intracellulaires et extracellulaires

- 1 - ACADEMIE DE PARIS Année 211 MEMOIRE pour l obtention du DES d Anesthésie- Réanimation Coordinateur : Monsieur le Professeur Didier Journois Par Jeanne Chatelon Présenté et soutenu le 18 octobre Rôle de la stimulation des cellules immunitaires sur l expression des calgranulines S1A8 et S1A9 intracellulaires et extracellulaires Travail effectué sous la direction du Professeur Didier Payen

- 2 - SOMMAIRE REMERCIEMENTS...4 INTRODUCTION 5 MATERIELS ET METHODES...8 1. Préparation cellulaire.8 a. Choix des échantillons b. Choix et concentration des agoniste c. Cinétique d activation des leucocytes soumis à différents agonistes d. Cinétique nécrose e. Mortalité cellulaire 2. Immunohistochimie et analyse par cytométrie en flux.9 a. Principe de la cytométrie en flux b. Choix des anticorps c. Calibration du signal d. Marquage des protéines membranaires e. Marquage des protéines intracellulaires f. Marquage des cellules apoptotiques 3. Enzyme- Linked Immunosorbent Assay : ELISA 13 4. Analyse statistique des données. 14 RESULTATS...15 1. Validation du modèle..15 a. Cinétique de l expression membranaire des marqueurs d activation cellulaires à H1, H3 et H6 après stimulation par du LPS, du fmlp, du GMCSF et de l IFNγ b. Pourcentage de cellules apoptotiques après stimulation par la cycloheximide 2. Fraction de calgranulines en fonction du type cellulaire..17 a. Répartition des monomères S1A8 et S1A9 et de leur complexe dans les cellules immunitaires avant et après stimulation b. S1A8, S1A9 et S1A8/S1A9 membranaires 3. Modification de l expression des calgranulines intracellulaires en fonction du type cellulaire et de l agoniste..18 a. Variation intracellulaire des protéines S1A8, S1A9 et du complexe S1A8/S1A9 après stimulation par du LPS, du fmlp, du GM- CSF et de l IFNγ dans le monocyte b. Variation intracellulaire des protéines S1A8, S1A9 et du complexe S1A8/S1A9 après stimulation par du LPS, du fmlp, du GM- CSF et de l IFNγ dans le PMN c. Variation intracellulaire des protéines S1A8, S1A9 et du complexe S1A8/S1A9 après stimulation par de la CHX dans le PMN et le monocyte

- 3-4. Relation entre l expression intracellulaire de calgranulines et le niveau de protéine extracellulaire...23 a. Variation de la protéine S1A8 dans le surnageant de sang total stimulé par du LPS et du fmlp b. Variation de la protéine S1A8 dans le surnageant de sang total stimulé par un agoniste apoptotique et après nécrose cellulaire DISCUSSION.24 CONCLUSION..29 REFERENCES...3 RESUME.32

- 4 - REMERCIEMENTS «La terre nous en apprend plus long sur nous que les livres. Parce qu elle nous résiste. L homme se découvre quand il se mesure avec l obstacle» «Ce qui sauve c est de faire un pas. Encore un pas.» Antoine de Saint- Exupéry Parlait- il du choc septique? Il me reste donc les mercis Monsieur Payen, pour cet enthousiasme si rare qui éclate comme un ballon d enfant et porte haut vers le ciel, pour son temps Copperfield, qui apparaît soudainement pour vous Valérie, sans qui la maison serait dure et bancale Anne- Claire, qui n est pas d accord et qui a raison, qui a raison et n est pas d accord, qui soulève Et puis, Ces oiseaux de passage qui ont battu du sourire dans le ciel parfois gris : Christelle, Laurence, Angélique Sarah, parce que t es belle en plein, les soupes, le café, le bureau, les rayons. Et puis ceux sans qui rien ne serait : Arnaud, Fabien, Matthieu, et Romain G. Bien à vous

- 5 - INTRODUCTION Le choc septique reste l une des principales causes de mortalité dans les services de réanimation [1]. Les dernières décennies n ont pas apporté de grandes avancées thérapeutiques, ou du moins souvent décevantes, et ce malgré les progrès faits dans la compréhension de sa physiopathologie, notamment sur le rôle de l inflammation systémique et des divers médiateurs inflammatoires dans les défaillances d organe. Pourtant, très récemment, les avancées techniques dans le domaine de la recherche ont permis une nouvelle approche, plus large, sur de nombreuses pathologies : c est ainsi que la génomique, en définissant une véritable «carte transcriptionnelle» de gênes sur ou sous- exprimés au cours du choc septique a fait émerger deux protéines de l inflammation comme pouvant jouer un rôle majeur dans cette pathologie : les protéines S1A8 et S1A9, dont les gênes comptent parmi les plus sur- exprimés au cours du choc septique [2] [3]. Ces deux protéines également connues sous le nom de Myeloid- inhibatory- factor Related Protein 8 (MRP8) et 14 (MRP14) ou calgranuline A et B respectivement ont été décrites pour la première fois dans les années 8, puis exclusivement étudiées dans les pathologies inflammatoires subaiguës et chroniques, du fait de leur augmentation plasmatique constante dans ces désordres. Il a ainsi été montré que dans la polyarthrite rhumatoïde, l arthrite idiopathique juvénile, les maladies inflammatoires chroniques de l intestin, la mucoviscidose et la bronchite chronique, le complexe S1A8/S1A9 local ou plasmatique était très fortement lié à l activité de la maladie et constituait ainsi un meilleur marqueur du suivi que d autres marqueurs plus classiques (CRP, Vitesse de sédimentation). Le complexe a également montré son intérêt en tant que marqueur pronostique de ces pathologies.[4]. Les protéines S1A8 et S1A9 appartiennent toutes deux à la famille multigénique des protéines S1, constituant elle- même la plus importante sous- famille des protéines liant le calcium ayant une extrémité de type «domaine EF» (calcium- binding protein with an EF hand.), au même titre que les troponines, ou la calmoduline. Comme toutes les protéines S1, ces 2 protéines peuvent se polymériser, mais alors que les membres de cette famille s assemblent en homodimère, S1A8 et S1A9 forment un hétérodimère, le complexe S1A8/S1A9 (également connu sous le nom de calprotectine) qui semble être la forme biologiquement active [5]. Une des particularités de ces protéines est qu elles ont rapidement été spécifiées comme protéines de la lignée myélo- monocytaire. Elles ont en effet été exclusivement décrites dans les monocytes circulants, les macrophages peu différentiés et les granulocytes, mais seraient absentes des lymphocytes [6] [7]. Elles semblent également être des marqueurs précoces de différentiation myéloïde. Et il est intéressant de noter que les phagocytes exprimant S1A8 et S1A9 font partie des toutes premières cellules sur le site inflammé [8]. Si de multiples fonctions ont été assignées à ces deux protéines et à leur complexe, leur rôle exact reste largement incompris. On leur a ainsi attribué des fonctions à la fois intra et extracellulaires. Dans la cellule, elles semblent impliquées dans de nombreuses fonctions vitales pour le fonctionnement et la survie cellulaire (homéostasie calcique, régulation de la phosphorylation protéique, transport intracellulaire des acides gras, métabolisme de l acide arachidonique) [9]. De plus, corroborant leur expression restreinte à la lignée myélo- monocytaire elles semblent participer à des fonctions clés indispensables à la défense immunitaire comme la migration cellulaire via le réarrangement du cytosquelette [1].

