Module d Immunologie 2eme Année Licence Tronc Commun des Sciences de la Nature Année universitaire 2014-2015 Dr A.Ghidouche / Dr D.Ait-Ali
Annexe : Techniques utilisée en immunologie La majorité sont des techniques utilisées dans de nombreux domaine de la biologie et médecine La majorité se base sur l utilisation de molécules immunologiques : les anticorps Récupération des cellules immunitaires La technique la plus simple et efficace pour la récupération des cellules immunitaire est réalisée grace à une méthode de centrifugation dans un gradient de densité : Séparation par gradient de Ficoll Centrifugation Plasma Cellules mononuclées Ficoll Hématies Re-suspension des cellules mononuclées isolées grace à la centrifugation
Récupération des cellules immunitaires par des techniques d immunophénotypage L immunophénotypage est le ciblage des molécules membranaires (CD) par l utilisation d anticorps spécifiques Tri cellulaire magnétique Utilisation d anticorps monoclonaux spécifiques associés à des billes magnétiques Ciblage et identification d un type cellulaire précis AIMANT Anticorps Bille magnétique Mélange des anticorps-billes magnétiques avec la suspension cellulaire (ex sang, ponction de moelle osseuse) Isolation des cellules d intérêts portant l antigène détecté par l anticorps
Cytométrie en flux Utilisation d anticorps monoclonaux spécifiques associés à des fluorochromes Anticorps Fluorochrome Selon la nature de fluorochrome : Plusieurs longueurs d ondes d excitation & de détection Parmi les fluorochrome : FITC : Fluorescéine isothiocyanate PE : Phycoérythrine
Cytométrie en flux L analyse est réalisée grace à un instrument : le cytométre en flux Les anticorps permettent de cibler les CDs exprimés par les différentes sous-population immunitaires La Cytométrie en flux permet : l identification et/ou l isolement d une sous-population précises de cellules immunitaires Système fluidique Filtres B.P Détecteurs Lasers Optique de focalisation Miroirs dichroïques Informatique
Annexe :Techniques utilisée en immunologie Système fluidique Cytométrie en flux Filtres B.P Les résultats sont relatifs La cytométrie permet : la séparation selon le taille/granulosité SSC Gran. Mono + 1 2 1= signal B positif 2= signal A et B positifs Ap 3= signal A et B négatifs 3 4 4= signal A positif FSCdu signal A Intensité Statistic A-->C1 A-->C2 A-->C3 A-->C4 Number %Gated Plate-forme de Cytométrie en Flux I.J.M 2522 4259 3140 12 25.2% 42.6% 31.4% 0.12% Optique de focalisation Miroirs dichroïques Ly. FSC scence (unités arbitraires) amme 3D SSCdu signal B Intensité Propriétés physiques Taux d expression des marqueurs (CDs) ONOPARAMETRIQUE Histogramme BIPARAMETRIQUE Lasers Détecteurs X-Mean Y-Mean 0.42 24.5 0.42 7.7 27.7 26.8 0.45 1.8 Plate-forme de Cytométrie en Flux I.J.M Informatique Plate-forme de Cytométrie en Flux