TECHNIQUES DE NUMÉRATION DES LYMPHOCYTES T CD4 INFORMATION TECHNIQUE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ

TECHNIQUES DE NUMÉRATION DES LYMPHOCYTES T CD4 INFORMATION TECHNIQUE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ

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NUMÉRATION DES LYMPHOCYTES T CD4 POUR LE VIH/SIDA La récente implantation de traitements antirétroviraux (ARV) abordables et génériques dans les régions à ressources limitées fut une étape importante dans la lutte contre le VIH/SIDA. A la fin de l année 2003, seulement 400 000 personnes vivant dans les régions les plus touchées par l épidémie du VIH avaient bénéficié des ARV. L objectif de l OMS est d offrir les ARV à 3 millions de personnes d ici la fin de 2005 en ciblant les pays les plus affectés par l épidémie du VIH et dont les ressources sont limitées. Cette situation exige de toute urgence une mobilisation mondiale dans le but d accélérer l accessibilité aux traitements et aux soins liés au HIV. Pour y arriver, il faut que les traitements et les outils de suivi en laboratoire soient accessibles. La numération des lymphocytes T CD4 dans le sang périphérique est un outil de laboratoire essentiel au suivi des patients infectés par le VIH. Les lymphocytes T CD4, aussi appelés T auxiliaire «T helper», coordonnent la réponse immunitaire le mécanisme de défense de l organisme contre les microorganismes et certaines formes de cancer. Ce sont les cellules cibles du VIH. L infection par le VIH détruit les cellules T CD4, affaiblissant progressivement le système immunitaire menant ultimement au syndrome d immunodéficience acquise. Le taux de CD4 est un paramètre essentiel au suivi de l infection au HIV De très faibles taux de CD4 indiquent un stade avancé de la maladie et une immunodéficience du mécanisme de défense. Chez les patients infectés par le VIH, la surveillance du taux de lymphocytes T CD4 du sang périphérique permet : - D évaluer le degré de détérioration immunitaire et la rapidité de la progression vers le stade SIDA ; - De définir, à l aide des manifestations cliniques, le moment propice de l initiation de la thérapie antirétrovirale; - D envisager la mise en route de traitements préventifs des infections opportunistes; et - D évaluer l efficacité thérapeutique Chez les sujets adultes, on mesure le taux absolu de lymphocytes T CD4 alors que chez les jeunes enfants et les nourrissons la proportion de lymphocytes T CD4 (pourcentage par rapport aux lymphocytes totaux) est plus instructive. Différentes techniques de numération des lymphocytes T CD4 Actuellement, on trouve deux catégories de techniques de numération CD4 : méthodes manuelles et automatisées. Les méthodes automatisées comprennent la cytométrie en flux et les cytomètres spécialisés. Les méthodes manuelles regroupent les essais qui nécessitent l utilisation du microscope ou du lecteur ELISA. De nouvelles méthodes basées sur microréseau (micro-array) ou sur bandelettes réactives (dipstick) sont présentement en développement et seront probablement commercialisées dans quelques années. Un des défis lié aux techniques alternatives est de bien différencier les lymphocytes T CD4 des monocytes qui possèdent aussi en surface une molécule de CD4. L incapacité à distinguer ces deux populations 1