- 6 - Lorsqu elles sont présentes en extracellulaire, elles participeraient également à la défense de l hôte. Elles auraient ainsi un rôle antibactérien et antifongique, et semblent de plus véhiculer un message pro- inflammatoire. Ainsi, le complexe jouerait un rôle essentiel dans la diapédèse et l adhésion leucocytaire [8]. Il induirait une réponse endothéliale de type prothrombotique et proinflammatoire, augmentant la transcription de chémokines proinflammatoires, de molécules d adhésion ainsi que la perméabilité vasculaire en relâchant les jonctions entre cellules endothéliales [11]. Mais de même que leur rôle physiopathologique exact n est pas complètement compris, les mécanismes aboutissant à leur augmentation dans le plasma restent à ce jour incomplètement élucidés. Ainsi, les protéines S1 n ont pas le domaine transmembranaire permettant une sécrétion «classique». La façon dont elles traversent la membrane reste donc quelque peu énigmatique. Toutefois, en 1997, Rammes a décrit un mécanisme de sécrétion actif, faisant intervenir la protéine kinase C (PKC) et nécessitant un réseau microtubulaire intact [12]. In vivo, il semble que deux signaux soient nécessaires à la sécrétion du complexe : outre l activation de la voie de la PKC, il faut également une liaison à l endothélium activé ou aux éléments de la matrice extracellulaire inflammée (collagène, fibronectine..), responsable d une augmentation de calcium intracellulaire. Ceci permet donc un relarguage du complexe localisé spécifiquement au site inflammatoire, et met en exergue le rôle extracellulaire pro- inflammatoire de ces protéines [13][12]. A contrario, d autres auteurs montrent que la nécrose cellulaire serait responsable de la présence extracellulaire du complexe à des concentrations importantes dans les phénomènes inflammatoires [14]. Alors que ces protéines sont connues depuis une trentaine d années et exclusivement décrites dans les désordres dysimmunitaires, ce n est que très récemment que leur étude s étend à d autres pathologies, notamment cancéreuses, et infectieuses, où elles semblent jouer un rôle majeur. C est ainsi que l on commence à s y intéresser dans le choc septique. En effet, en 27, Vogl décrivait chez l animal que l absence de ces protéines améliore la survie de souris dans un modèle de choc endotoxinique et de sepsis abdominal. De plus, pour la première fois il mettait en évidence que les effets pro- inflammatoires et létaux de ces deux protéines étaient médiés par leur liaison au Toll- like récepteur 4, faisant de ces deux protéines des activateurs endogènes de cette voix de signalisation [15]. De même, Boyd, dans une autre étude, montrait que la présence de ces protéines participaient à l apparition d une défaillance cardiaque au cours du choc septique chez le rat, et mettait également en évidence que ces effets étaient médiés par une liaison aux récepteurs RAGE [16]. C est ainsi que certains auteurs commencent à les décrire comme des Damage Associated Molecule Patterns ou DAMPS, molécules capables de véhiculer un signal de danger endogène et d entraîner une réponse de défense en activant le système immunitaire [17]. Enfin, en 28, Payen mettait chez des patients en état de choc septique, avec des scores de gravités comparables, que dès J, les patients qui allaient mourir avaient une concentration significativement plus élevée de protéine S1A8 circulante, et ce, sans aucun chevauchement avec les survivants. Il montrait également que la guérison était associée à une diminution de cette protéine dans le sang [3]. Ceci fait donc de ces deux protéines, si ce n est encore une cible thérapeutique, au moins un marqueur pronostique unique, et d un intérêt majeur dans la recherche clinique associée au choc septique.

- 7 - Ainsi les calgranulines apparaissent de façon indéniable comme des médiateurs essentiels de l inflammation: de part leur taux cytosolique si important dans les cellules phagocytaires (4% et 1% des protéines cytosoliques du polymorphonucléaire neutrophile (PMN) et du monocyte respectivement) [7], cellules pivots du système immunitaire inné et ayant un rôle crucial dans l initiation et la diffusion de la réponse inflammatoire, de part leur présence augmentée de façon systématique dans tous les états inflammatoires et ce avec des concentrations corrélées à la gravité de la maladie, notamment dans le choc septique où elles semblent être un marqueur pronostique majeur, de part leurs fonctions extracellulaires et intracellulaires et enfin, de part les récepteurs sur lesquelles elles agissent. Ainsi, voulant mieux comprendre le rôle de ces protéines dans la pathologie septique nous nous sommes demandés quelles étaient les fractions de calgranulines dans les cellules immunitaires, quelles étaient les modifications d expression de ces protéines en fonction du type cellulaire et de leur activation par des agonistes choisis, et s il y avait une relation entre l expression intracellulaire et le niveau d expression extracellulaire de ces protéines. Notre projet va donc s attacher à étudier les calgranulines dans les cellules immunitaires et les conséquences d une activation de ces cellules sur la variation des calgranulines intra et extracellulaires. Nous avons choisi de travailler sur du sang total de sujet sain, et d étudier en particulier les PMNs et les monocytes. En effet, les protéines S1A8 et S1A9 sont, dans l état de nos connaissances, très spécifiques de ces types cellulaires, qui par ailleurs jouent un rôle primordial dans le choc septique en étant à la fois les premiers acteurs sur le site infecté, ainsi que les vecteurs, au même titre que le système nerveux, de l agression septique. Notre modèle nous a également permis d étudier l expression des calgranulines dans les lymphocytes. Ainsi, c est en suivant les taux intracellulaires et extracellulaires de ces protéines et du complexe, dans les cellules immunitaires circulantes, exposées ou non à des agonistes classiques, et selon une cinétique rapide que nous nous proposons de répondre à ces questions.

