologiques inflammatoires» (en présence d interleukine-1-β). Une cinétique à 4 temps est réalisée comme précisée ci-dessous : Ensemencement des chondrocytes Traitement Interleukine-1- Récupération des cellules et extraction des ARN T-72 T-48 T-24 T0 T6 T24 T72 Temps (heures) Mise en contact des chondrocytes avec la ou les molécules La manipulation est réalisée réitérée trois fois. Page 16 sur 38 -
3.3 Analyses par PCR quantitative de l expression des gènes après 24 heures de traitement avec les composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02. Il a été observé après 24 heures d'incubation une grande variabilité des valeurs au sein des différents triplicats. Suite à ces observations, les dosages ont été renouvelés à 3 reprises avec l'obtention de valeurs identiques accompagnées d écarts type importants. Cependant, la même tendance a toujours été observée après traitement avec les molécules ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02, seules ou associées. Figure 4 : Taux d expression des gènes codant le collagène de type I (coll I), le collagène de type II (coll II) et l agrécane dans des cultures de chondrocytes primaires de rat cultivés en monocouche en présence (condition "inflammatoire") ou non (condition "physiologique") d'il-1 (10ng/mL) pendant 48h et après 24 heures de traitement avec les composés ABS-M-06565-01 (1µg/mL) et ABS-M-06565-02 (1µg/mL) seuls ou en association. Après 24 heures de traitement, les composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02, seuls ou en association ne semblent pas avoir d'effet sur l'expression des gènes codant le collagène de type I et l'agrécane dans des chondrocytes en condition "physiologique" comparativement au contrôle, excepté l'expression du gène codant l'agrécane qui est diminuée d'un facteur 1,6 après 24 heures de traitement avec le composé ABS-M-06565-02 et d'un facteur 2 après traitement avec l'association des deux composés comparativement au contrôle "physiologique". Page 26 sur 38 -
Dans ces mêmes conditions "physiologiques", l'expression du gène codant le collagène de type II est augmentée après 24 heures de traitement avec les composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 seuls ou en association (augmentations respectives d un facteur 2,6 ; 3,2 et 3,3 comparativement au contrôle physiologique 24 heures). De la même manière qu après 6 heures de traitement, les molécules ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 induisent une augmentation de l expression du gène codant le collagène de type II après 24 heures de mises en contact. Toutefois, l expression de ce gène est plus importante après 24 heures de traitement comparativement à 6 heures. Page 27 sur 38 -
Figure 5 : Taux d expression des gènes codant le collagène de type I (coll I), le collagène de type II (coll II) et l agrécane dans des cultures de chondrocytes primaires de rat cultivés en monocouche en présence (condition "inflammatoire") ou non (condition "physiologique") d'il-1 (10ng/mL) pendant 48h et après 24 heures de traitement avec les composés ABS-M-06565-01 (1µg/mL) et ABS-M-06565-02 (1µg/mL) seuls ou en association. Après 24 heures de traitement, les molécules ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 seules ou associées induisent une augmentation de l expression du gène codant le collagène de type I (augmentations respectives d un facteur 1,5 ; 1,3 et 2,8 comparativement au contrôle "inflammatoire" 24 heures). A l inverse, ces mêmes composés seuls ou associés entrainent une diminution de l expression du gène codant l agrécane (diminutions respectives d un facteur 2,1 et 3,2 comparativement au contrôle "inflammatoire" 24 heures). Page 28 sur 38 -
Lorsque les chondrocytes sont en condition "inflammatoire" puis traités durant 24 heures avec les composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 seuls ou en association, l'expression du gène codant le collagène de type ll a tendance à être augmentée comparativement au contrôle "physiologique" mais également à la condition "inflammatoire" IL-1 seule. De plus, l'association des molécules ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 durant 24 heures induit une augmentation importante de l'expression du gène codant le collagène de type II (augmentation d un facteur de 14,5 comparativement au contrôle "physiologique" et d un facteur 9 comparativement au contrôle "inflammatoire" 24 heures). Le taux d expression du gène codant le collagène de type II, dans ces conditions, est également très supérieur au taux d expression mesuré avec la molécule ABS-M- 06565-01 seule ainsi qu avec la molécule ABS-M-06565-02 seule (augmentation d un facteur 5). L augmentation de l expression de ce gène est également plus importante après 24 heures de traitement comparativement à 6 heures que ce soit en condition "physiologique" ou condition "inflammatoire". Les molécules ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 utilisées seules ou en association pourraient être bénéfiques pour le renouvellement de la matrice cartilagineuse par l'augmentation de l'expression du gène codant le collagène de type II. Cependant ces mêmes molécules ne semblent pas influencer l expression du gène codant l agrécane dans les mêmes conditions expérimentales. Page 29 sur 38 -
Après 6 heures de traitement avec la molécule ABS-M-06565-01, l expression du gène codant le collagène de type I est diminuée de moitié comparativement à la condition contrôle. A l inverse, un traitement avec le composé ABS-M-06565-02 seul ou en associé au composé ABS-M-06565-01, ne modifie pas ou peu l expression du gène codant le collagène de type I comparativement au contrôle "physiologique". L'expression du gène codant l agrécane est augmentée après 6 heures de traitement avec le composé ABS-M-06564-01 seul et ABSM-06565-02 seul respectivement d un facteur 1,6 et 2,3 comparativement au contrôle "physiologique". L association des molécules ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 ne modifie pas l expression du gène codant l agrécane après 6 heures de traitement. L'expression du gène codant le collagène de type II dans les chondrocytes en condition "physiologique" est augmentée comparativement au contrôle en réponse aux composés ABS-M-06565-01 seuls (augmentation d un facteur 1,3) et ABS-M-06565-02 (augmentation d un facteur 2,9), alors qu un traitement de 6 heures associant ces deux composés ne modifie pas l expression du gène codant le collagène de type II comparativement au contrôle "physiologique". Ces résultats peuvent s'expliquer par une grande variabilité cellulaire au sein des triplicats et une sensibilité importante aux différents traitements. En condition "physiologique", les composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 seuls semblent avoir un effet bénéfique sur l expression des marqueurs spécifiques de la matrice cartilagineuse. Page 24 sur 38 -
En effet, dans les conditions expérimentales testées, le traitement simultané par les composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 stimule fortement l'expression du gène codant le collagène de type II en condition "inflammatoire" (augmentation allant dans le sens d une «réparation du cartilage»). Cette augmentation est d autant plus importante que la durée de traitement est grande (dans les conditions testées) mais également est plus importante dans des cultures de chondrocytes mis préalablement en contact avec une cytokine inflammatoire (IL-1 ). Enfin, aucun effet délétère des composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 seuls ou associés n a été détecté sur les chondrocytes en condition "physiologique" dans les conditions expérimentales testées. En conclusion, les résultats obtenus dans cette étude et dans le modèle cellulaire utilisé, mettent en évidence que le traitement de chondrocytes "inflammatoires" par les composés ABS-M-06565-01 et ABS-M-06565-02 seuls ou en association à la concentration de 1µg/mL permet de retrouver un phénotype de chondrocytes en état "physiologique". Page 35 sur 38 -