cellulaires contribuerait à surestimer le taux de CD4, influant sur l accessibilité au traitement de ceux qui peuvent en avoir besoin. Méthodes automatisées Cytométrie en flux En raison de la justesse, de la précision et de la reproductibilité de cette méthode, la cytométrie en flux est considérée comme la méthode de référence pour la mesure des taux de lymphocytes T CD4. Bien que les instruments du commerce proposés par différents fabricants soient coûteux ($US 20-95 000) cette technologie permet d analyser rapidement un grand nombre d échantillons tout en offrant une grande polyvalence d utilisations dans le domaine biomédical, la numération des CD4 n est qu une utilisation parmi tant d autres. La numération des CD4 par cytométrie en flux est relativement complexe, techniquement exigeante et coûteuse. Cependant, de nouvelles techniques de traitement des échantillons ont rendu l utilisation de la cytométrie en flux possible pour les milieux à ressources limitées. Toutefois, la rentabilité de cette technologie demeure étroitement liée à un entretien soutenu. De plus, il est essentiel que les opérateurs de cytomètres en flux soient qualifiés dans tous les aspects techniques et biologiques de la numération CD4. Bien que le coût des instruments constitue un frein à l utilisation répandue de cette technique, la venue prochaine d instruments portatifs simples peut modifier cette situation. La cytométrie en flux présente plusieurs options pour la numération de lymphocytes T CD4 absolue (Tableau 1). Dans les essais à double plateforme, le taux absolu de CD4 est obtenu en combinant le pourcentage de lymphocytes T CD4 du cytomètre en flux à la mesure de lymphocytes totaux de l analyseur hématologique. Dans les essais à simple plateforme, on utilise uniquement le cytomètre en flux pour mesurer à la fois les valeurs relatives et absolues des lymphocytes T CD4. Il y a présentement deux techniques à simple plateforme : les instruments de type volumétrique et l utilisation de microfluorosphères. La complexité de la numération de CD4 par cytométrie en flux varie selon qu on utlilise un panel constitué d un seul tube ou de six, chacun pouvant contenir entre un et quatre réactifs (anticorps monoclonaux). Plusieurs facteurs peuvent influencer la sélection de la méthode appropriée : l âge du patient, les exigences du clinicien, le délai entre le prélèvement et son arrivée au laboratoire, le choix de la plateforme (simple ou double). Les cytomètres spécialisés Les cytomètres spécialisés sont des systèmes conçus exclusivement pour une seule application soit la numération des lymphocytes T CD4 et CD8, et ce, sans l aide des analyseurs hématologiques (Tableau 2). Ces instrument sont plus faciles à utiliser et moins chers que les cytomètres classiques. Cependant, ils n offrent aucune flexibilité dans les analyses ou le choix des réactifs. Leurs coûts d opération peuvent être élevés et la quantité d échantillons qui peut être analysée dans une journée est plus faible. Le FACSCount (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, É.-U.), un système établi selon le principe de la 2

cytométrie en flux, est présentement le seul cytomètre spécialisé qui a été évalué et qui est largement répandu. Depuis peu, différents appareils spécialisés qui ne fonctionnent pas tous selon les principes de la cytométrie ont fait leur apparition sur le marché alors que d autres seront bientôt commercialisés. Méthodes manuelles Les méthodes présentement disponibles utilisent la microscopie optique ou à fluorescence. De plus, elles requièrent d autres équipements tels que les centrifugeuses et les dispositifs magnétiques. Ces tests sont conçus pour répondre aux exigences des laboratoires qui ont peu de ressources et qui ont une très faible quantité d échantillons à traiter. Toutefois, leurs coûts d opération ne sont pas toujours inférieurs aux méthodes automatisées. Le tableau 2 met en évidence la performance de deux méthodes présentement sur le marché. Ces méthodes sont Cyto-Spheres (Coulter Corporation, É.-U.) et Dynabeads (Dynal AS, Norvège). D autres méthodes telles que Capcellia (Bio-Rad, É.-U.), OPTI-CIM (CIMA, Cuba), TRAxELISA (Innogenetics, Belgique), Zymmune (Zynaxis Inc., É.-U.) et le dosage de la phosphatase immunoalcaline ne sont plus commercialisées et/ou sont obsolètes. Résumé En résumé, les technologies couramment offertes pour la numération des lymphocytes T CD4 reposent sur des principes distincts et des caractéristiques opérationnelles différentes. Les facteurs qui devraient guider un laboratoire dans le choix d une technologie appropriée sont la portée de l analyse (routine vs recherche), le groupe d âge des patients (le pourcentage des CD4 requis en pédiatrie), la quantité d échantillons à traiter et les ressources disponibles (financières, humaines et infrastructure). 3