- 8 - MATERIELS ET METHODES 1. Préparations cellulaires a. Choix des échantillons Notre travail a été réalisé sur du sang total de volontaires sains prélevés à l Etablissement Français du Sang, Centre de l hôpital Saint- Louis, dans le cadre d une convention de cession de produits issus du sang à but non thérapeutique. (C CPSL UNT- N 9/SL/19). Le sang a été prélevé sur tubes héparinés (Becton Dickinson Vacutainer, Plymouth, UK) et traité dans les deux heures suivant son prélèvement. b. Choix et concentration des agonistes Nous avons ainsi choisi le lipopolysaccharide (LPS, Sigma, St Quentin Fallavier, France), agoniste d origine bactérienne classique, le Formyl- Methionyl- Leucyl- Phenylalanine (fmlp, Sigma), chémoattractant d origine bactérienne n activant pas la voie du récepteur Toll- 4,2 cytokines : le Granulocyt Macrophage Colony- Stimulating Factor (GMCSF, R&D Systems, Abington, UK), et l interféron gamma (IFNγ, R&D system) et un mitogène, la concanavaline A, plus spécifiquement orienté vers une activation lymphocytaire. En effet d une part la littérature rapporte un effet de ces molécules sur la sécrétion de S1A8, S1A9, et S1A8/S1A9 par les cellules immunitaires [12][18] et d autre part ces molécules sont présentes au cours de l orage inflammatoire d origine septique. Notre choix s est spécifiquement porté sur le GMCSF et l IFNγ qui ont été testés comme traitement du choc septique.[19]. Pour chaque agoniste, les concentrations choisies correspondent soit à des descriptions de la littérature comme entraînant une activation des cellules immunitaires associée à une sécrétion des calgranulines [12], soit à des résultats de mises au point testant plusieurs concentrations. Nous avons ainsi testé le LPS à 1µg/ml et 1ng/ml, la concanavaline A à 1 et 5 µg/ml, le fmlp à 1-8 M et 1-7 M, la cycloheximide à 1, 5, 1 et 1µg/ml. Par la suite les expériences ont été réalisées avec les doses minimales efficaces. c. Cinétique d activation des leucocytes soumis à différents agonistes 3 ml de sang total a été incubé dans des tubes en polypropylène (BD Biosciences, Le Pont De Claix, France) dans les deux heures suivant le prélèvement à 37 C, 5% de CO2, et 95% d humidité pendant 1 heure, 3 heures et 6 heures avec les agonistes suivants : - deux agonistes bactériens classiques : le LPS (1ng/ml), et le fmlp (1-8 M) - deux cytokines : le GMCSF ( 1UI/µl ), et l IFNγ (5UI /ml) - un mitogène : la concanavaline A - un agoniste apoptotique : la cycloheximide (CHX) (1 µl /ml). Pour chaque temps de chaque stimulation un contrôle a été effectué. Les leucocytes ont également été analysés au temps H (condition baseline). Ainsi, pour chacun des 6 agonistes choisis 7 conditions ont été analysées : - baseline (H) - agoniste 1 heure (H1)- contrôle H1 - agoniste H3 contrôle H3 - agoniste H6 contrôle H6.

- 9 - Pour chaque condition, un marquage des protéines membranaires et intracellulaires d intérêt a été réalisé suivi d une analyse en cytométrie de flux comme décrit ci- dessous. De plus, pour chaque condition, 2ml de sang total a été prélevé, et le surnageant a été recueilli après centrifugation pendant 1 minutes (18 tours par minute) puis conservé à 2 C en attente d un dosage par Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Pour chacun des temps, nous avons donc réalisé une quantification intracellulaire des protéines S1A8, S1A9 et S1A8/S1A9 en cytométrie de flux, ainsi qu une quantification extracellulaire de la protéine S1A8 en ELISA. d. Cinétique nécrose L analyse de la survenue d une éventuelle nécrose cellulaire, potentiellement à l origine de la libération de calgranulines dans le milieu extracellulaire, a été réalisé en soumettant les échantillons à la cinétique habituelle d incubations, en condition contrôle et après stimulation par le LPS (1ng/ml) Une condition baseline a également été analysée. Pour chaque temps de chaque condition, l échantillon a d abord été centrifugé (18 tours par minutes, 1 minute). Le surnageant a été récupéré et conservé à 2 C en attente d une analyse par ELISA. La survenue d une nécrose cellulaire massive a été reproduite par immersion du culot cellulaire pendant quelques minutes dans de l azote liquide jusqu à congélation, puis décongélation au bain- marie à 37 C (technique de freezing- thawing[2]). Ce cycle a été répété 6 fois. Le lysat cellulaire obtenu été recueilli et conservé à 2 C en attente d une analyse par ELISA. Une partie de l échantillon a été coloré au bleu Trypan (Sigma) et la nécrose cellulaire a été vérifiée sur lame observée au microscope. e. Mortalité cellulaire La viabilité des leucocytes a été vérifiée sur lame après coloration May- Grünwald Giemsa, pour chaque temps et après stimulation par fmlp et LPS au Laboratoire d Hématologie de l Hôpital Lariboisière. Le nombre de cellules nécrotiques n était pas significativement augmenté par nos conditions expérimentales, à part lors de la cinétique nécrose, comme attendu. De plus la cytométrie en flux n a pas montré de baisse significative du pourcentage de monocytes ou de PMNs entre les temps H et H6. 2. Immunohistochimie et analyse par cytométrie en flux a. Principe de la cytométrie en flux : Pour la quantification intracellulaire des protéines S1A8, S1A9 et du complexe S1A8/S1A9, nous avons choisi d utiliser la cytométrie en flux. Le principe de cette technique repose sur le marquage par une molécule fluorescente, ou fluorochrome, de l élément cellulaire d intérêt, en particulier les protéines membranaires et intracellulaires. Lors du passage au cytomètre, les cellules sont entraînées dans un flux liquide traversé par un rayon laser de 488nm de longueur d onde. Le passage d une particule devant le rayon laser est appelé «évènement», et généralement assimilé au passage d une cellule isolée. Lors de chaque évènement, la lumière est à la fois: - transmise à la même longueur d onde en fonction des caractéristiques morphologiques de la cellule, et

