Méthodes dʼisolement dʼune bactérie, Antibiogramme Emilie Bessède, Laboratoire de Bactériologie, CHU Pellegrin Etapes classiques du diagnostic bactériologique Examen macroscopique Examen microscopique (direct) - numération leucocytaire (état frais) - coloration de Gram Mise en culture du prélèvement Identification +/- antibiogramme 1
Examen macroscopique trouble, GR, débris, odeur Examen microscopique (1) GB, GR, bactéries, levures, cristaux numération leucocytaire 2
Examen microscopique (2) Coloration du prélèvement par la coloration de Gram Morphologie des bactéries - bacilles - cocci Couleur - rose : Gram négatif - violet : Gram positif 3
Streptocoque Méningite à N. meningitidis coloration de Gram 4
Méningite à N. meningitidis coloration de Gram Ensemencement Obtention des bactéries en culture nécessaire à lʼidentification et aux tests de sensibilité aux antibiotiques Milieux de culture adaptés aux bactéries à rechercher - gélosés, ou liquides - ordinaires, enrichis ou sélectifs Incubation dans une atmosphère adaptée Délai de culture variable 5
Techniques d ensemencement en quadrants calibré : quantification des bactéries possible (ECBU, LBA..) Exemple de différents milieux utilisés LBA, Géloses au sang Géloses chocolat Gélose BCP Urines BCP LCR Géloses au sang Géloses chocolat Bouillons 6
Incubation des différents milieux Atmosphère à 37 C plus ou moins enrichie en CO2 Atmosphère anaérobie à 37 C Identification des bactéries Exigences de culture Couleur, aspect, odeurs des colonies - gélosés ou liquides - ordinaires, enrichis ou sélectifs Recherche de caractères respiratoires - oxydase, catalase Recherche de caractères biochimiques - galeries dʼidentification 7
Identification des bactéries Automatisation des identifications Utilisation de galeries automatisées et miniaturisées : Délai de 8 à 24h 8
Principe de la spectrométrie de masse MALDI-TOF Visualisation dʼun spectre 9
Tableau de scores Interprétation des cultures La ou les bactéries isolées sont elles potentiellement pathogènes? La ou les bactéries isolées sont elles en situation pathogène? Réalisation dʼun antibiogramme - en milieu gélosé - en milieu liquide automatisé 10
Lʼantibiogramme C'est la détermination de la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques Intérêt : comparer la valeur de la CMI d'un antibiotique par rapport à celle de deux concentrations critiques c et C (mg/l). Il permet de catégoriser la souche à étudier en confrontant la CMI d'un antibiotique donné à celle de la concentration c ou C Catégorisation clinique: S,I,R Souches Sensibles Probabilité de succès thérapeutique forte en cas de traitement systémique à posologie recommandée (AFSSAPS) Souches Résistantes Forte probabilité dʼéchec thérapeutique quel que soit le type de traitement et la posologie Souches Intermédiaires Succès thérapeutique imprévisible car: - dissociation in vitro - in vivo - mécanisme de résistance faible cédant à une forte concentration locale ou à une augmentation de posologie - recouvre les incertitudes techniques et biologiques 11
Détermination de la CMI Définition : + faible concentration dʼantibiotique qui inhibe tout croissance bactérienne visible à lʼœil nu. En milieu liquide En milieu solide Antibiogrammes E-TEST Non réalisé en routine Antibiogramme en milieu gélosé Réalisation d une suspension bactérienne à partir de la bactérie isolée Ensemencement sur la gélose Dépôt des disques 24h d incubation Lecture l antibiogramme de 12
Lecture des boîtes Catégorisation : diamètre, courbe de concordance, S, I ou R Lʼantibiotique déposé diffuse au sein de la gélose et réalise ainsi un gradient de concentration Le diamètre dʼinhibition autour du disque est proportionnel à la CMI, et comparé au diamètre critique Lecture interprétative, basée sur la connaissance des phénotypes de résistance Exemples d interprétation K. pneumoniae BLSE : image en «bouchon de champagne» 13
P. aeruginosa: détection d'une carbapénémase de la classe B (VIM-2) par la méthode de diffusion (pour les antibiotiques en jaune, apport de 20 µl d'une solution de EDTA) E. coli, hyperproductrice de sa céphalosporinase chromosomique a été examinée d'une part vis-à-vis d'un milieu de Mueller-Hinton normal (à droite) et d'autre part vis-à-vis d'un milieu de Mueller- Hinton supplémentée en cloxacilline (300 mg/l) (à gauche) 14
E-Test Définition : technique de diffusion en gélose qui permet une estimation directe et rapide de la CMI dʼun antibiotique donné vis-à-vis dʼune souche bactérienne Bandelette Sur un côté : échelle de CMI (µg / ml) Autre côté : gradient de concentrations croissantes de lʼab Intérêts des E-tests Validé pour de nombreuses espèces bactériennes Intérêt pour PSDP Glycopeptides (méthode des disques insuffisante) Estimation du niveau de sensibilité dʼune souche en cas dʼinfection grave Coût élevé 15
Antibiogrammes automatisés 80-85 cupules -1 témoin de croissance -3 à 5 cupules/atb pour les Gram -3 à 6 cupules/atb pour les Gram + -ensemencement manuel Bactéries antibiogrammées -entérobactéries et non fermentants -staphylocoques -streptocoques -entérocoques Principe de lecture des ATB Phoenix CMI 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 Détermination de la CMI réelle : - minimum 3 dilutions par antibiotique Technologie basée sur une double lecture : - réaction colorée d un indicateur redox (Bleu Alamar, métabolisme) - turbidité pour mesurer la croissance 16,0 32,0 16
Intérêts et limites des automates Gain de temps Calibration rigoureuse des suspensions bactériennes Estimation réelle des CMI Pas d images de mécanismes de résistance Vérification de la pureté de l inoculum impossible sur l automate Particularités des hémocultures Prélèvement Incubation & détection de la croissance bactérienne automatisées Négatif après 5 jours d incubation, sauf cas particuliers Etat frais Gram Positif Isolement/repiquage sur géloses Résultat rendu négatif Identification des colonies Réalisation dʼun antibiogramme Rendu des résultats 17
Traitement des hémocultures positives Systèmes automatiques alarme 4 étapes 1. Gram 2. Ensemencement sur milieu solide Pas de recommandations Adaptés selon le Gram GS, aérobie, 37 C, 24h GS, anaérobie, 37 C, 48h Chocolat, CO 2, 37 C, 24h BCP, 37 C, 24h 3. Lecture et identification des colonies 4. Antibiogramme Conclusion Automatisation de plus en plus présente au laboratoire de Bactériologie Étape de «pousse» des bactéries inévitable, retardant souvent le diagnostic! Développement de la biologie moléculaire 18
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