Tableau 1. La cytométrie en flux pour la numération des lymphocytes T CD4 Fabricants Paramètre Plateforme double a Plateforme simple Principe Volumétrique b Principe Microfluorosphères c Partec GmbH (Munster, Allemagne) d Becton Dickinson Coulter Corporation (FL, É.-U.) Partec GmbH (Munster, Allemagne) d Guava Technologies Becton Dickinson Coulter Corporation (FL, É.-U.) Coût de l instrument ($US) 20-95 000 20-70 000 20-95 000 Coût des réactifs/test ($US) 3-11 2-10 8-25 Échantillon Sang total Sang total Sang total Résultats Taux absolu de CD4 Taux absolu de CD8 CD4% et CD8% rapport lymphocytaire Cellules B et NK possible Taux absolu de CD4 Taux absolu de CD8 CD4% et CD8% rapport lymphocytaire Cellules B et NK possible Taux absolu de CD4 Taux absolu de CD8 CD4% et CD8% rapport lymphocytaire Cellules B et NK possible Échantillons traités /jour Jusqu à 200 Jusqu à 50 Jusqu à 200 Avantages Désavantages Précision du pipettage non requise Analyse à un seul tube possible sans problème de CQ Analyseur hématologique requis Sujet aux erreurs de transcription ou de calcul Échantillons frais requis pour la numération absolue Microfluorosphères ou analyseur hématologique non requis Protocoles pour l analyse d échantillons>24hres disponible Précision du pipettage requise Le CQ interne du pipettage requiert deux tubes Instruments n ont pas encore été évalués dans une étude multicentrique indépendante Cellules B et NK sous-populations lymphocytaires; CQ Contrôle de la qualité; EQE Programme externe d évaluation de la qualité Analyseur hématologique non requis Protocoles pour l analyse d échantillons>24hres disponible Précision et exactitude du pipettage requis Le CQ interne du pipettage requiert deux tubes Microfluorosphères sont coûteuses et doivent être manipulées avec soin a Les cytomètres des trois fabricants peuvent utiliser cette plateforme pour mesurer les valeurs absolues puisque les résultats sont le produit du cytomètre et de l analyseur hématologique. b Les instruments volumétriques sont conçus pour mesurer le volume de l échantillon et évaluer directement le taux absolu sans l analyseur hématologique ou les microfluorosphères. c Cette plateforme est compatible avec les cytomètres des trois fabricants. d Les instruments de ce fabricant, incluant CyFlow, n ont pas encore été évalués en tant que plateforme volumétrique de numération de CD4 dans une étude multicentrique indépendante. 4

Fabricant Instrument Tableau 2. Méthodes manuelles et spécialisées pour la numération des lymphocytes T CD4 TECHNOLOGIES SPÉCIALISÉES TECHNIQUES MANUELLES FACSCount CyFlow Counter Cyto-Spheres Dynabeads Becton Dickinson Compteur conçu pour la numération CD4 Partec GmbH (Munster, Allemagne) Compteur conçu pour la numération CD4 Coulter Corporation (FL, É.-U.) Haemocytomètre Microscope optique Mode d opération Cytométrie en flux Cytométrie en flux Observation directe des lymphocytes rosettés par les Système de détection microsphères Dynal AS (Oslo, Norvège) Dispositif magnétique Haemocytomètre, Microscope optique ou à fluorescence Observation directe des lymphocytes immunocapturés Fluorochromes conjugués aux Fluorochrome conjugué à AcM Microsphères de latex conjuguées à Microsphères magnétiques AcM anti-cd3, CD4 et CD8 anti-cd4 AcM anti-cd4 conjuguées aux AcM CD4 et CD8 Échantillon Sang total Sang total Sang total Sang total Résultats Taux absolu de CD4 et CD8 %CD4 et %CD8 par rapport aux T 0.93-0.98 (plusieurs études internationales) Taux absolu de CD4 Taux absolu de CD4 Taux absolu de CD4 et CD8 Corrélation avec la cytométrie en flux a (valeur r ) 096-0.97 (quelques études) 0.67-0.93 (plusieurs études internationales) Coût de l instrument ($US) 25 000 20 000 2000 2-10 000 b Coût des réactifs /test ($US) 6-20 2 4-8 3-5 Avantages Simple et rapide Désavantages Automatisation, peu d étapes, moins sujet à l erreur humaine Taux absolu de CD4 et CD8 Résultats obtenus rapidement Coût des réactifs élevé Limité à 12 échantillons à la fois %CD4 lymphocytaire non disponible AMc anticorps monoclonal ; EQE Programme externe d évaluation de la qualité Coût des réactifs abordable Résultats obtenus rapidement %CD4 par rapport aux lymphocytes non disponible Instrument non évalué dans une étude multicentrique indépendante Limité à 10 échantillons à la fois Méthode de comptage subjective %CD4 lymphocytaire et taux de CD8 non disponible EQE non disponible 0.94 and 0.96 (plusieurs études internationales) Simple et rapide Taux absolu de CD4 et CD8 Limité à 6 échantillons à la fois Méthode de comptage subjective %CD4 lymphocytaire non disponible EQE non disponible a L analyse de la corrélation issue de la régression linéaire est inappropriée à l étude comparative de méthodologies. La méthode appropriée est l analyse de la concordance. Malheureusement, les études publiées ne font pas usage de cette méthode pour l évaluation comparative à la cytométrie en flux. C est pourquoi nous rapportons seulement les valeurs r b Selon qu un microscope optique ou à fluorescence a été utilisé. c Très prochainement, le coût des réactifs pourrait chuter de façon substantielle. 5