- 1 - - ré- émise à une ou plusieurs longueur(s) d onde différente(s), après excitation du(es) fluorochrome(s) utilisé(s). Le signal obtenu est amplifié et converti pour analyse informatique. L analyse parallèle des caractéristiques morphologiques (taille et structure plus ou moins granuleuse du cytoplasme) et de la présence de protéines membranaires ou intracellulaires permet donc de sélectionner une population cellulaire au sein d un échantillon, et de mesurer le niveau d expression d une molécule d intérêt. Nous avons pu ainsi spécifiquement et en parallèle à la fois dans les PMNs et les monocytes, étudier les taux intracellulaires des protéines S1A8, S1A9 et de leur complexe et contrôler la réalité de l activation cellulaire par les agonistes choisis en quantifiant l expression membranaire de marqueurs d activation (CD11b/CD18 pour le PMN, HLA- DR pour le monocyte, CD69 pour le lymphocyte). b. Choix des anticorps - Sélection des populations : Le CD14, marqueur de différentiation myéloïde, a été choisi pour la sélection des monocytes humains, qui l expriment à leur surface de façon constitutive avec une intensité élevée. La population monocytaire au sein d un échantillon de sang total peut donc être sélectionnée sur la base de son expression de CD14, et de ses caractéristiques morphologiques propres: taille supérieure et granulosité intermédiaire comparées aux lymphocytes et aux cellules granuleuses De même, le CD16 a été choisi pour la sélection des PMNs [21]. C est un récepteur de surface pour le fragment Fc des immunoglobulines G. Il est exprimé de façon constitutive par les PMNs et est absent des polynucléaires éosinophiles et basophiles. La population des PMNs d un échantillon de sang total a donc pu être caractérisée comme étant une population exprimant le CD16 et avec une granulosité supérieure par rapport aux lymphocytes et aux monocytes. Le CD3, complexe d immunoglobulines transmembranaires appartenant au récepteur des cellules T (TCR) a été choisi pour sélectionner les lymphocytes T. Le CD 19, glycoprotéine membranaire spécifique des lymphocytes B a été choisi pour les sélectionner [22]. - Sélection des marqueurs d intérêt : Des anticorps anti S1A8 (= anti calgranuline A), anti S1A9 (= anti calgranuline B) et anti S1A8/S1A9 (= anti calgranuline A/B) ont été choisi pour détecter les calgranulines et leur complexe en intracellulaire. L analyse d un éventuel marquage membranaire de ces protéines a été vérifiée dans nos conditions expérimentales. Après contact avec les fournisseurs, il nous a été précisé que les anticorps anti S1A8 et anti S1A9 étaient respectivement spécifiques de ces 2 protéines. L anticorps anti S1A8/S1A9 pouvait se fixer, avec une proportion non connue aux monomères en plus du complexe. Le CD11b et le CD18, appartenant à la famille des intégrines et formant un hétérocomplexe transmembranaire permettant l adhésion leucocytaire ont été choisis comme marqueurs membranaires de l activation des PMNs. [23] Le HLA- DR, isoforme du complexe majeur d histocompatibilité de classe II est exprimé à la surface des monocytes et permet de présenter les antigènes aux cellules T. Chez le sujet sain, son expression augmente avec l activation monocytaire et lors de la différentiation en

- 11 - cellules dendritiques ou en macrophages. Il a été choisi comme marqueur de surface de l activation monocytaire. Le CD 69, glycoprotéine transmembranaire exprimée de façon précoce au cours de l activation lymphocytaire a été choisi comme témoin de leur activation. Ainsi, après activation des leucocytes par incubation du sang total avec les différents agonistes, l induction de l activation cellulaire a pu être vérifiée par l augmentation de ces marqueurs à la surface des PMNs, des monocytes et des lymphocytes respectivement. Pour la reconnaissance des cellules apoptotiques, nous avons choisi l annexine V. En effet, précocement au cours de l apoptose, et contrairement à la nécrose, la membrane des cellules ne se rompt pas, mais elle perd la distribution asymétrique de ses phospholipides. Les cellules exposent alors des phosphatidyl- sérines, spécifiquement détectable par la cytométrie en flux grâce à leur liaison à l annexine V.[24]. B C 27 A S1A8 CD14 D CD14 E S1A8 CD16 S1A8 4 CD16 S1A8 Figure 1 : exemple de marquage intracellulaire du complexe S1A8 dans les monocytes et les PMNs. A : marquage CD14 et CD16 permettant de différentier les PMNs (CD16 high, CD14 low = population 1 ou P1 en rouge) et les monocytes (CD14 high = population 2 ou P2, en vert). B: dans P1, dot plot de l expression de S1A8 des cellules CD16+. C : médiane de fluorescence calculée à partir de la représentation en histogramme de l expression de S1A8 dans P1. D : dans P2, dot plot de l expression de S1A8 des cellules CD14+. E : médiane de fluorescence calculée à partir de la représentation en histogramme de l expression de S1A8 dans P2.

- 12 - c. Calibration du signal PE Le niveau d expression d HLA- DR, de CD11b, CD18, S1A8 (calgranulin A), S1A9 (calgranulin B) et S1A8/S1A9 (calgranulin A/B) est mesuré à partir de l intensité de la fluorescence (Mean Fluorescence Intensity, MFI) émise par la PE, fonction du nombre de molécules d anticorps et donc du nombre de molécules d intérêt à la surface de chaque cellule. La MFI dépend des réglages de l appareil et de l intensité du laser. La déviation liée à l usure du laser, ou les ajustements de réglages nécessaires en cours d étude, par exemple après une intervention technique sur l appareil, imposent donc l utilisation d un système de calibration du signal. Dans cette étude, un système commercialisé a été choisi (BD Quantibrite PE Beads, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Il repose sur l analyse par le cytomètre d un mélange de 4 types de billes, toutes de même taille, et couplées à des quantités connues de molécules PE. Les 4 niveaux de fluorescences qui en résultent correspondent à 4 quantités précises de molécules PE fixées sur les billes. Une droite de régression relie donc ces valeurs de MFI à des valeurs de «nombre de molécules PE». Le couplage de l anticorps avec le fluorochrome PE en proportion 1/1 pour tous les anticorps utilisés dans ce travail et son utilisation en concentration saturante (selon les recommandations du fabricant) permettent donc de convertir finalement la MFI mesurée en «nombre de sites» ou «nombre d anticorps» par cellule (Antibodies Bound per Cell, AB/C). Chaque lot de billes est fourni par le fabricant accompagné de ses caractéristiques quantitatives (nombre de molécules PE par type de bille). La conversion du signal par ce système rend donc possible la comparaison des résultats obtenus, indépendamment des différences techniques qui peuvent influencer la mesure. d. Marquage des protéines membranaires L ensemble de la procédure a été réalisée à température ambiante. 5 µl de sang a été incubé 3 min dans des tubes en polystyrène, à l obscurité, en présence des anticorps suivants: - anti CD14- Fluorescéine iso Thio Cyanate (FiTC) (5µl), anti CD16- Phycocyanine 5 (PC5)(1µl), anti CD3- FiTC (5µl), anti CD19- FiTC (5µl) (Beckman Coulter Immunotech, Marseille, France), - anti HLA- DR- Phycoérythrine (PE), (clone L243), anti CD11b- PE, anti CD18- PE, (BD Biosciences, San Jose, CA), anti CD 69- PE - anti S1A8- PE, anti S1A9- PE et anti S1A8/S1A9- PE (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) (pour l analyse de l éventuel marquage membranaire de ces protéines). Un anticorps dirigé contre une immunoglobuline "irrelevante" couplée à la PE (BD Biosciences, San Jose, CA) a été utilisée pour évaluer le signal dû à la liaison non spécifique des anticorps couplés à la PE, en particulier au récepteur Fc présent à la surface des monocytes. Puis les érythrocytes ont été lysés par une incubation de 1 minutes à l obscurité dans 1 ml d une solution de lyse (FACS Lysing Solution, BD Biosciences). Les leucocytes ont ensuite été lavés en ajoutant 3 ml d une solution tampon phosphate (PBS) ajustée à un ph = 7,4. Le culot cellulaire a été récupéré après centrifugation (5 minutes, 18 tours par minute) et fixé par une solution de paraformaldéhyde 1% pour les tubes n ayant qu un marquage de protéines membranaires. Les leucocytes ont ensuite été conservés à 4 C, à l obscurité, jusqu à l analyse.

- 13 - e. Marquage des protéines intracellulaires L ensemble de la procédure a été réalisée à température ambiante. Pour les tubes avec un marquage de protéines intracellulaires, après la lyse des érythrocytes, le lavage et la centrifugation (cf marquage des protéines membranaires) la fixation a été réalisée par 15 minutes d incubation dans une solution de paraformaldéhyde 2% à l obscurité. Les leucocytes ont ensuite été lavés en ajoutant 2ml de PBS et récupérés après centrifugation (5 minutes, 18 tours par minute). Les cellules ont ensuite été perméabilisées pendant 2 minutes par une solution de PBS à,1% de saponine (Sigma, St Quentin Fallavier, France) et,2% de sérum albumine bovine (BSA, Sigma). Le culôt cellulaire a été récupéré après centrifugation (5minutes, 18 tours par minute) et les cellules ont été incubées 3 minutes à l obscurité en présence d anti S1A8- PE, d anti S1A9- PE et d anti S1A8/S1A9- PE, (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA). Après lavage avec 3 ml de solution de perméabilisation et centrifugation (5 minutes, 18 tours par minute), les cellules ont été remises en suspension dans une solution de paraformaldéhyde 1%, et conservés à 4 C, à l obscurité, jusqu à l analyse. Bien que ce type de fixation permette un stockage de 48 heures maximum, les échantillons ont été analysés le plus tôt possible, au maximum dans les 12 heures (FacsCanto et logiciel FacsDiva, Becton Dickinson), au Laboratoire d Hématologie Biologique de l Hôpital Lariboisière. f. Marquage des cellules apoptotiques L ensemble de la procédure a été réalisée à température ambiante. L analyse de l expression des calgranulines lors de l induction de l apoptose a été réalisée. Pour valider le modèle choisi, les cellules apoptotiques ont été marquées par un anticorps reconnaissant l annexine V (cf choix des marqueurs membranaires) Pour chaque temps et chaque condition de la cinétique apoptose, 5µl de sang a été prélevé et placé dans des tubes en polystyrène. Les érythrocytes ont été lysés par une incubation de 1 minutes à l obscurité dans 1 ml d une solution de lyse, (BD Biosciences). Les leucocytes ont été lavés en ajoutant 3 ml de PBS et le culôt cellulaire a été récupéré après centrifugation (5 minutes, 18 tours par minute). Les leucocytes ont ensuite été incubés pendant 1 minutes à l obscurité avec 5µl d une solution de binding buffer et avec ou sans 5 µl d anti Annexin V FITC (Sigma), selon les recommandations du fournisseur. Les échantillons ont ensuite immédiatement été analysés en cytométrie de flux. Pour chaque temps et chaque condition, après le prélèvement des 5µl de sang, le reste de l échantillon a été centrifugé pendant 1 minutes, à 18 tours par minute. Le surnageant a été récupéré et conservé à 2 C en attendant une analyse par ELISA. 3. Enzyme- Linked Immunosorbent Assay : ELISA La mesure de la protéine S1A8 dans le surnageant a été effectuée par ELISA comme décrit précédemment [3], au Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire de l Hôpital Lariboisière, Paris 1 ème, sous la direction du professeur Launay.

- 14-4. Analyse statistique des données Les données de cytométrie en flux ont été exprimées en nombre de sites par cellule et les valeurs des données de l ELISA en pg/ml. Les résultats sont présentés sous forme de graphe en boîte à moustache (box plots) Les barres horizontales extrêmes représentent les 5 ème et 95 ème percentiles, la barre centrale la médiane et les barres de part et d autre de la barre médiane représentent les 25 ème et 75 ème percentiles. L analyse statistique des données de la cytométrie en flux et de l ELISA a été réalisée en utilisant un test non paramétrique de Mann- Whitney (logiciel Statview). La valeur du seuil de significativité a été fixée à,5. Ainsi, les quantités de S1A8/S1A9, S1A8, S1A9 intracellulaires, et de CD11b, CD18 et d HLA- DR membranaires exprimées en nombre de sites par cellule, à H1, H3 et H6 après stimulation ont été comparées aux valeurs contrôles des temps correspondants. De même les quantités de S1A8 extracellulaires à H1 H3 et H6 après stimulation et exprimées en pg/ml ont été comparées aux valeurs contrôles des temps correspondants. De plus les valeurs contrôles à H1, H3 et H6 ont été comparées entre elles et au temps.

- 15 - RESULTATS Les valeurs intracellulaires sont exprimées en nombre de site par cellules, et sont comparées aux valeurs contrôles des temps correspondants (sauf précision). Les valeurs de S1A8 dans le surnageant sont exprimées en pg/ml et sont également comparées aux valeurs des temps contrôles correspondants. 1. Validation du modèle a. Cinétique de l expression membranaire des marqueurs d activation cellulaire à H1, H3 et H6 après stimulation par du LPS, du fmlp, du GMCSF et de l IFNγ (Figure 3) - Monocyte et HLA- DR : La stimulation par le LPS entraîne une augmentation significative de l HLA- DR monocytaire à H1, H3 et H6. Le GMCSF entraîne une augmentation significative plus tardive de son expression, à partir de H3 et l IFNγ uniquement à H1. Il n y a pas de variation significative de l expression de HLA- DR à la surface du monocyte après stimulation par du fmlp par rapport aux valeurs des temps contrôles sur cette cinétique. - PMN, CD11b et CD18 : On retrouve une augmentation significative du CD11b et du CD18 précoce et soutenue, de H1 à H6 après stimulation des PMNs par du LPS, du fmlp, et du GMCSF. L augmentation de ces deux molécules est un peu plus tardive après stimulation par de l IFNγ, à partir de H3 b. Pourcentage de cellules apoptotiques après stimulation par la cycloheximide (figure 2) Après incubation avec de la cycloheximide on retrouve une augmentation significative de la quantité de PMNs apoptotiques à H6 (42,8% vs 5,5%) et de monocytes apoptotiques à H3 (11,2% vs 3,9%) et H6 (15,1% vs 4%).!"#$%&'()!+) Figure 2 : pourcentage de monocytes et de PMNs en apoptose ou exprimant l annexine V n=3 p<,5 (pourcentages comparées à ceux des valeurs contrôles des temps correspondants)

- 16 - HLA DR monocytes CD 11b PMN CD 18 PMN 4 2 15 1 75 LPS 2 1 5 5 25 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 2 1 fmlp 4 2 15 1 75 5 5 25 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 GM- CSF 4 2 2 15 1 1 75 5 5 25 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 2 1 4 15 75 IFNγ 2 1 5 5 25 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 Figure 3 : cinétique H, H1, H3 et H6 des marqueurs d activation cellulaire : HLA- DR (monocyte) CD11b et CD18 (PMN) après stimulation par LPS, fmlp, GMCSF, et IFNγ. Valeurs exprimées en nombre de sites par cellules (ordonnées) en fonction du temps (abscisse). Contrôle (n= 13) / LPS (1ng/ml) n= 8 / fmlp (1-8 M), n=8 / GMCSF (1UI/µl) n=5 IFNγ (5UI/ml ) n= 5 : p<,5 (valeurs comparées aux valeurs contrôles des temps correspondants.

- 17-2. Fraction de calgranulines en fonction du type cellulaire a. Répartition des monomères S1A8 et S1A9 et de leur complexe dans les cellules immunitaires avant et après stimulation. - Lymphocytes Tout d abord, en cytométrie de flux, et dans nos conditions expérimentales, il n a pas été retrouvé de protéine S1A8 ou S1A9, ni de complexe dans le lymphocyte, à l état de base et après activation pendant 1h, 3h ou 6h par du LPS et du fmlp. Ceci est en accord avec la littérature sur le sujet [6]. De plus 3 expériences ont été réalisées avec un agoniste lymphocytaire : la concanavaline A. Mais, la constatation d une part, de l absence de calgranulines intracellulaires dans le lymphocyte, et d autre part de l absence d augmentation de l expression membranaire des marqueurs d activation cellulaire choisis du fait d une cinétique probablement trop courte pour permettre une activation cellulaire nous a conduit à ne pas poursuivre (résultats non montrés) Une cinétique a également été réalisée avec une incubation de 24h avec du LPS, du fmlp et de la concanavaline A. Nous avons constaté une mortalité cellulaire trop importante à H24 pour permettre une analyse en cytométrie de flux (résultats non montrés) - Monocytes et PMNs (figure 4) Les deux protéines et leur complexe sont présents à l état de base et après activation dans le monocyte et le PMN. De façon très intéressante, la répartition des 2 protéines et du complexe est différente en fonction du type cellulaire. Ainsi, dans le cytoplasme du monocyte le complexe est la forme majoritairement retrouvée, alors que la protéine S1A9 est la forme majoritaire dans le cytoplasme du PMN. Dans les 2 types cellulaires la protéine S1A8 est minoritaire. Cette répartition n est pas modifiée par l activation des cellules immunitaires, et ce malgré les variations intracellulaires observées. $!!"#,!"# +!"#!"# )!"# (!"# '!"# &!"# %!"# $!"#!"#!"#$#%&'(! -.# -$#/123456# -$#789# -$#:;78# -$#<;=9># -$#?>@A# -&#/123456# -&#789# -&#:;78# -&#<;=9># -&#?>@A# -)#/123456# -)#789# -)#:;78# -)#<;=9># -)#?>@A# )++,-! )++,.! )++,-/)++,.! $!!"#,!"# +!"#!"# )!"# (!"# '!"# &!"# %!"# $!"#!"#!12! -.# -$#/123456# -$#789# -$#:;78# -$#<;=9># -$#?>@A# -&#/123456# -&#789# -&#:;78# -&#<;=9># -&#?>@A# -)#/123456# -)#789# -)#:;78# -)#<;=9># -)#?>@A# )++,-! )++,.! )++,-/)++,.! Figure 4 : Histogramme montrant la répartition des protéines S1A8, S1A9 et S1A8/S1A9 dans le monocyte et le PMN à H, H1, H3 et H6 en condition contrôle et après stimulation par LPS, fmlp, GMCSF et IFNγ.

- 18 - b. S1A8, S1A9 et S1A8/S1A9 membranaires Dans nos conditions expérimentales, et après analyse en cytométrie de flux, il n a pas été retrouvé de monomère ni de complexe exprimé à la membrane des monocytes et des PMNs, en condition contrôle et après stimulation par du LPS et du fmlp, quelque soit le temps. (données non montrées) 3. Modification de l expression des calgranulines intracellulaires en fonction du type cellulaire et de l agoniste a. Variation intracellulaire des protéines S1A8, S1A9 et du complexe S1A8/S1A9 après stimulation par du LPS, du fmlp, du GM- CSF et de l IFNγ dans le monocyte.(figure 5) Les valeurs des 2 protéines et de leur complexe, exprimées en nombre de site par cellule ne varient pas au cours du temps dans les conditions contrôles. Pour la protéine S1A8, après stimulation par le LPS, on note une augmentation significative à H1 par rapport aux valeurs des temps contrôles correspondants. Il n y a pas d effet des autres agonistes sur la quantité intracellulaire de S1A8 dans le monocyte sur cette cinétique. Quelque soit l agoniste utilisé, il n y a pas de variation de la quantité intracellulaire de S1A9. L activation du monocyte par le LPS entraîne une augmentation significative du complexe, uniquement à H1. Cette augmentation est plus tardive, (H3 et H6), après stimulation par du GMCSF. A contrario, il y a une diminution significative du complexe à H6 après stimulation par du fmlp. Selon l agoniste, on retrouve donc des cinétiques différentes : Le LPS entraîne une augmentation significative du complexe à H1, ainsi qu une augmentation de la protéine S1A8 à H1 et H6.Il n y a pas de variation significative de la protéine S1A9. La stimulation par le fmlp entraîne une diminution significative du complexe à H6. Les monomères ne connaissent pas de variation. Le GMCSF entraîne une augmentation du complexe à H3 et H6, sans variation des monomères. Avec l IFNγ, il n y a pas de mouvement intracellulaire des monomères ni de l hétérodimère au cours du temps. b. Variation intracellulaire des protéines S1A8, S1A9 et du complexe S1A8/S1A9 après stimulation par du LPS, du fmlp, du GM- CSF et de l IFNγ dans le PMN (Figure 6) On note une diminution significative spontanée du complexe dans le cytosol du PMN à H1, H3 et H6 en situation contrôle, par rapport au taux de base. Il n y a pas de variation des monomères au cours du temps en situation contrôle. La protéine S1A8 augmente dans le PMN après stimulation par le LPS de façon précoce et durable (de H1 à H6). Après stimulation par le fmlp, S1A8 voit son taux intracellulaire s accroître à H1 et H6. Elle est augmentée tardivement à H6 après stimulation par du GMCSF. Il n y a pas de variation notable de la protéine S1A8 après traitement par l'ifnγ.

- 19 - Pour la protéine S1A9, on note une augmentation précoce et constante, de H1 à H6 après une stimulation par du LPS. Le monomère augmente significativement à H1 et H3 après stimulation par du fmlp. Le GMCSF et l IFNγ n entraînent pas de mouvements de S1A9. La stimulation des PMNs par le LPS, le fmlp et le GMCSF entraîne une augmentation significative du complexe à H1, également présente à H6 avec le GMCSF. L IFNγ n a pas de conséquence sur la quantité intracellulaire de S1A8/S1A9 dans le PMN au cours de cette cinétique. On note donc des cinétiques de variation de ces protéines différentes selon l agoniste choisi: Une stimulation par le LPS entraîne une augmentation du complexe à H1, et des monomères à H1, H3 et H6. Après incubation avec du fmlp, on note une augmentation du complexe à H1, de la protéine S1A8 à H1 et H6 et de S1A9 à H1 et H3. Une stimulation par le GMCSF entraîne une augmentation du complexe à H1 et H6. S1A8 augmente seulement à H6, et il n y a pas d augmentation de S1A9. L IFNγ n entraîne pas de mouvements des monomères ni du complexe. c. Variation intracellulaire des protéines S1A8, S1A9 et du complexe S1A8/S1A9 après stimulation par de la CHX dans le PMN et le monocyte (Figure 7) Après stimulation par de la CHX, on note une cinétique de variation des monomères et du complexe intracellulaire qui est identique dans le monocyte et le PMN. En effet on retrouve une tendance vers la diminution des monomères intracellulaires dans les 2 types cellulaires. Cette diminution est significative à H1 pour S1A8 et S1A9 dans le PMN, et à H6 pour S1A9 dans le monocyte. On retrouve par contre une tendance à l augmentation du complexe dans les 2 cellules, significative à H1 dans le monocyte.

- 2 - S1A8, S1A9, S1A8/S1A9 dans le monocyte 3 25 2 15 Contrôle LPS 1 5 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 fmlp GMCSF 3 25 3 25 2 2 15 1 15 1 5 5 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 IFNγ S1A8/S1A9 S1A8 S1A9 H H1 H3 H6 Figure 5 : cinétique intracellulaire de S1A8, S1A9 et S1A8/S1A9 à H, H1, H3 et H6 en situation contrôle et après stimulation par du LPS, du fmlp, du GMCSF et de l IFNγ dans le monocyte. Valeurs exprimées en nombre de sites par cellules (ordonnées) en fonction du temps (abscisse). Contrôle (n= 13) / LPS (1ng/ml) n= 8 / fmlp (1-8 M), n=8 / GMCSF (1UI/µl) n=5 / IFNγ (5UI/ml ) n= 5 CHX (1µg/ml n=3 : p<,5 (valeurs comparées aux valeurs contrôles des temps correspondants)

- 21 - S1A8, S1A9, S1A8/S1A9 dans le PMN 14 12 Contrôle LPS 1 8 6 4 2 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 14 12 fmlp 14 12 GMCSF 1 1 8 6 4 2 8 6 4 2 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 14 IFNγ 12 1 8 6 4 2 S1A8/S1A9 S1A8 S1A9 H H1 H3 H6 Figure 6 : cinétique intracellulaire de S1A8, S1A9 et S1A8/S1A9 à H, H1, H3 et H6 en situation contrôle et après stimulation par du LPS, du fmlp, du GMCSF et de l IFNγ dans le PMN. Valeurs exprimées en nombre de sites par cellules (ordonnées) en fonction du temps (abscisse). Contrôle (n= 13) / LPS (1ng/ml) n= 8 / fmlp (1-8 M), n=8 / GMCSF (1UI/µl) n=5 /IFNγ (5UI/ml) n= 5 : p<,5 (valeurs comparées aux valeurs contrôles des temps correspondants)

- 22 - PMN Monocyte 16 14 14 12 S1A8 12 1 8 6 4 1 8 6 4 2 2 H1 H3 H6 H1 H3 H6 12 7 1 6 S1A9 8 6 4 5 4 3 2 2 1 H1 H3 H6 H1 H3 H6 5 3 45 4 25 S1A8/S1A9 35 3 2 25 2 15 15 1 1 5 5 H1 H3 H6 H1 H3 H6 S!"#$%&'()!+) Figure 7 : cinétique intracellulaire de S1A8, S1A9 et S1A8/S1A9, après stimulation par de la CHX (1µg/ml) dans le PMN et le monocyte à H, H1, H3 et H6. Valeurs exprimées en nombre de sites par cellules (ordonnées) en fonction du temps (abscisse). n= 3. : p<,5 (valeurs comparées aux valeurs contrôles des temps correspondants)

- 23-4. Relation entre l expression intracellulaire de calgranulines et le niveau de protéine extracellulaire a. Variation de la protéine S1A8 dans le surnageant de sang total stimulé par du LPS et du fmlp (figure 8): Après stimulation par du LPS, on note une augmentation significative et croissante dans le temps des concentrations de S1A8 extracellulaire à H1, H3 et H6 par rapport aux valeurs des temps contrôles correspondants. Une stimulation par le fmlp entraîne également une augmentation des taux de S1A8 à H1, H3 et à H6 dans le surnageant par rapport aux valeurs des temps contrôles correspondants. Cette augmentation est stable dans le temps, contrairement à une stimulation par du LPS. Par ailleurs, les taux de S1A8 dans le surnageant après une stimulation par le LPS sont significativement plus augmentées qu après une stimulation par le fmlp. LPS fmlp,16,14,12,1,8,6,4,2 H H1 H3 H6 H H1 H3 H6 contrôle LPS,16,14,12,1,8,6,4,2 Contrôle, LPS, fmlp H H1 H3 H6 fmlp Figure 8 : cinétique H, H1, H3, H6 de S1A8 extracellulaire (dosage ELISA), en situation contrôle et après stimulation par du LPS (1ng/ml) et du fmlp (1-8 M). Valeurs exprimées en pg/ml. (ordonnées) en fonction du temps (abscisse).n=9 :p<,5 (données comparées aux valeurs contrôles des temps correspondants) : p<,5 (données après stimulation LPS comparées aux données après stimulation par fmlp des temps correspondants) b. Variation de la protéine S1A8 dans le surnageant de sang total stimulé par un agoniste apoptotique et après nécrose cellulaire. Ces résultats sont en cours.

- 24 - DISCUSSION Le choc septique reste de nos jours la principale cause de mortalité dans les services de réanimation [1]. Très récemment, les protéines S1A8, S1A9 et leur complexe, pourtant connus de longue date, ont émergé comme pouvant jouer un rôle majeur dans la physiopathologie de cette maladie. Ces protéines, augmentées dans le plasma des patients en choc septique qui vont mourir [3] ont été décrites comme spécifiques du système immunitaire inné et dotées de fonctions pro- inflammatoires, notamment lorsqu elles sont libérées dans le compartiment extracellulaire. Nous avons donc choisi de les étudier dans les cellules immunitaires sanguines, PMNs, monocytes et lymphocytes dans un modèle in vitro se rapprochant d une agression septique. La cytométrie en flux, qui permet de caractériser les différents types cellulaires en évitant une stimulation secondaire aux méthodes de séparation, nous a permis de travailler en sang total. Nous avons ainsi pu maintenir le plus longtemps possible une interaction entre les différents éléments sanguins après stimulation, et réduire au minimum une activation arctéfactée par la préparation cellulaire. Grâce aux marqueurs d activation membranaires choisis, nous avons d abord pu vérifier l induction de l activation des monocytes et des PMNs après incubation avec les différents agonistes choisis. Ainsi, dans nos conditions expérimentales, nous retrouvons une augmentation significative de l expression membranaire du HLA- DR monocytaire par rapport aux valeurs contrôles après traitement par du LPS, du GMCSF et de l IFNγ. Nous pouvons noter que la stimulation par du fmlp n entraîne pas de variation de son expression sur cette cinétique. Pourtant, la littérature rapporte une activation monocytaire après stimulation par le fmlp, avec augmentation du burst oxydatif et de l expression de CD11b [25]. Il se peut que la cinétique utilisée soit trop rapide, les doses insuffisantes ou que l activation monocytaire par ce peptide ne passe pas par une augmentation de l HLA- DR, comme cela a été décrit après activation monocytaire par le PFA- 4.[26] Concernant le PMN, il y a une activation précoce et durable avec exposition de CD11b et CD18 à la surface cellulaire dès H1 et ce, jusqu à H6 avec le LPS, le GMCSF et le fmlp. La stimulation par l IFNγ est moins intense et plus tardive. Ces résultats nous permettent donc de vérifier l activation des cellules myélo- monocytaires avec les agonistes choisis, selon la cinétique choisie et dans les conditions d étude choisies. Une fois notre modèle validé, nous avons pu vérifier que les 2 protéines et leur complexe étaient bien présents à la fois dans le monocyte et le PMN, mais absents des lymphocytes. Ceci est conforme aux données de la littérature sur le sujet [9]. Nous avons également pu montrer, et ce, pour la première fois à notre connaissance que la répartition des protéines S1A8, S1A9 et de leur complexe était différente selon le type cellulaire. En effet, dans le PMN, la quantité de S1A9 intracellulaire est supérieure à celle du complexe, alors que le complexe est plus abondant que la protéine S1 A9 dans le monocyte. Cette répartition spécifique du type cellulaire est maintenue après l activation cellulaire. Outre le fait que cela semble présager d une régulation différente selon le type cellulaire, et pour un type cellulaire selon la protéine, conférant à chacune de ces protéines un rôle propre, cela nous permet de conclure à une certaine spécificité de l anticorps marquant le complexe, utile pour l interprétation des résultats. Pour valider la spécificité de l anticorps marquant le

- 25 - complexe nous avons également pu vérifier que la quantité de S1A8/S1A9 retrouvée dans le cytoplasme des PMNs et des monocytes n était jamais la somme des quantités de monomères. Concernant les modifications de l expression des calgranulines après activation cellulaire, notre travail nous permet de montrer qu il y a une régulation différente des mouvements intracellulaires des 2 protéines et du complexe en fonction du type cellulaire et de l agoniste utilisé. En effet, outre le fait que les PMNs paraissent dans l ensemble plus réactifs, nous pouvons noter d autres divergences intéressantes. D une part, quelque soit l agoniste utilisé, il n y a pas de mouvement de la protéine S1A9 dans le monocyte, contrairement au PMN, pour lequel cette protéine est augmentée après une stimulation par le LPS et le fmlp. De même pour la protéine S1A8 : seulement augmentée après une stimulation par le LPS dans le monocyte, mais élevée dans le PMN après une stimulation par le LPS, le fmlp et le GMCSF. Les variations intracellulaires du complexe suivent à peu prêt la même cinétique pour le PMN et le monocyte, sauf après stimulation par le fmlp qui entraîne une diminution du complexe dans le monocyte à H6. Nous pouvons également remarquer des cinétiques différentes selon l agoniste utilisé. L augmentation est généralement plus précoce, plus rapide et plus intense avec le LPS, activateur d une voie de signalisation majeure dans les phénomènes immuno- inflammatoires observés au cours du choc septique, celle médiée par l activation du récepteur Toll- 4 et aboutissant à l activation du facteur de transcription nucléaire NFκB. Il est également intéressant de noter qu après une stimulation par l IFNγ, cytokine ayant un rôle dans la modulation des réactions immunitaires, notamment en favorisant la coopération cellulaire via une stimulation de la présentation antigénique et pouvant être utilisée en thérapeutique pour améliorer l immunoparalysie septique [19] il n y a aucune modification de l expression intracellulaire des calgranulines, quelques soit le type cellulaire. Pour tenter d expliquer l augmentation intracellulaire des protéines, les temps d incubation étant trop courts pour objectiver une synthèse de novo, plusieurs hypothèses sont envisageables. Il se peut qu il y ait une mobilisation à partir de stocks ou organelles intracellulaires. Pourtant, les données actuelles de la littérature sur ce sujet sont contradictoires. Ainsi, il n y aurait pas d organelle intracellulaire stockant ces protéines dans le monocyte [27]. Pour le PMN certains auteurs retrouvent des calgranulines dans certaines granules [28], d autre non [27]. De même, une mobilisation à partir du cytosquelette serait également possible, rendant alors les protéines accessibles aux anticorps utilisés dans notre travail et donc détectables. Pourtant, les données de la littérature rapportent plutôt une mobilisation des protéines et du complexe vers le cytosquelette et la membrane au décours des processus d activation cellulaire. Dans nos conditions expérimentales, et après stimulation par du LPS, il n a pas été retrouvé de complexe, ni de monomère à la surface membranaire (données non montrées). L augmentation du complexe pourrait également être secondaire à une dimérisation à partir des monomères suite à l activation cellulaire. Cependant, dans aucune de nos expériences nous ne retrouvons de diminution des monomères. Une étude en microscopie confocale permettrait sûrement de mieux comprendre les mouvements intracellulaires de ces protéines après stimulation. Enfin, il se pourrait que ces protéines soit stockées sous forme d ARN messager (ARNm) et que l activation cellulaire entraîne sa traduction en protéines. Cette hypothèse serait en accord avec le fait que Rammes retrouve dans son étude de 1997 une diminution de l ARNm de la